王不留行種子的ITS2序列分子鑒定研究＊

馬雙姣，周建國(guó)，金 鉞，趙菊潤(rùn)，姚 輝＊＊

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193；2. 云南龍陵縣石斛研究所 保山 678300）

王不留行種子的ITS2序列分子鑒定研究＊

馬雙姣1，周建國(guó)1，金 鉞1，趙菊潤(rùn)2，姚 輝1＊＊

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193；2. 云南龍陵縣石斛研究所 保山 678300）

目的：基于ITS2 序列對(duì)中藥材王不留行種子及其混偽品進(jìn)行鑒定研究，為王不留行種子及其混偽品的鑒定提供新方法。方法：對(duì)王不留行種子及其混偽品樣品提取基因組DNA、PCR擴(kuò)增、雙向測(cè)序獲得ITS2序列。應(yīng)用MEGA 6.0軟件計(jì)算種內(nèi)、種間遺傳距離，構(gòu)建鄰接樹，基于自行編寫的代碼和開源代碼 PHP QR Code 的編碼方式，將王不留行及其混偽品 ITS2序列轉(zhuǎn)換為條形碼圖片，獲得各物種二維DNA 條形碼圖片，并在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（www.tcmbarcode.cn）對(duì)所獲得ITS2序列進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果：王不留行藥材ITS2序列長(zhǎng)度為219-221 bp，種內(nèi)最大 K2P 遺傳距離為0.009，小于其與混偽品的種間K2P遺傳距離，王不留行及其混偽品ITS2序列間存在的變異位點(diǎn)較多。NJ樹結(jié)果表明王不留行與其混偽品分別聚為一支，可明顯區(qū)分。結(jié)論：ITS2序列可以準(zhǔn)確鑒別王不留行種子，為其種質(zhì)資源鑒定和中藥材種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了新方法，將獲得的ITS2序列轉(zhuǎn)換為二維DNA條形碼可為王不留行藥材流通管理提供便利，為保障王不留行臨床用藥安全提供了新的技術(shù)手段。

王不留行 種子 ITS2鑒定 DNA 條形碼 混偽品

王不留行為石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccaria segetalis （Neck.） Garcke的干燥成熟種子，又名不留行、禁宮花、剪金花和麥藍(lán)子等[1]。王不留行具有活血通經(jīng)、下乳消腫、利尿通淋的功效，用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、乳汁不下、乳癰腫痛、淋證澀痛 等癥[2]。夏季果實(shí)成熟、果皮尚未開裂時(shí)采割植株、曬干、打下種子、除去雜質(zhì)，再曬干。除華南外，全國(guó)各地區(qū)都有分布。王不留行種子含多種環(huán)苷、環(huán)肽和黃酮苷類成分，現(xiàn)代藥理研究表明：王不留行不僅具有促進(jìn)泌乳、抑制新生血管生成、舒張血管平滑肌和抗氧化等作用，其水煎液也具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛效果，臨床用于孕婦產(chǎn)后護(hù)理，防治近視、失眠、便秘、皰疹、小兒厭食等[3-5]。

王不留行以種子入藥，其種子為球形，直徑約2 mm，表面黑色，少數(shù)紅棕色，略有光澤，有細(xì)密顆粒狀突起，一側(cè)有一凹陷的縱溝[2]。與王不留行形態(tài)相似的物種種子有很多，在中藥材流通過程中易混淆，如 十字花科植物蕓苔Brassica campestris L.、豆科植物野豌豆Vicia sepium L.、救荒野豌豆Vicia sativa L.、四籽野豌豆Vicia tetrasperma （L.）Schreber和小巢菜Vicia hirsuta （L.） S. F. Gray[6-8]。目前，對(duì)王不留行種子及其混偽品的鑒別主要集中在性狀、顯微、理化等傳統(tǒng)鑒定方面[3,7,8]。近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和安全性評(píng)價(jià)的需要，DNA條形碼技術(shù)成為生物分類和物種鑒定的研究熱點(diǎn)，它是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補(bǔ)充，是中藥鑒定領(lǐng)域中的革命性突破[9-15]。目前，以ITS2序列為主體的中藥材DNA條形碼分子鑒定方法體系已納入《中國(guó)藥典》2010年版第三增補(bǔ)本[16]。本研究應(yīng)用DNA條形碼序列ITS2對(duì)王不留行及其混偽品種子進(jìn)行鑒定，從種源上保障中藥材王不留行的品質(zhì)，為王不留行藥材的臨床用藥完全和療效有效性提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究涉及王不留行及其混偽品共6個(gè)物種85個(gè)研究對(duì)象，其中包括王不留行基原植物樣本、藥材樣本、復(fù)核樣本、對(duì)照藥材樣本，王不留行混偽品序列下載自GenBank，相關(guān)信息詳見表1。樣品均經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，復(fù)核樣本由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所進(jìn)行復(fù)核，對(duì)照藥材（編號(hào)：FDC364）來自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

