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    蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷過程中古菌群落特征解析*

    2016-03-13 01:34:13任連海席北斗祝超偉李鳴曉趙由才
    環(huán)境污染與防治 2016年7期
    關(guān)鍵詞:古菌產(chǎn)氫泳道

    賈 璇 任連海 席北斗 祝超偉 李鳴曉# 趙由才

    (1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程系,北京 100048;2.中國環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險評估國家重點(diǎn)實驗室,北京 100012;3.同濟(jì)大學(xué)污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實驗室,上海 200092)

    水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致水生植物大量繁殖,蘆葦是我國濕地、草型湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,在污水凈化和吸附重金屬方面尤為突出[1]。但蘆葦生長末期除部分用作飼料、燃料外,大部分殘體在水中腐解,對水生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害[2]。蘆葦纖維素、半纖維素等有機(jī)質(zhì)含量高[3],是生物質(zhì)能源化利用的理想原料,氫氣-甲烷聯(lián)產(chǎn)工藝依據(jù)相分離原理,將厭氧發(fā)酵過程分為產(chǎn)氫階段和產(chǎn)甲烷階段,獲得氫氣和甲烷兩種能源,能源轉(zhuǎn)化效率最高可達(dá)89%,是實現(xiàn)蘆葦減排產(chǎn)能的重要途徑[4-6]。筆者長期從事有機(jī)廢物厭氧聯(lián)產(chǎn)工藝研究[7-8],由于厭氧聯(lián)產(chǎn)過程復(fù)雜,多種微生物相互作用機(jī)制不清,微環(huán)境難控,使工藝穩(wěn)定運(yùn)行困難。產(chǎn)甲烷菌是一類極端厭氧古菌,位于厭氧消化食物鏈的最末端,是厭氧生物處理工藝中最重要的限速步驟,其群落的組成和數(shù)量的變化直接影響厭氧發(fā)酵速率和產(chǎn)氣量[9-10]。

    以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增為主的非培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展揭示了環(huán)境中龐大的微生物多樣性[11]。PCR—變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)不僅可以研究古菌群落在時間和空間上的動態(tài)變化,還可以通過序列分析或探針雜交確定其中的種群組成[12-13],對闡明厭氧聯(lián)產(chǎn)過程的微生物作用機(jī)制具有重要意義。KEYSER等[14]應(yīng)用DGGE技術(shù)測定了3種厭氧反應(yīng)器污泥顆粒中的產(chǎn)甲烷古菌的指紋圖譜,同時對產(chǎn)甲烷古菌進(jìn)行了鑒定。王慶等[15]采用PCR—DGGE技術(shù)分析了農(nóng)村沼氣池產(chǎn)甲烷古菌的多樣性,其中以甲烷囊菌屬(Methanoculleus)和小甲烷粒菌屬(Methanocorpusculumparvum)為主。目前,已有的研究多集中在研究傳統(tǒng)單相厭氧發(fā)酵工藝中微生物群落變化[16-18],但采用厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷工藝,針對水生植物秸稈開展古菌群落特征及演替規(guī)律的研究還鮮有報道。

    本研究以典型水生植物蘆葦為研究對象,采用PCR—DGGE技術(shù)分析氫氣-甲烷聯(lián)產(chǎn)不同階段古菌群落的組成和結(jié)構(gòu),探討聯(lián)產(chǎn)過程中古菌群落的演替規(guī)律,以期為厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)的微生物作用機(jī)制和生物強(qiáng)化研究提供理論指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗設(shè)計

    蘆葦采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏梁素海,蘆葦干樣含碳量33.77%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),含氮量0.57%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),總固體(TS)98.68%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),揮發(fā)性固體(VS)91.39%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),灰分7.28%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。接種的厭氧消化污泥含碳量35.20%,含氮量3.06%,TS 16.69%,VS 11.97%,灰分4.72%。取32 g蘆葦干樣,加入10 mg/g纖維素酶R-10浸泡,固液比為1∶12(質(zhì)量比),48 ℃進(jìn)行酶解預(yù)處理,預(yù)處理時間48 h。預(yù)處理后的蘆葦樣品接種200 mL厭氧消化污泥,污泥添加量為發(fā)酵總體積的12.5% (體積分?jǐn)?shù)),培養(yǎng)體積1.6 L,通入高純氮?dú)? min以排除反應(yīng)瓶中的空氣,37 ℃中溫發(fā)酵,攪拌速度150 r/min。采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)初始pH為5,產(chǎn)氫階段發(fā)酵周期為4 d,分別于0、6、12、24、36、60、96 h采集樣品,編號為H1~H7;待產(chǎn)氫過程結(jié)束,調(diào)節(jié)pH至7,產(chǎn)甲烷階段發(fā)酵周期為18 d,分別于42、66、90、114、162、210、258、306、432 h采集樣品,編號為M1~M9。

