細(xì)菌耐多藥外排泵的研究進(jìn)展

陳小燕，潘玨

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200032

·綜述·

細(xì)菌耐多藥外排泵的研究進(jìn)展

陳小燕，潘玨

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200032

摘要：近年來(lái)，由于抗生素的不合理及廣泛使用，全球多重耐藥菌和廣泛耐藥菌不斷出現(xiàn)。關(guān)于細(xì)菌耐藥機(jī)制中外排泵及生物膜形成的研究越來(lái)越受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，外排泵與生物膜形成有密切聯(lián)系，不同細(xì)菌的不同外排泵對(duì)生物膜形成的影響各異，而生物膜形成又影響外排泵基因表達(dá)。本文就細(xì)菌耐多藥外排泵的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：耐多藥外排泵；生物膜形成；外膜因子

近年來(lái)，由于抗生素的不合理及廣泛使用，全球多重耐藥和廣泛耐藥細(xì)菌不斷出現(xiàn)。2014年中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，細(xì)菌耐藥呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，特別是革蘭陰性菌，其中不動(dòng)桿菌屬(鮑曼不動(dòng)桿菌占93.0%)對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為62.4%和66.7%[1]。目前，關(guān)于細(xì)菌耐藥性的研究主要包括細(xì)菌滅活酶產(chǎn)生、靶位改變、外膜通透性改變、主動(dòng)流出系統(tǒng)(即細(xì)菌外排泵)、耐藥基因轉(zhuǎn)移及生物膜形成等。其中，細(xì)菌外排泵在介導(dǎo)細(xì)菌耐多藥、細(xì)菌毒力及生物膜形成中的作用逐漸受到關(guān)注，但尚不清楚細(xì)菌外排泵與細(xì)菌生物膜形成之間的內(nèi)在聯(lián)系。細(xì)菌耐藥外排泵的廣泛分布與功能重疊暗示其尚有介導(dǎo)耐藥以外的其他重要生物學(xué)功能。由此，本文就細(xì)菌耐藥外排泵的分類及其與生物膜形成的相互影響進(jìn)行綜述。

1細(xì)菌耐藥外排泵的分類

根據(jù)超微結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、氨基酸序列同源性等，目前抗菌藥物耐藥相關(guān)外排泵可分為五大家族：主要易化子超家族(major facilitation superfamily，MFS)、多藥和毒性化合物外排(multidrug and toxic compound extrusion，MATE)家族、ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette，ABC)超家族、耐藥結(jié)節(jié)分化(resistance-nodulation-cell division，RND)家族和小多重耐藥(small multidrug resistance，SMR)家族〔屬于藥物/代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(drug/metabolite transporter，DMT)超家族〕[2]。這5類外排泵的主要區(qū)別如下。①結(jié)構(gòu)組成：RND家族主要以三聚體形式轉(zhuǎn)運(yùn)底物，RND外排泵通常由染色體基因編碼，其結(jié)構(gòu)由膜融合蛋白(membrane fusion protein，MFP)、RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、外膜因子(outer membrane factor，OMF)3部分組成，以三聚體形式橫跨于細(xì)菌內(nèi)外膜之間。其中MFP使細(xì)菌內(nèi)外膜結(jié)合緊密，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有識(shí)別底物和將底物轉(zhuǎn)出細(xì)胞膜的功能；OMF位于細(xì)胞外膜，具有孔道蛋白的作用。這種三聚體轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體具備高效轉(zhuǎn)運(yùn)功能，同時(shí)由于外膜屏障的存在，泵出菌體外的底物不易再次返回菌體內(nèi)。有研究發(fā)現(xiàn)，破壞OMF產(chǎn)生的效果與滅活泵效果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明外膜通透屏障與RND的作用密不可分[3-5]；而ABC、SMR、 MATE家族和MFS則以單聚體形式橫跨細(xì)菌內(nèi)膜。這種單體泵往往在將底物泵至周漿間隙后，部分藥物因具有相對(duì)親脂性可再次經(jīng)內(nèi)膜脂質(zhì)雙分子層擴(kuò)散入細(xì)菌胞內(nèi)發(fā)揮作用，因此是一種低效率的耐藥泵。②細(xì)菌分布：革蘭陽(yáng)性菌主要耐藥外排泵是ABC家族[6]，革蘭陰性菌的主要耐藥外排泵是RND家族[7]。除RND家族只存在于革蘭陰性菌外，其他4個(gè)家族(MFS、ABC、SMR、MATE)廣泛分布于革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌[2]。③外排泵動(dòng)力：ABC家族以ATP供能；SMR、MATE、RND家族和MFS則以質(zhì)子跨膜驅(qū)動(dòng)力為外排動(dòng)力。④外排底物種類：ABC和SMR家族外排泵的外排底物種類較少；MATE 和RND家族外排泵的外排底物包括多種抗菌藥物、消毒劑、染料等。