將實(shí)驗(yàn)樣品用 75% 酒精棉擦拭干凈后，種子取單粒，葉片樣品取變色硅膠干燥葉片約20 mg，用研磨儀（Retsch MM400，德國(guó)）研磨2 min（30 次/秒），加入700 μL核分離液7 500 rpm 離心5 min后棄上清，用植物 DNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech Co., China）提取總 DNA，65℃水浴3 h，其余步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行[17]。ITS2 通用引物S2F：5'-ATG CGATACTTGGTGTGAAT-3'和S3R：5'-GACGCTT CTCCAGACTACAAT-3'。反應(yīng)條件為94℃（5 min）；94℃（30 s），56℃（30 s），72℃（45 s），40個(gè)循環(huán)；72℃（10 min）。PCR反應(yīng)體系為2×Taq Mix Master 12.5 μL、正反向引物各1.0 μL（2.5 μM）、總DNA 2 μL（約30 ng），其余用ddH2O補(bǔ)至25 μL[18]。電泳查看PCR擴(kuò)增情況，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品信息表

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

去除測(cè)序峰圖低質(zhì)量區(qū)域、去除引物序列，對(duì)雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，去除5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)段獲得ITS2序列[19]。利用軟件MEGA 6.0[20]（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）進(jìn)行序列比對(duì)、變異位點(diǎn)分析，并基于Kimura 2-parameter （K2P）模型進(jìn)行遺傳距離等分析。利用鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，利用Bootstrap（1 000 次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。基于本課題組自行編寫的代碼，將ITS2序列轉(zhuǎn)換為彩色條形碼圖片，然后基于開源代碼 PHP QR Code 的編碼方式將基原物種拉丁名和ITS2 序列進(jìn)行編碼，獲得各物種二維 DNA條形碼圖片[17,21]。將掃描識(shí)讀出的二維碼信息通過移動(dòng)終端上的網(wǎng)頁瀏覽器提交至中藥材 DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)（www.tcmbarcode.cn）進(jìn)行物種鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 王不留行種子及其混偽品 ITS2 序列特征

本研究比較了59條王不留行ITS2序列，序列長(zhǎng)度為219-221 bp，GC含量56.6%，有2個(gè)變異位點(diǎn)。有2種單倍型，其中單倍型A1以YC0191MT02序列為主導(dǎo)單倍型，有57條，均為王不留行實(shí)驗(yàn)樣品，單倍型A2（包括X83847、X86896），在199位點(diǎn)為T-C 變異，201位點(diǎn)為C-T 變異，另有2處插入或缺失，分別在38、203-205位點(diǎn)。

王不留行與各混偽品種間序列進(jìn)行比對(duì)后長(zhǎng)度為251 bp，混偽品中GC含量最高的是蕓苔，為52.6%，GC含量最低的是野豌豆，為46.1%。應(yīng)用MEGA 6.0進(jìn)行分析，以K2P計(jì)算遺傳距離，王不留行的種內(nèi)K2P距離為 0-0.009，平均K2P距離為0.000 3。王不留行與其混偽品ITS2序列間存在的變異位點(diǎn)較多，為75-101個(gè)，種間最小K2P距離為0.505，遠(yuǎn)大于種內(nèi)最大K2P距離（0.009），變異位點(diǎn)數(shù)及種間K2P遺傳距離見表2。盡管王不留行種子與其混偽品種子在形態(tài)上相似，但由于它們來自不同的科屬，DNA序列差異大。因此應(yīng)用 ITS2 序列可以很容易將王不留行種子及其混偽品的種子進(jìn)行區(qū)分。

2.2 王不留行及其混偽品系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過基于 ITS2 序列（單倍型）構(gòu)建的王不留行實(shí)驗(yàn)樣本及其混偽品ITS2序列的NJ系統(tǒng)聚類樹可以看出（如圖1），王不留行與其混偽品蕓苔、救荒野豌豆、四籽野豌豆、小巢菜以及野豌豆各自聚為一支，能夠明顯區(qū)分開。因此，ITS2序列作為條形碼可準(zhǔn)確鑒別王不留行基原和其混偽品蕓苔、救荒野豌豆、四籽野豌豆、小巢菜以及野豌豆。

