基于中藥材DNA條形碼系統(tǒng)的澤瀉種子鑒別研究＊

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210046）

張娜娜1，辛天怡1，金 鉞1，谷 巍2，宋經(jīng)元1＊＊

Zhang Nana1, Xin Tianyi1, Jin Yue1, Gu Wei2, Song Jingyuan1

(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

基于中藥材DNA條形碼系統(tǒng)的澤瀉種子鑒別研究＊

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210046）

張娜娜1，辛天怡1，金 鉞1，谷 巍2，宋經(jīng)元1＊＊

目的：以澤瀉種子為研究對(duì)象，利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)區(qū)分不同產(chǎn)地澤瀉的基原物種。方法：采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，擴(kuò)增核內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2序列并進(jìn)行測(cè)序。利用軟件CodonCode Aligner 6.0.2和MEGA 5.1對(duì)序列進(jìn)行拼接，并用體式顯微鏡觀察記錄種子外觀形態(tài)特征。結(jié)果：澤瀉Alisma plantago-aquatica和東方澤瀉Alisma orientale種子外觀形態(tài)相似；兩個(gè)物種的ITS2序列長(zhǎng)度均為311 bp，GC含量為56.9%，ITS2序列在165 bp處存在T-A變異。該鑒定結(jié)果顯示，20份四川產(chǎn)澤瀉種子樣本序列為澤瀉A. plantago-aquatica，其他產(chǎn)區(qū)36份樣本均為東方澤瀉A. orientale。結(jié)論：中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)可為選擇正確基原的澤瀉種質(zhì)提供指導(dǎo)，該系統(tǒng)在澤瀉人工栽培生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，可為其他中藥材種子鑒定提供示范。

DNA條形碼 澤瀉 東方澤瀉 種子鑒定 ITS2

常用中藥澤瀉主要含有四環(huán)三萜類化合物、揮發(fā)油、生物堿、天冬素、植物甾醇、脂肪酸、氨基酸等多種成分，性甘、淡、寒，歸腎、膀胱經(jīng)，具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂、利尿、降血壓、抗脂肪肝的作用[1-4]。一般來(lái)說(shuō)，澤瀉商品藥材包括澤瀉Alisma plantago-aquatica和東方澤瀉Alisma orientale，目前對(duì)兩個(gè)物種并未進(jìn)行明確的區(qū)分[5]。兩者中文名稱也比較混亂，《中國(guó)藥典》規(guī)定澤瀉藥材為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale（Sam.）Juzep.的干燥塊莖，在《中草藥大典》中也有相似記載[1，6]。但《中國(guó)植物志》對(duì)兩個(gè)物種中文名稱分別記載為澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale[7]。本文中的澤瀉藥材為廣義上各類澤瀉藥材的統(tǒng)稱，其基原包括：澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale兩個(gè)物種。澤瀉藥材栽培產(chǎn)區(qū)主要分布于四川、福建、江西等地，通常分為建澤瀉、川澤瀉和江澤瀉，其中建澤瀉和川澤瀉分布較廣泛[8]。不同產(chǎn)地不同種質(zhì)的澤瀉藥材其微量元素、氨基酸及澤瀉醇等成分的含量存在差異[9]。目前，澤瀉科植物的常規(guī)分類方法主要依賴于其植物的形態(tài)和生理特性，鑒別難度較大。近年來(lái)，分子鑒定技術(shù)逐漸受到藥材鑒定人員的廣泛關(guān)注，如黃瓊林等[10]從GenBank下載澤瀉科植物序列 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)核內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS2序列對(duì)澤瀉科植物有較好區(qū)分作用；馬曉沖等[11]以澤瀉塊莖和葉片為材料對(duì)此進(jìn)行研究和驗(yàn)證。但到目前為止，對(duì)澤瀉種子的鑒別研究尚未見報(bào)道。澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale兩者的成熟種子外觀差別很小，傳統(tǒng)的性狀鑒別難以區(qū)分，在藥材生產(chǎn)加工和臨床應(yīng)用中極易出現(xiàn)品種混雜現(xiàn)象，影響澤瀉的藥材品質(zhì)和臨床療效。

