副豬嗜血桿菌檢測技術(shù)及耐藥性研究進展

李曦婷，董　俏，李化生，劉寶山，王　超，尹榮蘭，劉夢志，李　文，張夢南，尹榮煥*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院，吉林長春 130062)

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文獻綜述

副豬嗜血桿菌檢測技術(shù)及耐藥性研究進展

李曦婷1，董俏1，李化生1，劉寶山1，王超1，尹榮蘭2，劉夢志1，李文1，張夢南1，尹榮煥1*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866；2.吉林省畜牧獸醫(yī)科學研究院，吉林長春 130062)

近年來，由副豬嗜血桿菌感染豬引起的副豬嗜血桿菌病在全世界普遍發(fā)生，對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重，再加上治療副豬嗜血桿菌病需要大量抗菌藥物，所帶來的費用及急性感染導致仔豬死亡給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失，使國內(nèi)外學者圍繞副豬嗜血桿菌的檢測技術(shù)及耐藥性等進行了廣泛而深入的研究。研究人員通過對不同分型方法的不斷探索，試圖找到準確性、重復(fù)性、快速性、便行性最好的分型技術(shù)，以便更好的對副豬嗜血桿菌病進行防控。論文對副豬嗜血桿菌的檢測、血清分型、基因分型、耐藥性調(diào)查及耐藥機制方面的研究進展進行了全面綜述，為副豬嗜血桿菌病的相關(guān)研究和有效防控提供參考。

副豬嗜血桿菌；檢測；血清型；基因型；耐藥性

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis, Hps)屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是豬格氏病(Glasser's disease)的病原菌，可以導致豬出現(xiàn)多發(fā)性纖維素性漿膜炎和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎。該菌最早在1910年由德國科學家Glasser發(fā)現(xiàn)，直到1922年被Schermer和Ehrlich首次分離到病原菌。副豬嗜血桿菌對生長環(huán)境要求嚴苛，對環(huán)境的耐受力較弱，Biberstein和White研究發(fā)現(xiàn)，其生長只需要V(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD)因子,而不需要X(鐵卟啉)因子，因而得名副豬嗜血桿菌。首次培養(yǎng)在體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)上生長良好，培養(yǎng)18 h～24 h，可見表面光滑、邊緣圓滑、針尖大小成露珠樣的單個菌落。該菌為革蘭陰性菌，呈現(xiàn)多形態(tài)，從單個的球桿菌，到細長以至絲狀的細菌。它與金黃色葡萄球菌共同劃線培養(yǎng)時有衛(wèi)星現(xiàn)象[1]。

所有飼養(yǎng)豬的國家?guī)缀醵加懈必i嗜血桿菌的存在，除了引起疾病外，還經(jīng)常是豬上呼吸道的常在菌[2]。在病豬抵抗力低下或?qū)Νh(huán)境耐受減弱時，可侵入機體各器官引起發(fā)病，這也是仔豬死亡的主要原因之一。隨著Hps的感染愈發(fā)嚴重，人們開始從分子水平對其進行大量研究。從基因水平上研究血清型，通過對不同分型方法的不斷探究，試圖找到更好的分型技術(shù)。由于疫苗之間存在異源性，不能很好的控制Hps引起的疾病，因此臨床上常用大量抗菌藥物治療，故而導致多重耐藥性的產(chǎn)生?？傊?，副豬嗜血桿菌病嚴重影響畜牧業(yè)的發(fā)展，對它的流行病學及耐藥性方面有必要做全面的了解。

1　副豬嗜血桿菌檢測技術(shù)

1.1Hps檢測技術(shù)

目前副豬嗜血桿菌的分子生物學檢測技術(shù)是最常用的檢測手段。Oliveira等根據(jù)副豬嗜血桿菌16 S rRNA序列設(shè)計了1對特異性引物，目的序列片段為822 bp左右。但通過大量試驗發(fā)現(xiàn)，此引物對一些相似的細菌會出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。而后Angen O等[3]設(shè)計了特異性更高的3條引物，2條上游引物，1條下游引物(HpsF1 5′-TATCGGGAGATGAAAGAC-3′；HpsF2 5′-GTAATGTCT AAGGACTAG-3′；HpsR 5′-CCTCGCGGCTTCGTC-3′) ，使得檢測更高效、準確，解決了前者出現(xiàn)的假陽性問題。苗立中等[4]建立基于SYBR GreenⅠ快速檢測Hps的實時熒光定量PCR方法，敏感性比常規(guī)PCR高100倍，可用于Hps感染的早期診斷、流行病學調(diào)查以及Hps的定量分析。車勇良等[5]研究建立了一種可以快速檢測Hps的環(huán)介導等溫擴增方法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，根據(jù)GenBank中Hps肽聚糖相關(guān)脂蛋白基因保守區(qū)域設(shè)計外引物，內(nèi)引物及環(huán)引物，并在體系中加入SYBR GreenⅠ，優(yōu)化該可視化檢測體系， 并用建立的Hps可視化LAMP對8株臨床分離株進行檢測， 結(jié)果均為陽性，并且可對感染Hps的豬的體液進行檢測，建立了一種敏感性強、 反應(yīng)快速和特異性高的憑肉眼可以判定結(jié)果的可視化LAMP方法。由于檢測的便行性，可能更適合于推廣于臨床。PCR等方法被不斷改進，已經(jīng)從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定。迄今為止，檢測技術(shù)已有十幾種之多，對副豬嗜血桿菌的檢測技術(shù)也在不斷改進，使相應(yīng)感染診斷結(jié)果也更加準確、高效。