表2 種內(nèi)種間K2P距離計(jì)算結(jié)果

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建的王不留行與其混偽品的NJ樹（拉丁名后為單倍型編號(hào)）

圖2 王不留行ITS2序列利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)進(jìn)行BLAST分析的結(jié)果

2.3 利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)和NCBI進(jìn)行BLAST分析

在中藥材 DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)（www.tcmbarcode. cn），點(diǎn)擊物種鑒定項(xiàng)下植物類藥材鑒定（ITS2），將單倍型序列粘貼到鑒定框中，點(diǎn)擊提交，查詢。結(jié)果顯示：與單倍型A1與A2序列相似度最高的物種均為王不留行V. segetalis，在NCBI中BLAST結(jié)果顯示，與單倍型A1與A2序列相似度最高的物種均為王不留行V. hispanica（NCBI taxonomy中V. segetalis為該拉丁名的異名），這表明單倍型A1、A2均為2010版《中國(guó)藥典》王不留行正品基原。

2.4 王不留行及其混偽品ITS2序列二維DNA條形碼

基于本課題組自行編寫的代碼，將王不留行及其混偽品ITS2序列轉(zhuǎn)換為彩色條形碼圖片，然后基于開源代碼PHP QR Code的編碼方式將王不留行及其混偽品基原物種拉丁名和ITS2 序列進(jìn)行編碼，獲得各藥材二維 DNA 條形碼圖片。圖2所示為由王不留行及其混偽品 ITS2序列轉(zhuǎn)成的彩色條形碼圖片，包含王不留行及其混偽品 DNA條形碼序列信息，以不同顏色分別表示不同核苷酸，右側(cè)部分為物種拉丁名和DNA序列轉(zhuǎn)成的二維碼圖片。利用移動(dòng)終端（如Android 手機(jī)、iPhone 等）的多種二維碼掃描軟件可以識(shí)讀獲得各物種拉丁名及ITS2序列[17,21]。

圖3 王不留行DNA 條形碼及二維碼 DNA 條形碼圖片（■A■T■C■G）

3 討論

3.1 王不留行及其混偽品樣品DNA提取方法的改良

獲得高質(zhì)量的DNA是中藥材DNA條形碼鑒定的關(guān)鍵。王不留行及其混偽品的種子含有大量的油脂類、酚類和多糖類物質(zhì)，為了獲得高質(zhì)量的DNA，本研究中在經(jīng)典試劑盒法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，一是為了消除多糖、多酚類物質(zhì)對(duì)DNA的干擾，本研究試驗(yàn)中，在樣品粉碎前加入相當(dāng)于藥材量5%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），粉碎后加入核分離液 700 μL漂洗2到3次，它們可以與多酚結(jié)合形成不溶的絡(luò)合物，有效去除多酚，同時(shí)還可以和多糖結(jié)合，去除多糖，減少DNA提取過程中多糖類物質(zhì)的污染；二是適當(dāng)延長(zhǎng)水浴裂解時(shí)間，試驗(yàn)中65℃水浴了3 h，使細(xì)胞充分裂解，提高DNA提取效率[18,21]。

3.2 DNA條形碼鑒定技術(shù)可準(zhǔn)確鑒定王不留行基原植物、藥材、種子及其混偽品

本研究對(duì)王不留行基原植物、藥材及種子樣品進(jìn)行DNA條形碼鑒定，并由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所進(jìn)行復(fù)核，利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)對(duì)獲得的ITS2序列進(jìn)行BLAST鑒定，本研究所得實(shí)驗(yàn)序列與中藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)中王不留行序列相似度均為100%。因此，DNA條形碼能準(zhǔn)確鑒定物種基原。王不留行與其混偽品蕓苔、救荒野豌豆、四籽野豌豆、小巢菜以及野豌豆來源于不同科屬，植物形態(tài)差別較大，但它們的種子形態(tài)相似，形態(tài)鑒定難度較大。應(yīng)用 DNA 條形碼技術(shù)對(duì)王不留行及其混偽品的 ITS2序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)王不留行與其混偽品的 ITS2序列之間的差異大，K2P距離和NJ樹均可以區(qū)分王不留行與其混偽品。因此，ITS2序列作為條形碼可準(zhǔn)確鑒別王不留行藥材及其混偽品。

3.3 為中藥材種質(zhì)資源鑒定提供了新方法，對(duì)中藥材種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)

