應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒定中藥材酸棗仁＊

任 莉，陳新連，石林春，辛天怡，龐曉慧

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒定中藥材酸棗仁＊

任 莉，陳新連，石林春，辛天怡，龐曉慧＊＊

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193）

目的：利用DNA條形碼鑒定技術(shù)對(duì)中藥材酸棗仁及其混偽品進(jìn)行分子鑒定。方法：對(duì)研究材料進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增和雙向測(cè)序，利用CodonCode Aligner拼接后，將所得序列轉(zhuǎn)換為彩色條形碼圖片及二維DNA條形碼。用軟件MEGA進(jìn)行遺傳距離分析，構(gòu)建NJ（鄰接）樹(shù)。結(jié)果：酸棗仁基原植物酸棗的ITS2序列種內(nèi)遺傳距離為0-0.009，遠(yuǎn)小于其與混偽品的種間遺傳距離（0.084-0.190）；由所構(gòu)建的NJ樹(shù)可以看出，酸棗不同來(lái)源的樣本聚在一起，表現(xiàn)出單系性。結(jié)論： ITS2 條形碼能夠有效地鑒別酸棗仁藥材與其混偽品，為保障其用藥安全提供新的技術(shù)手段。同時(shí)，專屬二維DNA條形碼可以跨平臺(tái)快速獲取酸棗仁的DNA條形碼信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)該藥材市場(chǎng)流通的數(shù)字化監(jiān)控。

酸棗仁 ITS2 分子鑒定 二維碼 DNA條形碼

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟種子，其性平，味甘、酸，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗、生津的功效，臨床用于治療多種類型失眠癥和神經(jīng)衰弱[1，2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：酸棗仁具有抗焦慮、抗抑郁、抗衰老等作用，還能降血脂及防治動(dòng)脈硬化[3-6]。近年來(lái)，隨著對(duì)酸棗仁藥理作用研究的深入，其臨床應(yīng)用更加廣泛，市場(chǎng)需求量增大，其藥材混偽現(xiàn)象日益嚴(yán)重。最常見(jiàn)混偽品有其同屬植物滇刺棗Ziziphus mauritiana Lamarck的種子理?xiàng)椚始巴浦参锉辫讞篐ovenia dulcis Thunb. 的種子枳椇子[7]。理?xiàng)椚蕿樵颇系貐^(qū)習(xí)用品，其他各地不用，不應(yīng)做酸棗仁藥用；枳椇子為少常用中藥，是止咳除煩、清濕熱解酒毒的藥材，與酸棗仁功效用途不同，三者若區(qū)分不清將會(huì)嚴(yán)重影響酸棗仁的藥材質(zhì)量[8]。因此，為確保藥材質(zhì)量以及臨床用藥安全有效，準(zhǔn)確鑒別酸棗仁及其混偽品十分必要。

目前，已有研究對(duì)酸棗仁的性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜、紫外、紅外、RAPD分析和FTIR指紋圖譜等進(jìn)行了報(bào)道[9-13]。DNA 條形碼鑒定技術(shù)在酸棗仁鑒定方面尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。由于該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已成為近年來(lái)生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)[14-21]。其中，以ITS2為主，psbA-trnH為輔的藥用植物條形碼鑒定體系一經(jīng)提出便得到廣泛關(guān)注與認(rèn)可，現(xiàn)已納入《中國(guó)藥典》[22-27]。郭力城等[28]利用ITS2條形碼對(duì)中藥材金沸草、旋覆花及其近緣混偽品進(jìn)行了鑒定研究，發(fā)現(xiàn)ITS2條形碼可有效鑒別多基原藥材金沸草和旋覆花及其同屬近緣混偽品。趙莎等[29]選用ITS2條形碼對(duì)五加皮進(jìn)行鑒定研究，發(fā)現(xiàn)ITS2條形碼可對(duì)五加皮進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。于俊林等[30]研究了ITS2條形碼對(duì)柴胡藥材鑒定的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明ITS2條形碼可準(zhǔn)確、穩(wěn)定地鑒定柴胡。為了解決酸棗仁藥材的真?zhèn)舞b別問(wèn)題，本研究首次采用ITS2條形碼對(duì)酸棗仁藥材及其混偽品進(jìn)行分子鑒定，以期為該藥材的準(zhǔn)確鑒定和安全用藥提供參考。