1.2Hps的血清分型

不同國家、不同地區(qū)Hps流行株，血清學上存在差異。一般都是通過瓊脂擴散血清分型方法(KRG)，將Hps分為15個血清型，命名為1～15型，另有約20%分離株尚不能分型。2007年，在美國、德國、澳大利亞、加拿大、西班牙、丹麥和日本分離菌株血清4型、5型和13型最為常見。2015年，從巴西分離出的菌株以4型、5型、13型和14型為主，另有39%的菌株不能分型；2014年，對江西分離到的47株Hps進行血清學檢測，發(fā)現(xiàn)主要血清型為4型和5型，其次是13和14型，另有3株不能確定血清型；對東北地區(qū)分離的Hps進行血清型鑒定結(jié)果顯示，主要血清型為5型和13型，其次為1型、4型和12型；對華南地區(qū)分離到Hps的進行血清分型，主要血清型為 5型和4型，不可分型菌株占20%[6-7]。由大量數(shù)據(jù)可看出，目前國內(nèi)外的流行株均以4型、5型和13型為主，并且近10年來主要流行的血清型未發(fā)生變化[8]?，F(xiàn)有研究表明，可用PCR鑒定血清型，除了5型和12型由于鑒別時使用的是同一對引物而不能確定外，其余血清型均可100%確定。這在一定程度上又提高了血清型檢測的準確性和高效性，使Hps血清型的研究提升到了基因水平上[9]。不同血清型之間致病力存在較大差異，其中1、5、10、12、13、14型毒力很強，2、4、15型為中等毒力株，其他血清型毒力較弱，可認為是無毒力株[10-11]。雖然血清型與毒力存在一定關(guān)系，但是相對的，因為同一血清型，毒力也不盡相同。同樣，各個血清型之間、同一血清型之間的交叉保護力也存在差異。因此，從疫苗的角度來講，不能夠很好的預(yù)防此病。

1.3Hps基因分型技術(shù)

大量研究顯示，血清型不能對Hps進行完全的分型。研究者們想通過在分子水平上對基因做系統(tǒng)的研究，將Hps進行完全的鑒定分型。目前可用到的基因分型包括腸桿菌基因間重復(fù)序列PCR(ERIC-PCR)、多位點序列分型(multilocus sequence typing,MLST)、脈沖場凝膠電泳(pulsed field gelelectrophoresis,PFGE)、單基因座序列分型等。

應(yīng)用ERIC-PCR指紋圖譜對Hps進行分型，發(fā)現(xiàn)47株Hps產(chǎn)生28種不同的指紋圖譜。其中包括分離自同一豬場的相同血清型的菌株表現(xiàn)出不同的指紋圖譜，還包括無法進行血清分型的Hps應(yīng)用該方法也可得到充分區(qū)分。Macedo N R等[12]應(yīng)用 ERIC-PCR 指紋圖譜對巴西豬場中分離的Hps進行鑒定，63株Hps共發(fā)現(xiàn)了33種基因型。ERIC-PCR方法雖然可以將Hps進行多樣的分型，但是存在一定缺點，各個研究組之間基因型難以比較。而MLST分型法雖然需要進行全基因測序，成本昂貴，但其分辨率高，并且比ERIC-PCR 技術(shù)基因分型更易比較。它是基于核酸序列測定的細菌分型方法，通過PCR擴增多個管家基因內(nèi)部片段，測定其序列，分析菌株的變異，從而進行分型。Mullins M A等[13]應(yīng)用MLST 分型方法，對127個菌株進行研究，7個管家基因(mdh、6pgd、 atpD、 g3pd、 frdB、 infB和rpoB基因)序列中確定了278個變異位點，重新定義了116個獨特的序列類型。賈愛卿等[14]應(yīng)用MLST方法表明，分離的Hps中7個管家基因均存在不同程度變異，平均變異率為52.4%。

隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷更新，基因的不斷進化變異，可將Hps的分型更加細化。還可以通過大量試驗，系統(tǒng)化的研究表達同一段蛋白的基因，可以幫助找到規(guī)律性差異，為更好的分型提供參考。Howell K J等[15]對Hps編碼莢膜多糖序列分析，15種血清型中除了5型和12型沒有一個獨特的區(qū)域，其余血清型都具有一個獨特的區(qū)域，該區(qū)域可進行后續(xù)的Hps分型研究。

2　副豬嗜血桿菌的耐藥性

2.1耐藥性起源及機制

研究發(fā)現(xiàn)，抗生素存在于人類和動物生存環(huán)境中，包括人類的飲用水中，它們數(shù)量龐大，種類不盡相同[16]?？股氐臒o處不在使耐藥性問題更加突出。目前認為耐藥性可分為固有耐藥性(intrinsic resistance)和獲得耐藥性(acquired resistance)兩大類。固有耐藥性即本身或突變產(chǎn)生的耐藥基因；而獲得耐藥性，是由于細菌與抗菌藥物發(fā)生反應(yīng)后，本身的代謝途徑發(fā)生改變，不易被抗菌藥物抑制或殺滅，并且可以由質(zhì)粒介導耐藥性[17]?？纱笾聦a(chǎn)生耐藥性的機制分為以下幾點：細胞膜通透性發(fā)生改變，產(chǎn)生酶類破壞抗菌藥物活性，抗菌藥物在體內(nèi)發(fā)生變化，作用靶位改變，外排泵發(fā)生改變[18-22]。同時還會出現(xiàn)交叉耐藥性，主要是由于相似結(jié)構(gòu)的抗菌藥之間耐藥性的傳遞。多重耐藥性也會出現(xiàn)，指的是不同的耐藥基因位于同一個可移動的轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒上，因此同一細菌可耐多種抗菌藥。

2.2Hps耐藥性調(diào)查

作為對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重的病原菌之一，副豬嗜血桿菌的耐藥性同樣很受重視。2004 年，丹麥學者發(fā)現(xiàn)Hps中存在對三甲氧芐氨嘧啶和磺胺甲惡唑多重耐藥的現(xiàn)象。隨后外國學者分別調(diào)查在英國和西班牙分離到的Hps的耐藥性，發(fā)現(xiàn)英國分離的Hps對新霉素僅存在20%的耐藥菌，而西班牙分離的Hps存在多藥物耐藥現(xiàn)象，其中包括土霉素、紅霉素、替米考星、青霉素、氨芐青霉素、硫姆林、三甲氧芐氨嘧啶和磺胺甲惡唑。由此可見，同一時期、不同地區(qū)的耐藥性有很大差別。2010年，Zhou X等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在中國分離到的Hps不僅對紅霉素、替米考星、青霉素、氨芐青霉素、三甲氧芐氨嘧啶和磺胺甲惡唑耐藥，還增加了對恩諾沙星、四環(huán)素、慶大霉素、大觀霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和泰妙菌素耐藥現(xiàn)象。2011年，Xu C等[24]發(fā)現(xiàn)存在少量Hps對頭孢噻肟和頭孢他啶的耐藥。由于頭孢噻肟和頭孢他啶具有廣譜、高效的特點，在臨床上大量使用，因此會產(chǎn)生不同程度的耐藥現(xiàn)象，此類藥物一旦產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，同類藥物使用都會耐藥。由此可見，不同地區(qū)首選使用的抗菌藥物不同，產(chǎn)生的耐藥現(xiàn)象也不盡相同。2013年—2014年，張悅等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Hps藥敏試驗結(jié)果為所有菌株都對阿奇霉素、替米考星、泰妙菌素、阿米卡星、頭孢噻呋和左氧氟沙星敏感,超過90%的菌株對紅霉素、氟苯尼考、壯觀霉素、青霉素、氨芐青霉素和環(huán)丙沙星敏感,但對四環(huán)素和恩諾沙星耐藥率較高。耐藥譜分析顯示,37.1%的菌株對兩種以上的抗菌藥耐受。Dayao D A E等[26]研究發(fā)現(xiàn)，澳大利亞的菌株表現(xiàn)出最低抑菌濃度升高的現(xiàn)象，分別為氨芐青霉素(1%)、青霉素(2%)、紅霉素(7%)、替米考星(14%)、泰拉霉素(22%)、四環(huán)素(31%)、復(fù)方磺胺甲惡唑(40%)。2015年有研究發(fā)現(xiàn)，中國分離到的3株Hps對頭孢類、黏桿菌素類高度敏感，對四環(huán)素類、喹諾酮類和青霉素類藥品明顯耐藥。同年米丁丹等[27]研究發(fā)現(xiàn)，30株HPS對氨芐西林、泰妙菌素、恩諾沙星和亞胺培南的耐藥率較高，分別為50%、50%、46.7%和100%。這些研究證明，各個地區(qū)分離菌株藥敏試驗結(jié)果不一致，不同時間段菌株的耐藥性也存在差異，應(yīng)對特定地區(qū)其耐藥性進行長期監(jiān)測。