“國(guó)以農(nóng)為本，農(nóng)以種為先”，種子是中藥材產(chǎn)業(yè)鏈的起點(diǎn)，是藥材生產(chǎn)的最基本、最重要的生產(chǎn)資料。中藥材種子種苗質(zhì)量的穩(wěn)定與否直接影響藥材的質(zhì)量穩(wěn)定性，而藥材質(zhì)量又是中藥質(zhì)量的基礎(chǔ)。目前，中國(guó)中藥材種子種苗標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)較薄弱，中藥材種子、種苗標(biāo)準(zhǔn)化工作滯后，制約了中藥現(xiàn)代化的推進(jìn)。實(shí)施中藥現(xiàn)代化，沒有中藥材種子種苗的標(biāo)準(zhǔn)化是不現(xiàn)實(shí)的[23-26]。目前對(duì)王不留行的種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要集中在測(cè)定其凈度、千粒重、水分、發(fā)芽率及真實(shí)性等指標(biāo)，而對(duì)于其真實(shí)性檢測(cè)主要是觀察種子形態(tài)、大小、色澤以及表面特征等[27-29]。DNA 條形碼鑒定技術(shù)對(duì)形態(tài)鑒定難以區(qū)分、生物性狀極為相似的近緣種具有方法通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、鑒定結(jié)果可重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)。近年來，DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用中藥鑒定學(xué)、系統(tǒng)分類學(xué)、發(fā)育進(jìn)化、生態(tài)學(xué)、生物多樣性保護(hù)等各個(gè)領(lǐng)域中[30，31]。本研究是應(yīng)用 DNA 條形碼技術(shù)對(duì)中藥材王不留行種子進(jìn)行鑒定，為中藥材種子鑒定提供了一種新方法，對(duì)推動(dòng)中藥材種子種苗標(biāo)準(zhǔn)鑒定體系的建立，保障中藥材質(zhì)量和促進(jìn)中醫(yī)藥的發(fā)展提供技術(shù)支撐。

致謝

本研究中王不留行樣品均經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，復(fù)核樣本由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所進(jìn)行復(fù)核，在此感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員和中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所的老師！

1 鄭劍峰,王育紅.中藥王不留行的研究進(jìn)展.電大理工, 2012, 2：9-10.

2 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010： 49-50.

3 魏薇.中藥王不留行的研究進(jìn)展.中國(guó)醫(yī)藥指南, 2014, 12(16)： 87-88.

4 黨曉芬.王不留行抗炎、鎮(zhèn)痛活性部位篩選及其作用機(jī)制研究.陜西師范大學(xué)碩士學(xué)位論文, 2014： 1-4.

5 李楠, 高學(xué)軍,關(guān)力.中藥王不留行對(duì)奶牛乳腺細(xì)胞增殖及泌乳的影響.中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2011, 38(6)： 45-48.

6 陳士林.中藥 DNA 條形碼分子鑒定.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2012： 150-151.

7 何玲.王不留行及其混淆品的等電聚焦電泳鑒定方法.天津藥學(xué), 1999, 11(4)： 52-53.

8 謝曉燕.淺述王不留行的鑒別.中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育, 2012, 10(24)： 101-102.

9 Chen S L, Pang X H, Song J Y, et al. A renaissance in herbal medicine identification: From morphology to DNA. Biotechnol Adv, 2014, 32(7)：1237-1244.

10 石林春,宋經(jīng)元,陳士林,等.豆蔻屬藥用植物DNA條形碼鑒定研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2010, 12(3)： 473-479.

11 Yao H, Song J Y, Liu C, et al. Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals. PLoS One, 2010, 5(10)： e13102.

12 Yang P, Li X W, Zhou H, et al. Molecular Identification of Chinese Materia Medica and Its Adulterants Using ITS2 and psbA-trnH Barcodes: A Case Study on Rhizoma Menispermi. Chinese Med, 2014, 5： 190-198.

13 Xin T, Li X, Yao H, et al. Survey of commercial Rhodiola products revealed species diversity and potential safety issues. Sci Rep, 2015, 5: 8337.

14 趙莎,辛 天怡,侯典云,等.黨參藥材及其混偽品的ITS/ITS2條形碼鑒定研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2013, 15(3)： 421-428. 15 Yao H, Song J Y, Ma X Y, et al. Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence: the chloroplast psbA-trnH intergenic region. Planta Med, 2009, 75(6)： 667-669.

16 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(第三增補(bǔ)本).北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2014, 92-94.