1 材料

本研究共收集31份實(shí)驗(yàn)材料，其中酸棗仁樣品29份，包含藥材樣品26份，原植物樣品3份；其混偽品樣品2份，包含枳椇1份，理?xiàng)椚仕幉?份。以上所有樣品均經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，憑證樣本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。另外，從GenBank下載1條北枳椇的序列，樣品信息詳見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

將酸棗種子切成小塊，稱取20-40 mg，用DNA提取研磨儀（Retsch MM400，德國(guó)）研磨2 min （30 次/s）后，采用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.， 中國(guó)）提取總DNA。PCR反應(yīng)體積25 μL，PCR反應(yīng)體系、ITS2通用引物以及擴(kuò)增程序參照“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則”[23]。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用ABI3730XL 測(cè)序儀（Applied Biosystems Co.，美國(guó)）進(jìn)行雙向測(cè)序。

2.2 數(shù)據(jù)處理

利用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.，美國(guó)）校對(duì)拼接測(cè)序峰圖，并去除其引物區(qū)。將所獲序列及GenBank下載序列采用HMMer注釋方法去除兩端5.8 S 和28 S 區(qū)段獲得ITS2序列[31]。將所得ITS2序列用MEGA5.1分析比對(duì)， 確定不同單倍型[32]。將各藥材ITS2序列基于本課題組編寫的代碼轉(zhuǎn)換為彩色條形碼圖片，并基于開(kāi)源代碼PHP QR Code 編碼方式對(duì)所得ITS2序列及相應(yīng)物種拉丁名進(jìn)行編碼，將該序列轉(zhuǎn)為二維碼圖片[33]。基于K2P 模型進(jìn)行遺傳距離分析， 用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹(shù)。

表1 樣本信息

3 結(jié)果

3.1 酸棗仁種內(nèi)變異分析

本研究中酸棗共29條ITS2序列長(zhǎng)度均為221 bp，GC含量為68.3%-69.2%。酸棗序列間存在2個(gè)變異位點(diǎn)，分別為88位點(diǎn)C-T變異與94位點(diǎn)A-G變異，分為3種單倍型，種內(nèi)遺傳距離為0-0.009，其主導(dǎo)單倍型序列特征如圖1。

圖1 酸棗仁DNA條形碼及二維DNA條形碼圖片（ATC■G）

圖2 各物種DNA條形碼及二維DNA條形碼圖片（ATC■G）

3.2 酸棗仁及其混偽品種間變異分析

滇刺棗、枳椇以及北枳椇的序列長(zhǎng)度分別為218 bp、215 bp和213 bp，GC含量分別為70.6%、69.3%與69.5%，各物種序列特征如圖2。酸棗與滇刺棗、枳椇、北枳椇間存在較多變異位點(diǎn)，遺傳距離為0.084-0.190，遠(yuǎn)大于酸棗的種內(nèi)遺傳距離。

3.3 酸棗仁的聚類分析

基于ITS2序列構(gòu)建酸棗仁及其混偽品的NJ樹(shù)（圖3），可以看出酸棗單獨(dú)聚為一支，支持率為99%，呈現(xiàn)出明顯的單系性，與其混偽品能夠明顯區(qū)分開(kāi)。由此可見(jiàn)，構(gòu)建NJ樹(shù)法可成功鑒別酸棗仁及其混偽品。

圖3 基于ITS2 序列構(gòu)建的酸棗仁及其混偽品的鄰接（NJ）樹(shù)

4 討論

4.1 酸棗仁的DNA提取

種子類藥材在DNA提取過(guò)程中，往往存在油脂含量高和粉碎困難等問(wèn)題。辛天怡等[33]進(jìn)行中藥材二維DNA條形碼研究時(shí)，去除了研究樣品的果皮、種皮，并將其切成小塊，再加入PVP-40進(jìn)行研磨。凃媛等[34]在提取南北葶藶子DNA時(shí)，用球磨儀以50 次/s研磨2 min，再利用植物DNA提取試劑盒進(jìn)行提取。王俊等[35]提取蒼耳子藥材DNA時(shí)，先將蒼耳子藥材切開(kāi)，再進(jìn)行DNA提取。本研究在進(jìn)行酸棗仁藥材DNA提取時(shí)，先將其切成小塊，再加入樣本量10% 的PVP-40。后續(xù)按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，一般都能成功提取其DNA，PCR產(chǎn)物電泳后條帶單一明亮。