2.3Hps耐藥機制

副豬嗜血桿菌的耐藥性問題正在困擾著養(yǎng)豬業(yè)，因此對于Hps耐藥性機理的研究也成為熱點。試驗證實突變的位點是產(chǎn)生耐藥性的原因之一。2011年，Chen P等[28]發(fā)現(xiàn)，Hps中存在對喹諾酮抗性決定區(qū)域DNA旋轉(zhuǎn)酶(GyrA和GyrB)和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的突變位點。在GyrA基因密碼子83或87中至少有1個突變位點，GyrB基因密碼子在73或77處也存在突變位點。后續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)，GyrA87位點在所有耐受恩諾沙星菌株中的突變率為100%，這就提示了GyrA87位點的突變對Hps喹諾酮耐藥性形成有重要的影響。同時研究還發(fā)現(xiàn)ParC73位點的突變，能夠協(xié)助其他相關(guān)突變位點增強Hps對喹諾酮藥物的耐受性。2010年，Chen L P等[29]在分離到的Hps中分離到質(zhì)粒Phn-61，可編碼Lin(c)耐藥基因，屬于林可胺類耐藥基因。2012年，在國內(nèi)分離到的Hps中還分離到耐藥質(zhì)粒Phps-A67，可編碼耐藥基因SulⅡ和StrA，分別屬于磺胺類耐藥基因和鏈霉素類耐藥基因[30]。acrA基因在細菌多重耐藥中起重要作用，徐麗娜等[31]試驗首次發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌會存在2個acrA基因。這些研究不僅為副豬嗜血桿菌多重耐藥機制的研究提供了理論基礎(chǔ)，同時還對新型抗菌藥物的研發(fā)也具有重要的參考價值。2015年外國學者從健康斷奶仔豬體內(nèi)分離出的Hps含有新型blaROB-1質(zhì)?？煽功?內(nèi)酰胺類藥物，命名為pJMA-1，試驗還證實此耐藥基因可轉(zhuǎn)移到機體其他細菌中[32]。減少耐藥性可通過對耐藥基因敲除等辦法將耐藥基因破壞。通過對耐藥機制的不斷深入研究，可以避免或消除耐藥性的產(chǎn)生。但新藥開發(fā)及機理的研究是一個漫長的過程，因此應(yīng)在不斷探尋機理的基礎(chǔ)上合理應(yīng)用抗菌藥物必要時聯(lián)合用藥。

3　小結(jié)與展望

近年來，世界各地豬場發(fā)生多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道屢見不鮮，其中大部分病例被診斷為由副豬嗜血桿菌引起。由于Hps血清型眾多，之間又無交叉免疫力，疫苗控制收效甚微，抗菌藥物的使用就顯得尤為重要。對于血清型的確定及耐藥性的研究也已成為時勢所趨。并且隨著豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒感染不斷增多，使豬的免疫力、環(huán)境耐受力急劇下降，混合感染現(xiàn)象十分常見，而Hps常作為繼發(fā)、并發(fā)感染不斷危害著養(yǎng)豬行業(yè)[33]。為了防控Hps病的大面積暴發(fā)，需要改善豬群飼養(yǎng)管理及環(huán)境衛(wèi)生，發(fā)病后及時診斷并合理有效的應(yīng)用抗菌藥物，以達到預(yù)防和治療的效果。

目前，通過對Hps基因分型、耐藥性及耐藥機制的不斷深入研究，有助于快速、準確的找出毒力基因，以開發(fā)出具有針對性的新型不易產(chǎn)生耐藥性的抗菌藥物。

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2016-03-17

遼寧省教育廳優(yōu)秀人才支持項目(LJQ2013070)；遼寧省自然科學基金項目(201602667)

李曦婷(1991-)，女，遼寧沈陽人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)公共衛(wèi)生學研究。*通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2016)10-0085-05