藥用植物資源是中藥材生產(chǎn)的源頭，種質(zhì)影響藥材的最終質(zhì)量，選擇正確種源對(duì)中藥育種和資源保護(hù)具有重要意義[12]。然而，在藥材栽培的實(shí)際生產(chǎn)中，種質(zhì)混雜現(xiàn)象十分嚴(yán)重，例如川牛膝，由于其種子量不足，部分不良商家將麻牛膝混入川牛膝種子中，使藥材原植物發(fā)生天然雜交，致使藥材品質(zhì)的退化[13]。再如半夏種莖中經(jīng)常夾雜天南星、虎掌半夏，由于三者性狀差異較小，肉眼難以準(zhǔn)確識(shí)別，只能待植株長(zhǎng)到一定高度才能辨別[12]。另外，由于植物性狀的相似性，一些細(xì)小種子（如菟絲子、沙苑子、地膚子、天仙子等）也經(jīng)常被混淆[14]。因此，尋找一種適用于種質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定方法成為解決以上問(wèn)題的關(guān)鍵。

藥用植物DNA條形碼鑒定技術(shù)從基因?qū)用娼鉀Q了藥材品種鑒別問(wèn)題。近年來(lái)，該技術(shù)得到了迅速發(fā)展，與二維碼技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用使該方法的應(yīng)用更加便捷和廣泛[15，16]。大量實(shí)驗(yàn)研究證明，該鑒定方法具有穩(wěn)定性和可靠性，成為傳統(tǒng)鑒定的一個(gè)有力補(bǔ)充，為中藥材的鑒定工作提供了科學(xué)指導(dǎo)[17]。該技術(shù)通過(guò)核基因組中一段特定的DNA序列，以中草藥DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)為依據(jù)，對(duì)不同的物種進(jìn)行區(qū)分，為解決中草藥的品種考證和中藥材常見混偽品問(wèn)題奠定技術(shù)基礎(chǔ)[15，17]。為區(qū)分不同產(chǎn)地澤瀉的基原物種，本研究通過(guò)DNA條形碼技術(shù)，以ITS2序列對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)區(qū)的澤瀉種子進(jìn)行鑒定研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究共收集澤瀉種子樣品56份。其中，20份分別來(lái)自四川主產(chǎn)區(qū)眉山市彭山縣義和鎮(zhèn)、謝家鎮(zhèn)、公義鎮(zhèn)、鳳鳴鎮(zhèn)和白馬鎮(zhèn)；8份收集自澤瀉主要種植栽培區(qū)福建省建甌市；13份樣品來(lái)自江西省撫州市廣昌縣；在云南省紅河州（紅河哈尼族彝族自治州）、江蘇省南京市和北京市共收集到樣品15份。采集過(guò)程中，由當(dāng)?shù)胤N植人員提供樣品（名稱均為澤瀉）。對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行統(tǒng)一編號(hào)，樣品具體信息見表1。

2 實(shí)驗(yàn)方法

利用體式顯微鏡（SZX9）觀察種子的形態(tài)特征并拍照記錄。用酒精棉擦拭藥匙，取澤瀉種子約20 mg（大約20粒），用MM400混合型碾磨儀（Retsch Co.，德國(guó)）30次/s研磨2 min，采用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取總DNA。本研究的操作步驟依照該試劑盒說(shuō)明書并做了適當(dāng)修改：（1）65℃水浴4 h，水浴過(guò)程中注意顛倒混勻數(shù)次；（2）以預(yù)冷的異丙醇替代緩沖液GP2，取500 μL加入上清液中后顛倒混勻，-20℃放置20 min；（3）用100 μL滅菌雙蒸水洗脫DNA[15]。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行雙向測(cè)序，PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)條件參照馬曉沖等的研究[11]。

3 數(shù)據(jù)處理

利用CodonCode Aligner 6.0.2對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量區(qū)。利用隱馬爾可夫模型HMMer對(duì)拼接好的序列進(jìn)行5.8S和28S區(qū)域剪切，得到ITS2序列。將所得樣品ITS2序列在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http://www.tcmbarcode.cn/ china/）中進(jìn)行物種鑒定。利用軟件MEGA5.1對(duì)樣本序列進(jìn)行分析，并且根據(jù)K2P模型計(jì)算遺傳距離，確定單倍型，比較種內(nèi)種間變異大小。