4.2 酸棗仁混偽現(xiàn)象普遍

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，市場(chǎng)中常見(jiàn)酸棗同屬植物滇刺棗的種子理?xiàng)椚始巴浦参锉辫讞旱姆N子枳椇子充當(dāng)酸棗仁出售[7]。本研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁混偽現(xiàn)象確實(shí)較為常見(jiàn)，從各地市場(chǎng)及藥店共收集31份酸棗仁藥材樣品，利用DNA條形碼對(duì)收集的樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有一份樣品（DCZ01）不是酸棗，而是滇刺棗，另有一份鑒定結(jié)果為枳椇（ZJZ01）。文獻(xiàn)報(bào)道枳椇子基原植物為北枳椇，但本研究中所獲得的酸棗仁偽品經(jīng)鑒定為枳椇，經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)枳椇與北枳椇中文名和拉丁名存在混亂現(xiàn)象，因此本文將枳椇也納入酸棗仁混偽品行列進(jìn)行鑒定研究[7，36]。

4.3 酸棗仁二維DNA條形碼

根據(jù)辛天怡[33]等提出的中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系，本研究將所得ITS2條形碼轉(zhuǎn)換為彩色條形碼圖片，形象化展示各藥材DNA條形碼序列。同時(shí)，將所得序列轉(zhuǎn)換為二維碼圖片，此二維碼圖片可被不同移動(dòng)終端的各類二維碼掃描軟件識(shí)讀。因此，在酸棗仁種植、加工、收購(gòu)、零售等各個(gè)環(huán)節(jié)中，均可通過(guò)此鑒定體系為每份藥材提供專屬二維DNA條形碼，以便實(shí)地抽檢與二次核實(shí)，保障正品來(lái)源。由此可見(jiàn)，通過(guò)二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系可以跨平臺(tái)快速獲取中藥材的DNA條形碼信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥材市場(chǎng)流通的數(shù)字化監(jiān)督，為解決中藥材市場(chǎng)混偽問(wèn)題提供新的技術(shù)手段。

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015： 366.

2 馬進(jìn)杰,劉萍,馬百平.酸棗仁化學(xué)成分及其鎮(zhèn)靜催眠作用研究進(jìn)展.國(guó)際藥學(xué)研究雜志, 2011, 38(3)： 206-211．

3 賀一新,趙素霞,崔瑛,等.酸棗仁抗焦慮活性物質(zhì)分析.中藥材, 2010, 33(2)： 229-231.

4 夏寒星.酸棗仁湯抗抑郁實(shí)驗(yàn)研究.浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 34(1)： 52-53.

5 彭智聰,張華年,陳莎,等.酸棗仁對(duì)內(nèi)毒素發(fā)熱小鼠SOD降低的保護(hù)作用.中國(guó)中藥雜志, 1999, 20(6)： 369-370, 384.

6 張雪,丁長(zhǎng)河,李和平.酸棗仁的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展.食品工業(yè)科技, 2009, 30(3)： 348-350.

7 劉建,哈里木拉提.酸棗仁的性狀鑒別.中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2008, 10(2)： 44, 49.

8 李同芬.酸棗仁與理?xiàng)椚?、枳椇子的紫外法鑒別.中藥材, 1987, 4：30-31.

9 帥智翠,岳林峰,張惠珍,等.酸棗仁滇棗仁和枳椇子光譜鑒別.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 1999, 10(8)： 594-595.

10 劉萍,古今,周文斌,等.酸棗仁與其混淆品及偽品的RAPD分析.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 22(1)： 67-70.

11 白武龍,包光華,劉書賢,等.酸棗仁及其混偽品的紫外光譜鑒別.中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志, 1995, 17： 27-28.

12 陳俊明.酸棗仁及3種偽品的鑒別.海峽藥學(xué), 2005, 17(4)： 104-105.

13 李彥文,周鳳琴,王麗萍,等.酸棗仁與其偽品滇棗仁的FTIR指紋圖譜鑒別.中醫(yī)藥學(xué)刊, 2005, 23(4)： 713-714.

14 Chen S L, Pang X H, Song J Y, et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnol Adv, 2014, 32(7)：1237-1244.

15 Li X W, Yang Y, Henry R J, et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biol Rev Camb Philos Soc, 2015, 90(1)： 157-166.

16 Xin T Y, Li X J, Yao H, et al. Survey of commercial Rhodiola products revealed species diversity and potential safety issues. Sci Rep, 2015, 5：8337.

17 Chen X C, Liao B S, Song J Y, et al. A fast SNP identification and analysis of intraspecific variation in the medicinal Panax species based on DNA barcoding. Gene, 2013, 530(1)： 39-43.

18 Wu L, Sun W, Wang B, et al. An integrated system for identifying the hidden assassins in traditional medicines containing aristolochic acids. Sci Rep, 2015, 5： 11318.