    1.2 總DNA提取

    采用BIOTEKE淤泥基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 古菌目的片段擴(kuò)增

    PCR體系:10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 20~50 ng、Tag聚合酶(Takara,大連)1.5 U、滅菌高純水補(bǔ)齊至50 μL。

    擴(kuò)增條件:采用Touch Down PCR,以增加產(chǎn)物的特異性。反應(yīng)條件如下:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,68~58 ℃退火30 s(退火溫度從68 ℃降到58 ℃,每個循環(huán)降低1 ℃,經(jīng)10個循環(huán)后,退火溫度降至58 ℃),94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,20個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。用于PCR擴(kuò)增的引物如表1所示。

    1.4 PCR—DGGE分析

    1.4.1 PCR產(chǎn)物DGGE

    PCR產(chǎn)物用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小和濃度。取20 μL PCR產(chǎn)物(約200 ng)與10 μL 5×Loading buffer混勻后進(jìn)行電泳,以去離子甲酰胺和尿素為變性劑,其中古菌變性梯度為40%~70%,聚丙烯酰胺膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%,電壓20 V預(yù)電泳10 min,電壓130 V電泳6 h,溫度恒定為60 ℃。電泳結(jié)束后,凝膠以Gel-Red染色劑染色30 min,洗滌后于Bio-Rad USA上掃描成像分析。

    1.4.2 條帶回收及純化

    在345 nm波長下將優(yōu)勢差異條帶和共性條帶切下,洗凈后浸泡于裝有高純水的2 mL無菌離心管中,搗碎后加入60 μL TE緩沖溶液,4 ℃放置24 h。取5 μL回收產(chǎn)物作為模板,選用無GC夾的上述PCR擴(kuò)增的引物,按1.3節(jié)再次擴(kuò)增。選用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化。

    表1 用于古菌PCR擴(kuò)增的引物

    圖1 蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)不同階段累積產(chǎn)氣量和生物氣產(chǎn)量變化情況Fig.1 The maximum cumulative biogas production and proportion from reed under different stages

    1.4.3 克隆測序

    DNA溶液全量10 μL,加入100 μL JM109感受態(tài)細(xì)胞中,再加入890 μL SOC培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min。于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)。取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行質(zhì)粒提取,采用3730xl測序儀測序,測序結(jié)果提交GenBank并獲得接受號。利用BLAST程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行同源性分析,獲得相關(guān)種屬的序列信息。

    1.5 DGGE圖譜相似性分析

    結(jié)合ImageJ、Mathworks Matlab v7.1以及PAST軟件對DGGE圖譜進(jìn)行分析。首先用ImageJ軟件對DGGE圖譜數(shù)字化,再以Mathworks Matlab v7.1軟件對數(shù)字化DGGE圖譜進(jìn)行補(bǔ)點(diǎn)處理,最后用PAST軟件選取歐幾里德距離作為參數(shù)進(jìn)行聚類分析。

    1.6 分析方法

    累積產(chǎn)氣量采用排水法測定。氫氣和甲烷產(chǎn)量采用SP-6890型氣相色譜儀測定。色譜條件:氫火焰離子化檢測器,色譜柱為3 mm內(nèi)徑不銹鋼填充柱(TDx-01高分子小球),柱室、汽化室和檢測室的溫度分別為120、150、150 ℃,氬氣為載氣,純度≥99.999%,流速為40 mL/min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷情況