表1 樣品采集地信息

4 結(jié)果與分析

4.1 不同產(chǎn)地澤瀉種子分子鑒定結(jié)果和表觀形態(tài)分析

來(lái)自全國(guó)不同產(chǎn)地澤瀉種子樣品，經(jīng)過(guò)ITS2序列比對(duì)分析顯示全部樣品共分為兩個(gè)物種，四川產(chǎn)20份樣本為澤瀉A. plantago-aquatica，其他36份樣本均為《中國(guó)藥典》（2010年版）規(guī)定的基原物種東方澤瀉A. orientale，而種子采集地對(duì)兩個(gè)物種并未進(jìn)行區(qū)分。形態(tài)觀察顯示，單粒種子兩側(cè)扁，先端鈍圓，表面灰黃色，長(zhǎng)約為2 mm，寬約1 mm，背部有1-2淺溝，與文獻(xiàn)描述一致[18]。如圖1所示，澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale種子形態(tài)差異較小，且體積微小，肉眼辨別難度很大。

4.2 不同澤瀉種子峰圖質(zhì)量

DNA樣品為來(lái)自約20粒種子的混合模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序，澤瀉A. plantago-aquatica和東方澤瀉A. orientale樣品ITS2序列峰圖質(zhì)量很高，無(wú)套峰出現(xiàn)。56次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示圖譜均如圖2所示，標(biāo)志著兩個(gè)物種內(nèi)部無(wú)變異，遺傳穩(wěn)定。

4.3 ITS2序列特征和種間種內(nèi)變異分析

澤瀉A. plantago-aquatica種子樣本ITS2序列長(zhǎng)度為311 bp，GC含量為56.9%，東方澤瀉A. orientaleITS2序列長(zhǎng)度和GC含量與其相同。兩個(gè)物種序列在第165個(gè)堿基處存在A-T變異，來(lái)自四川產(chǎn)區(qū)的澤瀉A. plantago-aquatica樣本序列表現(xiàn)為T，其他產(chǎn)區(qū)東方澤瀉A. orientale測(cè)定結(jié)果為A?；贙2P模型計(jì)算遺傳距離，東方澤瀉A. orientale種內(nèi)平均K2P為0，澤瀉A. plantago-aquatica種內(nèi)平均K2P為0，種間遺傳距離為0.003 2，成功區(qū)分兩個(gè)物種。此結(jié)果說(shuō)明：DNA提取所用的20粒種子混合樣品，測(cè)序峰圖質(zhì)量很好，無(wú)其他變異。

圖1 體式顯微鏡下種子的形態(tài)特征

5 討論

5.1 澤瀉種子DNA提取、PCR以及測(cè)序

種子類實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞壁較難分解[14，19]。因此，與葉片類相比，澤瀉種子樣品加裂解液GP1后的水浴時(shí)間需要延長(zhǎng)為4 h。參考文獻(xiàn)[20]的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增以及測(cè)序按照種子類藥材DNA條形碼鑒定，提取過(guò)程中未出現(xiàn)疑難點(diǎn)。因?yàn)槲锓N內(nèi)部可能存在高水平的種內(nèi)遺傳多態(tài)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能存在多模板干擾，研究者曾在唐古特大黃Rheum tanguticum中發(fā)現(xiàn)在ITS2序列500-550 bp處存在高頻率堿基顛倒現(xiàn)象[21]。本研究取樣時(shí)多個(gè)體同時(shí)進(jìn)行DNA提取，分析結(jié)果顯示峰圖質(zhì)量很好，未出現(xiàn)套峰、亂峰現(xiàn)象，這證實(shí)澤瀉基因組內(nèi)的ITS2主導(dǎo)變異占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，這與人參等物種的情況一致[22]。多批次樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ITS2序列對(duì)澤瀉種子的鑒定具有重復(fù)性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)。