17 陳士林.中國(guó)藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列.北京:科學(xué)出版社, 2015： 18-19.

18 陳士林,姚輝,韓建萍,等.中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則.中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(2)： 141-148.

19 Keller A, Schleicher T, Schultz J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430(1-2)： 50-57.

20 Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 2013, 30(12)： 2725-2729.

21 辛天怡,李西文,姚輝,等.中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系研究.中國(guó)科學(xué):生命科學(xué), 2015, 45(7)： 695-702.

22 李金璐,王碩,于婧,等.一種改良的植物DNA提取方法.植物學(xué)報(bào), 2013, 48(1)： 72-78.

23 李曉.中藥材市場(chǎng)的現(xiàn)狀和中藥材質(zhì)量問題.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥, 2011, 18(13)： 133, 147.

24 趙文吉,李敏,黃博,等.中藥材種子種苗市場(chǎng)現(xiàn)狀及對(duì)策探討.中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2012, 14(3)： 5-8.

25 李隆云,彭銳,李紅莉,等.中藥材種子種苗的發(fā)展策略.中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(2)： 247-252.

26 魏建和,陳士林,程惠珍,等.中藥材種子種苗標(biāo)準(zhǔn)化工程.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2005, 7(6)： 104-108.

27 高欽,楊太新,劉曉清,等.王不留行種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法的研究.種子, 2014, 33(10)： 116-120.

28 高欽,楊太新,劉曉清.王不留行種子質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究.種子, 2015, 34(2)： 107-110.

29 高曉娟,權(quán)洪峰,姬文凱,等.王不留行種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立.今日科苑, 2008, 18： 156.

30 裴男才,陳步峰.生物DNA條形碼:十年發(fā)展歷程,研究尺度和功能.生物多樣性, 2013, 21(5)： 616-627.

31 辛天怡,雷美艷,宋經(jīng)元.中藥材DN A條形碼鑒定研究進(jìn)展.中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2015, 17(2)： 170-176, 184.

Ma Shuangjiao1, Zhou Jianguo1, Jin Yue1, Zhao Jurun2, Yao Hui1

(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Longling County Research Institute of Dendrobium, Yunnan 678300, China)

Identification of Seeds of Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke Based on ITS2 Sequence

This study was aimed to explore a new method to identify the seeds of Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke from its adulterants by the internal transcribed spacer 2 (ITS2) regions. In this study, all genomic DNAs of samples of V. segetalis and its adulterants were extracted. And then, the ITS2 sequences were PCR amplified and sequenced bidirectionally. The intraspecific and interspecific genetic distances were calculated by the MEGA 6.0 software for the construction of neighbor-joining (NJ) tree. Based on self written code and open source PHP QR Code coding way, the ITS2 sequences of V. segetalis and its adulterants were transferred into the two-dimensional barcoding images, which can be used in the analysis and identification in the Traditional Chinese Medicine (TCM) DNA barcoding species identification system (www.tcmbarcode.cn). The results showed that the sequence lengths of ITS2 regions of V. segetalis were ranged from 219 to 221 bp. The largest intraspecific K2P genetic distance was 0.009, which was smaller than the interspecific K2P genetic distance compared to its adulterants. There were many variation sites of ITS2 sequences between V. segetalis and its adulterants. The NJ tree showed that V. segetalis and its adulterants can be easily differentiated according to their monophyly. It was concluded that the ITS2 sequences could be used to identify V. segetalis and its adulterants, which not only provided a new method for the identification of germplasm resources of TCM, but also supplied some guidelines for the establishment of the quality standards of Chinese herbal seeds and seedlings. To transfer the two-dimensional DNA barcoding image of the obtained ITS2 sequences of V. segetalis were convenient for its circulation management. It provided new technical means for the clinical medication safety of V. segetalis.

Vaccaria segetalis, seed, ITS2 identification, DNA barcoding, adulterant

10.11842/wst.2016.01.005

R931.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2015-06-16

修回日期：2015-12-01

＊ 科學(xué)技術(shù)部國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAI07B08）：中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系建立及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)示范研究子課題——中藥種子種苗 DNA條形碼鑒定及流通管理平臺(tái)的建立，負(fù)責(zé)人：陳士林；科學(xué)技術(shù)部國(guó)家科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2014FY130400）：長(zhǎng)白山區(qū)藥用植物資源考察與DNA條形碼數(shù)據(jù)采集，負(fù)責(zé)人：孫超。

＊＊ 通訊作者：姚輝，副研究員，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥資源與分子鑒定。