    蘆葦秸稈經(jīng)纖維素酶R-10處理后進(jìn)行厭氧聯(lián)產(chǎn),結(jié)果如圖1所示。產(chǎn)氫階段初期酶處理組產(chǎn)氣量迅速上升,12 h后產(chǎn)氣量緩慢上升,產(chǎn)氫階段最大累積產(chǎn)氣量為1 360 mL,是未經(jīng)預(yù)處理對照組的3倍。酶處理組氫氣體積分?jǐn)?shù)12 h達(dá)到最高,為52.1%,隨著反應(yīng)進(jìn)行氫氣體積分?jǐn)?shù)逐漸降低。產(chǎn)甲烷階段,酶處理組累積產(chǎn)氣量隨時間穩(wěn)定上升,353 h累積產(chǎn)氣量最高達(dá)4 400 mL,是對照組的5倍,甲烷體積分?jǐn)?shù)隨時間顯著上升。對照組最大甲烷體積分?jǐn)?shù)為68.4%??梢?,蘆葦經(jīng)纖維素酶R-10預(yù)處理后氫氣和甲烷產(chǎn)量顯著提高。KAPOOR等[19]指出,纖維素酶可特異性地吸附在秸稈的纖維素結(jié)構(gòu)上,促進(jìn)植物細(xì)胞壁溶解,使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)溶解出來,并將大分子多糖、蛋白質(zhì)和脂類降解成小分子物質(zhì),提高了底物利用效率和產(chǎn)氣潛力。

    2.2 古菌DGGE圖譜分析

    從圖2可以看出,厭氧聯(lián)產(chǎn)不同階段的古菌DGGE條帶種類和分布表現(xiàn)出了明顯的差異,產(chǎn)甲烷階段的古菌種類和數(shù)目明顯高于產(chǎn)氫階段,尤其是產(chǎn)甲烷階段初期表現(xiàn)出了較高的微生物多樣性。條帶7、10、13為兩個階段的共有條帶,貫穿整個厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)過程,但在兩個階段發(fā)酵過程中各條帶亮度和持續(xù)時間不同。條帶7在產(chǎn)甲烷階段的中后期尤其是泳道M6、M7、M8中亮度高、寬度大和持續(xù)時間長,但在產(chǎn)氫階段亮度低、寬度窄、持續(xù)時間很短。條帶10則在產(chǎn)氫階段和產(chǎn)甲烷初期較為明顯,到產(chǎn)甲烷高峰期逐漸減弱,兩個階段特有的生態(tài)條件為不同微生物的生長創(chuàng)造了適宜的條件,造成了兩個階段優(yōu)勢古菌的差異性。

    圖2 古菌DGGE圖譜Fig.2 Archaea DGGE band patterns

    條帶2、5分別在產(chǎn)氫階段后期和產(chǎn)氫階段初期出現(xiàn),為產(chǎn)氫階段的特有條帶,產(chǎn)氫階段末期泳道H7至產(chǎn)甲烷階段,該條帶消失。條帶3、8、12、14、15是產(chǎn)甲烷階段的特有條帶,出現(xiàn)在產(chǎn)氫階段末期和產(chǎn)甲烷階段,為產(chǎn)甲烷階段優(yōu)勢菌群。產(chǎn)甲烷階段,發(fā)酵環(huán)境pH為中性,適宜產(chǎn)甲烷菌生長,使底物中的古菌數(shù)量顯著提高。而條帶4僅出現(xiàn)在產(chǎn)氫階段末期和產(chǎn)甲烷階段初期,即泳道H7和M1~M3??梢姡S著蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)的進(jìn)行,古菌群落組成發(fā)生了顯著的演替變化,表現(xiàn)在DGGE圖譜上條帶數(shù)目和亮度的規(guī)律性變化。

    2.3 古菌群落相似性分析

    利用 BIO-RAD QUANTITY ONE 4.6.2軟件處理所得到圖譜,用戴斯系數(shù)(Cs)計算微生物群落的相似性:

    Cs = 2j/(a+b)

    (1)

    式中:j為樣品 A 和 B 共有的條帶數(shù);a和b分別為樣品 A 和 B 中各自的條帶數(shù)。

    Cs取值范圍為0(沒有相同條帶)~1(所有的條帶相同)。依據(jù) Complete Linkage算法對DGGE條帶進(jìn)行聚類分析。

    氫氣-甲烷聯(lián)產(chǎn)不同階段代謝產(chǎn)物的相似性(見表2)和聚類分析(見圖3)表明,相鄰時間的圖譜相似性較高,聚為一類,不同階段代謝產(chǎn)物的圖譜相似性較低。在產(chǎn)氫階段初期,種群結(jié)構(gòu)的Cs最高達(dá)94.2(泳道H1、H4)。隨后產(chǎn)氫階段的種群結(jié)構(gòu)Cs均較高,分別為86.8(泳道H1、H2)、79.0(泳道H1、H3)、71.0(泳道H1、H7)。可見,產(chǎn)氫階段古菌的微生物群落結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定,古菌種類基本保持不變。