2耐藥外排泵在生物膜形成和生物膜介導(dǎo)耐藥中的作用

生物膜形成是臨床上定植菌難以清除的重要原因，生物膜形成后細(xì)菌耐藥性強(qiáng)于單個(gè)細(xì)菌(浮游細(xì)菌)。目前認(rèn)為，細(xì)菌生物膜相關(guān)的耐藥機(jī)制可能與細(xì)菌生物膜誘導(dǎo)低生長(zhǎng)率、改變代謝與生理、產(chǎn)生細(xì)胞外生物膜基質(zhì)和上調(diào)應(yīng)激反應(yīng)能力有關(guān)[8-9]。生物形成過(guò)程包括3個(gè)階段：初始黏附、成熟、形成分菌落[10]。此過(guò)程涉及多種環(huán)境刺激因子、特定基因和多種調(diào)節(jié)通路。細(xì)菌生物膜形成有賴于生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)，從而增加菌毛數(shù)量、菌體外基質(zhì)纖維等，與相鄰細(xì)菌相互黏附構(gòu)成穩(wěn)固的三維立體膜結(jié)構(gòu)，提高細(xì)菌耐藥性。因此，外排泵介導(dǎo)細(xì)菌耐藥與生物膜介導(dǎo)細(xì)菌耐藥之間可能存在密不可分的關(guān)系。