19 Hou D Y, Song J Y, Shi L C, et al. Stability and accuracy assessment of identification of traditional Chinese materia medica using DNA barcoding: a case study on Flos Lonicerae Japonicae. Biomed Res Int, 2013： 549037.

20 陳士林,龐曉慧,羅焜,等.生物資源的DNA 條形碼技術(shù).生命科學(xué), 2013, 25(5)： 458-466．

21 陳士林.中國(guó)藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列.北京:科學(xué)出版社, 2015： 3.

22 辛天怡,姚輝,羅焜,等.羌活藥材ITS /ITS2條形碼鑒定及其穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性研究.藥學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(8)： 1098-1105.

23 陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則.中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(2)： 141-148.

24 趙莎,龐曉慧,宋經(jīng)元,等.應(yīng)用ITS2 條形碼鑒定中藥材合歡皮、合歡花及其混偽品.中國(guó)中藥雜志, 2014, 39(12)： 2164-2168.

25 Chen S L, Yao H, Han J P, et al. Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS ONE, 2010, 5(1)： e8613.

26 Xin T Y, Yao H, Gao H H, et al. Super food Lycium barbarum (Solanaceae) traceability via an internal transcribed spacer 2 barcode. Food Res Int, 2013, 54： 1699-1704.

27 Hou D Y, Song J Y, Yao H, et al. Molecular identification of Corni Fructus and its adulterants by ITS /ITS2 sequences. Chin J Nat Med, 2013, 11(2)： 121-127.

28 郭力城,胡志剛,凃媛,等.基于ITS2 序列鑒定中藥材金沸草、旋覆花及其近緣混偽品.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2014,16(2)：307-312．

29 Zhao S, Chen X C, Song J Y, et al. Internal transcribed spacer2 barcode: a good tool for identifying Acanthopanacis cortex. Front Plant Sci, 2015, 6： 840.

30 于俊林,趙莎,任明波,等. 基于ITS2 條形碼鑒定柴胡與大葉柴胡.中國(guó)中藥雜志,2014, 39(12)： 2160-2163.

31 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430(1-2)： 50-57.

32 Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evol, 2011, 28(10)： 2731-2739.

33 辛天怡,李西文,姚輝,等.中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系研究.中國(guó)科學(xué):生命科學(xué), 2015, 45(7)： 695-702.

34 凃媛,趙博,溫放,等.基于ITS2 序列鑒定南北葶藶子藥材及其混偽品.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2014, 16(3)： 288-294．

35 王俊,劉霞,張雅琴,等.蒼耳子藥材及其混偽品的ITS2條形碼的鑒定研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2014, 16(3)： 329-334．

36 裴小玲.抗高原缺氧中藥新藥枳椇片的研究.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文. 2013： 5.

Identification of Ziziphi Spinosae Semen Using DNA Barcoding Technology

Ren Li, Chen Xinlian, Shi Linchun, Xin Tianyi, Pang Xiaohui
(Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)

This study was aimed to identify Ziziphi Spinosae Semen and its adulterants. DNA of the studied materials was extracted, PCR amplified and bidirectionally sequenced. All sequences were assembled using the CodonCode Aligner. The obtained sequences were transformed into chromatic barcode images and twodimensional DNA barcode. The MEGA software was used in the analysis of genetic distance and the construction of neighbor-joining (NJ) tree. The results showed that the intraspecific genetic distances of internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequences of Ziziphus jujube Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H.F. Chou were from 0 to 0.009, which were much less than the interspecific genetic distances between Z. jujuba var. spinosa and its adulterants (0.084-0.190). The constructed NJ tree showed that samples from different origins of Ziziphi Spinosae Semen clustered into a monophyly clade. It was concluded that ITS2 barcode can effectively identify Ziziphi Spinosae Semen and its adulterants. It provided new technical means to guarantee medication safety. Meanwhile, the exclusive two-dimensional DNA barcode allowed the quick obtaining of cross-platform DNA sequence information for the realization of digital monitoring of this medicine in the market circulation.

Ziziphi Spinosae Semen, ITS2, molecular identification, two-dimensional code, DNA barcoding

10.11842/wst.2016.01.006

R931.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2015-06-16

修回日期：2015-12-07

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81573541）：淫羊藿屬藥用植物超級(jí)條形碼及其分類學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：龐曉慧。

＊＊ 通訊作者：龐曉慧，博士，副研究員，主要研究方向：中藥分子鑒定研究。