    表2 基于Cs的相似性矩陣

    表3 古菌條帶序列的比對結(jié)果

    圖3 古菌DGGE圖譜的聚類分析圖Fig.3 Clustering analysis for DGGE profile of archaea

    產(chǎn)甲烷階段中期,也是產(chǎn)甲烷高峰期,種群結(jié)構(gòu)相似性的Cs分別為77.9(泳道M6、M7)、90.9(泳道M6、M8),產(chǎn)甲烷末期,Cs顯著下降為58.0(泳道M6、M9),隨著產(chǎn)甲烷的進(jìn)行,古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著更替,產(chǎn)氫階段初期和產(chǎn)甲烷階段末期的Cs僅為43.4(H1、M9)??梢?,厭氧聯(lián)產(chǎn)過程中古菌的微生物群落組成和功能發(fā)生了規(guī)律性的更替,其中產(chǎn)氫階段古菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高,產(chǎn)甲烷階段古菌群落的微生物多樣性顯著提高。

    2.4 古菌群落序列分析

    將厭氧聯(lián)產(chǎn)不同階段的古菌條帶進(jìn)行切膠測序,測序結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行比對,結(jié)果如表3所示。測得的序列條帶與基因庫中已知微生物的同源性比例均在99%以上,經(jīng)BLAST后的古菌序列主要為Methanoculleus、產(chǎn)甲烷古菌(Methanogenicarchaeon)、甲烷桿菌屬(Methanobacterium)和傳統(tǒng)方法不可培養(yǎng)的unculturedMethanosarcinalesarchaeon。其中,Methanogenicarchaeon、Methanoculleushoronobensis等產(chǎn)甲烷菌在厭氧發(fā)酵過程中始終存在,主要通過氫營養(yǎng)途徑合成甲烷。產(chǎn)氫階段的優(yōu)勢古菌為unculturedMethanosarcinalesarchaeon(條帶10),屬于不可培養(yǎng)微生物,能夠利用乙酸途徑產(chǎn)甲烷,它們通過裂解乙酸,還原甲基碳產(chǎn)生甲烷,同時氧化其羧基碳產(chǎn)生二氧化碳[20]。產(chǎn)氫高峰期,Methanoculleusmarisnigri(條帶2)出現(xiàn)。產(chǎn)氫階段末期到產(chǎn)甲烷階段的過渡期,出現(xiàn)Anaerobicmethanogenicarchaeon(條帶9),在功能上起著承上啟下的作用。產(chǎn)甲烷高峰期,古菌群落豐富,其中Methanoculleusbourgensis(條帶3)是產(chǎn)甲烷階段的優(yōu)勢微生物[21]。 SONG等[22]也從秸稈和畜禽糞便混合厭氧消化系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了Methanosarcina、Methanosaeta、Methanoculleus等6類產(chǎn)甲烷菌。

    3 結(jié) 論

    采用PCR—DGGE技術(shù),研究了蘆葦厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷過程中古菌群落組成和演替規(guī)律。隨著蘆葦厭氧聯(lián)產(chǎn)的進(jìn)行, DGGE圖譜上條帶數(shù)目和亮度的規(guī)律性變化,群落相似性和聚類分析表明,相鄰時間的圖譜相似性較高,聚為一類,不同階段代謝產(chǎn)物的圖譜相似性較低,厭氧聯(lián)產(chǎn)過程中古菌的微生物群落組成和功能發(fā)生了規(guī)律性的更替,其中產(chǎn)氫階段古菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高,產(chǎn)甲烷階段古菌群落的微生物多樣性顯著提高。

    序列分析表明,厭氧聯(lián)產(chǎn)氫氣-甲烷過程中存在古菌主要有Methanoculleus、Methanogenicarchaeon、Methanobacterium和unculturedMethanosarcinalesarchaeon等。產(chǎn)氫階段的優(yōu)勢古菌為unculturedMethanosarcinalesarchaeon,能夠利用乙酸途徑產(chǎn)甲烷。產(chǎn)氫高峰期,出現(xiàn)Methanoculleusmarisnigri。產(chǎn)氫階段末期到產(chǎn)甲烷的過渡期,出現(xiàn)Anaerobicmethanogenicarchaeon,在功能上起著承上啟下的作用。產(chǎn)甲烷高峰期,古菌群落豐富,Methanoculleusbourgensis是產(chǎn)甲烷階段優(yōu)勢菌。

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