2.1耐藥外排泵表達(dá)影響生物膜形成

在鼠傷寒沙門菌耐藥機(jī)制研究中，分別敲除或抑制9種外排泵〔AcrAB(AcrA 除外)、AcrD、AcrEF、MdtABC、MdsABC、EmrAB、MdfA、MdtK、MacAB〕和TolC，生物膜形成能力下降，但不影響細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。將攜帶外排泵基因的質(zhì)粒導(dǎo)入缺陷突變菌株后，又能恢復(fù)正常生物膜形成能力。剛果紅染色試驗(yàn)中觀察到curli菌毛在外排泵敲除菌株中明顯減少，但菌體外基質(zhì)纖維素未減少。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)顯示，9種外排泵和tolC敲除突變株中，所有菌株csgB基因(curli菌毛合成相關(guān)基因)表達(dá)均顯著下調(diào)，9種突變株csgD表達(dá)顯著下調(diào)，acrB或tolC突變株的菌毛合成相關(guān)基因csgA、csgB、csgD、csgE、csgF、csgG均下調(diào)。前面提到的acrA基因敲除例外，但acrA基因缺失突變后可導(dǎo)致細(xì)菌多耐藥性、黏附力、侵襲能力下降。acrA突變株與acrB或tolC突變株的主要差別正是curli基因在acrA突變株中正常表達(dá)。綜上所述，推測(cè)鼠傷寒沙門菌耐藥外排泵可能改變curli菌毛合成相關(guān)基因表達(dá)水平，減少curli菌毛產(chǎn)生，影響細(xì)菌形成成熟的生物膜[11-12]。然而，最近有研究證明鼠傷寒沙門菌的acrAB或acrB基因敲除后并不影響細(xì)菌生物膜的形成；給予氯霉素處理后，突變株和野生株的生物膜形成才受影響[13]。這兩個(gè)相矛盾的研究結(jié)果提示，存在其他調(diào)控因子影響外排泵對(duì)生物膜形成的作用，因此如何更好地將外排泵抑制劑與抗生素聯(lián)合應(yīng)用于耐藥菌感染的治療還需進(jìn)一步研究。在鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)RND家族外排泵adeG基因表達(dá)可誘導(dǎo)生物膜形成。AdeFGH外排泵參與鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜形成，且abaI基因上調(diào)與adeG基因具有協(xié)同作用，可進(jìn)一步促進(jìn)生物膜形成。推測(cè)其分子機(jī)制為adeFGH基因過(guò)表達(dá)加速細(xì)菌群體感應(yīng)分子〔酰化高絲氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone，AHL)〕轉(zhuǎn)運(yùn)至菌體外，菌體外AHL濃度不斷增加，反滲入菌體胞質(zhì)形成AbaR-AHL復(fù)合體，后者通過(guò)abaR(細(xì)菌群體感應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控子)激活abaI基因，使AHL合成增加，繼續(xù)通過(guò)過(guò)表達(dá)的外排泵泵出菌體外。如此周而復(fù)始，加強(qiáng)細(xì)菌間相互作用，促進(jìn)生物膜形成[14]。此外，上調(diào)鮑曼不動(dòng)桿菌多種RND泵、外膜蛋白 OmpA 和CarO 可促進(jìn)生物膜形成。OmpA 和CarO可能作為細(xì)菌主要的L-組氨酸攝入通道，影響組氨酸代謝而促進(jìn)生物膜形成[15]；而abeD缺失突變后不影響生物膜形成[16]。在大腸埃希菌耐藥機(jī)制研究中，腸集聚性大腸埃希菌tolC缺失突變后可能通過(guò)改變Mg2+轉(zhuǎn)運(yùn)，在轉(zhuǎn)錄后修飾水平降低蛋白疏水性，提高其聚集性和生物膜形成能力；也可能通過(guò)某種TolC介導(dǎo)外排的體液因子(推測(cè)其為存在于AAF菌毛疏水蛋白表面的一種相對(duì)分子質(zhì)量為38 000的蛋白)，調(diào)節(jié)AAF菌毛疏水蛋白功能及表達(dá)量，提高其聚集性和生物膜形成能力。至于是否通過(guò)上述群體感應(yīng)調(diào)控機(jī)制及TolC分泌抗原Ag43改變生物膜形成能力，還需進(jìn)一步證實(shí)[17]。將大腸埃希菌RND家族(acrAB、acrD、acrEF、mdtABC、mdtEF)、MFS(emrAB、emrD、emrKY)、SMR家族(emrE)和ABC家族(macAB)的外排泵基因分別敲除后，生物膜形成能力均降低[18]。在大腸埃希菌IncX1大接合質(zhì)粒中，編碼OqxAB泵(RND家族)和Ⅲ型菌毛(mrkABCDF)的基因共同存在于復(fù)合轉(zhuǎn)座子(Tn6010和Tn6011)中，因此外排泵可影響菌毛表達(dá)，改變生物膜形成能力[19]。敲除嗜麥芽窄食單胞菌macABC基因后，生物膜形成減少50%[20]。在銅綠假單胞菌培養(yǎng)基中加入外排泵抑制劑PAβN(Phe-Arg-β-naphthylamide)和鐵離子螯合劑，發(fā)現(xiàn)生物膜形成減少[21]。脆弱類桿菌在膽鹽誘導(dǎo)下高表達(dá)RND外排泵基因，促進(jìn)生物膜形成[22]。盡管許多研究證明上調(diào)外排泵表達(dá)可促進(jìn)生物膜形成，但Yoon等在鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)RND家族AdeABC和AdeIJK后細(xì)菌膜復(fù)合體結(jié)構(gòu)改變，從而降低細(xì)菌的生物膜形成率[23]。因此，不同細(xì)菌外排泵對(duì)生物膜形成的影響不同。在這些突變株中觀察到的外排泵對(duì)生物膜形成的影響可能是基于一些信號(hào)分子表達(dá)水平的改變，而這些信號(hào)分子很可能成為去除耐藥菌的靶分子，值得繼續(xù)研究。