5.2 DNA條形碼對(duì)澤瀉種子及中藥材種子種苗鑒定的意義

圖2 澤瀉種子的高質(zhì)量ITS2序列峰圖

種質(zhì)的優(yōu)劣決定中藥的產(chǎn)量和質(zhì)量，種質(zhì)鑒定是確定藥材基原植物，確保藥效和合理利用種質(zhì)資源的基礎(chǔ)[23]。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法在種質(zhì)表觀形態(tài)差別較小的情況下，鑒定難度較大，易出現(xiàn)偏差。而從分子生物學(xué)角度，即基因?qū)用孢M(jìn)行研究，比較DNA序列上的差異，不受樣品形態(tài)限制，減少了人為主觀因素影響，使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確。理想的DNA條形碼要有足夠的種間變異和較小的種內(nèi)變異[24，25]。黃瓊林等[10]通過(guò)對(duì)GenBank中澤瀉科植物澤瀉屬、毛茛澤瀉屬、澤薹草屬、慈姑屬4個(gè)屬鑒定序列的適用性篩選發(fā)現(xiàn)，在ITS2、rbcL、matK3個(gè)候選序列中，rbcL和matK序列種間和種內(nèi)變異重疊較多，鑒定效率低，而ITS2序列種間變異程度高，與種內(nèi)變化水平差異顯著，在澤瀉科鑒定中有明顯優(yōu)勢(shì)，其中澤瀉屬研究樣本涵蓋了澤瀉A. plantagoaquatica和東方澤瀉A. orientale兩個(gè)物種。以澤瀉塊莖、葉片為材料，ITS2序列能區(qū)分澤瀉和藥材的混偽品[11]。本研究首次以澤瀉種子樣品為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)2個(gè)物種ITS2序列長(zhǎng)度均為311 bp，同一物種內(nèi)部無(wú)變異現(xiàn)象，種間存在一個(gè)穩(wěn)定變異位點(diǎn)，與馬曉沖等[11]的研究結(jié)果一致，可有效區(qū)分兩個(gè)物種，同時(shí)驗(yàn)證ITS2序列在澤瀉鑒定應(yīng)用的穩(wěn)定性。中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)能夠?yàn)檎_基原澤瀉種質(zhì)的選擇提供強(qiáng)有力指導(dǎo)，在澤瀉人工栽培生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價(jià)值，也為其他中藥材種子種苗鑒定提供了參考。

致謝

感謝南京中醫(yī)藥大學(xué)耿超博士在樣本收集上提供的幫助，感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所瀕危藥材繁育國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室協(xié)助完成此項(xiàng)工作。

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Identification of Alisma plantago-aquatica Seeds Based on Traditional Chinese Medicine DNA Barcoding System

This study was aimed to authenticate the Alisma plantago-aquatica seeds from different producing areas with the Traditional Chinese Medicine (TCM) DNA barcoding system. The total genomic DNA was extracted using plant DNA extraction kit. The internal transcribed spacer 2 (ITS2) regions were amplified and sequenced. The sequences were assembled by the CodonCode Aligner 6.0.2 and analyzed by MEGA5.1. The morphological characteristics of seeds were observed using microscope. The results showed that the morphological characteristics of Alisma plantago-aquatica seeds and Alisma orientale seeds were similar. The ITS2 sequence lengths of both species were 311 bp. The GC content was 56.9%. One stable SNP (T-A) was detected at 165 bp in the ITS2 sequence. The identification results showed that 20 samples collected in Sichuan province were identified as A. plantago-aquatica, while 36 samples from other producing regions were A. orientale. It was concluded that the TCM DNA barcoding system can provide guidance for the accurate selection of Alisma plantago-aquatica seeds. This system had important application value in the cultivation of Alisma plantago-aquatica. It also provided demonstration for the identification of other TCM seeds.

DNA barcoding, Alisma plantago-quatica, Alisma orientale, seed identification, ITS2

Zhang Nana1, Xin Tianyi1, Jin Yue1, Gu Wei2, Song Jingyuan1

(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China)

10.11842/wst.2016.01.003

R931.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2015-06-16

修回日期：2015-12-07

＊ 國(guó)家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（81373922）：基于ITS2互補(bǔ)堿基變化分析的中藥基原物種鑒定研究，負(fù)責(zé)人：宋經(jīng)元。

＊＊ 通訊作者：宋經(jīng)元，本刊編委，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥資源學(xué)。