2.2耐藥外排泵誘導(dǎo)浮游細(xì)菌耐藥，在生物膜包被細(xì)菌中與生物膜協(xié)同發(fā)揮作用

銅綠假單胞菌本身具有較高的生物膜介導(dǎo)耐藥能力，但體外研究發(fā)現(xiàn)其外排泵mexAB-oprM基因敲除后，可增強(qiáng)多黏菌素對(duì)生物膜包被細(xì)菌的殺傷力。這是通過(guò)MexAB-OprM泵和Pmr介導(dǎo)的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)修飾等多種機(jī)制改變生物膜包被細(xì)菌的多黏菌素代謝活性及多菌株共存能力，從而增強(qiáng)生物膜包被細(xì)菌對(duì)多黏菌素的耐藥性[24]。對(duì)氧氟沙星耐藥主要由MexAB-OprM泵介導(dǎo)，生物膜則依賴MexAB-OprM泵而稍提高其最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。這些菌株能在膜攻擊因子(多黏菌素和氯己定)作用下存活，不僅與MexAB-OprM 泵有關(guān)，MexCD-OprJ泵和MuxABC-OpmB泵也發(fā)揮重要作用。但研究并未證實(shí)AcrAB泵或MexAB-OprM泵可進(jìn)一步提高生物膜介導(dǎo)的環(huán)丙沙星耐藥性。Mah等發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌外排泵缺失突變株通過(guò)MexAB-OprM外排泵下調(diào)表達(dá)而抑制生物膜的特異耐藥機(jī)制，可提高對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(阿奇霉素)的敏感性，因此MexAB-OprM外排泵對(duì)生物膜介導(dǎo)耐藥有協(xié)同作用[9]。在生物膜包被的銅綠假單胞菌中敲除OpmL-ABC-HlyD外排泵基因時(shí)，生物膜包被細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類(妥布霉素)和喹諾酮類(環(huán)丙沙星)的敏感性增加。以上研究表明，生物膜既存在依賴外排泵的耐藥機(jī)制，也存在獨(dú)立而特異的耐藥機(jī)制。外排泵可進(jìn)一步增強(qiáng)已形成的生物膜介導(dǎo)細(xì)菌耐藥。2.3耐藥外排泵依賴生物膜形成而誘導(dǎo)表達(dá)，生物膜形成相關(guān)基因同時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，SagS和BrlR調(diào)控蛋白為生物膜介導(dǎo)耐藥所必需[25-26]。兩者結(jié)合可激活c-di-GMP第二信使[27]，它是氨基糖苷類誘導(dǎo)生物膜形成和耐藥的相關(guān)分子[28]。SagS與其他3個(gè)二聚體調(diào)控蛋白——BfiRS(調(diào)控生物膜初始黏附)、BfmRS(調(diào)控生物膜成熟)和MifRS(調(diào)控分菌落形成)在生物膜形成過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮作用[24]。BrlR作為mexAB-oprM和mexEF-oprN基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，僅在生物膜形成細(xì)胞中表達(dá)[23]。brlR基因不能被外排泵底物誘導(dǎo)表達(dá)，與其他MerR型調(diào)控子(如BltR和BmrR)在外排泵底物誘導(dǎo)下調(diào)控耐藥不同[29]。滅活SagS可減少 c-di-GMP，因此c-di-GMP受SagS的正調(diào)控[25]。c-di-GMP進(jìn)一步正調(diào)控BrlR，增強(qiáng)BrlR與啟動(dòng)子(BrlR靶基因)的結(jié)合性[27, 30]。SagS、c-di-GMP、BrlR形成耐藥性轉(zhuǎn)換中的重要信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，也為MexAB-OprM和MexEF-OprN泵基因高表達(dá)所必需(這兩個(gè)泵可提高生物膜包被細(xì)菌和浮游細(xì)菌的耐藥性)。有趣的是，浮游菌體c-di-GMP、BrlR、MexA和MexE高表達(dá)也可增加耐藥性[25]。滅活胞質(zhì)外功能σ因子(extracytoplasmic function σ factor) ECF-10可促進(jìn)惡臭假單胞菌的生物膜形成，上調(diào)TtgABC耐藥泵[31]。在體外，利用熒光標(biāo)記技術(shù)和共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)檢測(cè)mexAB-oprM基因在生物膜形成中的表達(dá)量，結(jié)果顯示暴露于多黏菌素后，直接接觸多黏菌素部位的細(xì)菌mexAB-oprM基因表達(dá)量未增加，而包繞多黏菌素生物膜外圍的細(xì)菌mexAB-oprM基因上調(diào)表達(dá)，表明外排泵在成熟生物膜這樣一個(gè)微環(huán)境中更易被誘導(dǎo)表達(dá)。Mah等也證實(shí)生物膜包被的銅綠假單胞菌多種外排泵被誘導(dǎo)表達(dá)，包括MexCD-OprJ和MexXY[9]。研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌A1875-PA1877編碼的外排泵在生物膜介導(dǎo)的環(huán)丙沙星、慶大霉素、妥布霉素特異耐藥中起重要作用[32]。大腸埃希菌UPEC 和K-12菌株中編碼解旋酶樣蛋白的rapA基因缺失突變后，其生物膜結(jié)構(gòu)正常但耐藥性下降，可提高對(duì)青霉素G的敏感性，而對(duì)浮游細(xì)菌的耐藥性無(wú)影響。這種突變株中有22種基因下調(diào)表達(dá)，包括編碼MDR外排泵YhcQ的基因。yhcQ基因在rapA突變株中低水平表達(dá)，表明RapA誘導(dǎo)生物膜形成的同時(shí)可提高yhcQ基因表達(dá)水平[33]。

綜上所述，外排泵在生物膜形成及生物膜介導(dǎo)耐藥機(jī)制中起重要作用。臨床實(shí)踐中，細(xì)菌在醫(yī)療器械如呼吸機(jī)和各種體內(nèi)植入物表面、感染部位形成生物膜一直是抗生素治療的難題。因此，研究細(xì)菌生物膜介導(dǎo)耐藥、外排泵介導(dǎo)耐藥及細(xì)菌生物膜與外排泵的內(nèi)在聯(lián)系非常必要。細(xì)菌外排泵不僅與細(xì)菌耐藥性有關(guān)，還與細(xì)菌生物膜形成息息相關(guān)。耐藥外排泵的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)均可能改變細(xì)菌生物膜的形成。反之，形成生物膜的細(xì)菌又通過(guò)外排泵依賴和非依賴途徑介導(dǎo)耐藥。但并非所有外排泵抑制劑均對(duì)生物膜形成有抑制作用。外排泵通過(guò)何種信號(hào)分子而改變細(xì)菌生物膜形成能力至今尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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Research progress on bacterial multidrug efflux pumps and biofilm formation

CHEN Xiaoyan, PAN Jue

Department of Respiration, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Abstract:Multidrug-resistant bacteria and pan-drug resistant bacteria are major clinical concerns associated with misuse and abuse of antibiotics. The multidrug efflux pumps and biofilm formation, two mechanisms of drug resistance, are catching more attentions recently. Studies demonstrated that some efflux pumps in different bacteria influence biofilm formation, which in turn changes the gene expression of efflux pumps, indicating a possible interaction between multidrug efflux pumps and biofilm formation.

Key words:Multidrug efflux pump; Biofilm formation; Outer membrane factor

基金項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題(201440394)

通信作者：潘玨

Corresponding author. PAN Jue, E-mail: jue.pan@yahoo.com

(收稿日期：2016-02-19)