發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒中和抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗方法的建立及應(yīng)用

劉丹丹，焦永軍，章倩云，李志鋒，祁賢，宋勇春

1. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210093； 2. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009

·論著·

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒中和抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗方法的建立及應(yīng)用

劉丹丹1，焦永軍2，章倩云1，李志鋒2，祁賢2，宋勇春1

1. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210093； 2. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心，南京 210009

摘要：本文旨在對發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)患者中和抗體進(jìn)行定性和效價評估，建立中和抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。用96孔微量培養(yǎng)板培養(yǎng)非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero-E6)并接種發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)，以抗核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)單克隆抗體為一抗，使用間接ELISA檢測SFTSV NP，根據(jù)光密度(optical density，OD)判斷陽性孔數(shù)，采用Reed-Muench方法計算病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)，以反映SFTSV在Vero-E6細(xì)胞中的復(fù)制水平。ELISA檢測中和抗體作用后的病毒殘余量，可間接反映中和抗體的作用效果并進(jìn)行定量。應(yīng)用以上建立的微量中和-ELISA對10例SFTS患者的雙份血清進(jìn)行中和抗體效價測定，8例患者恢復(fù)期血清效價較急性期增高4倍以上，7份患者恢復(fù)期血清效價達(dá)1∶1 280，急性期血清效價最高為1∶640。結(jié)果提示，本研究建立的ELISA操作簡便，結(jié)果判定客觀，所需時間短，可用于臨床血清抗體診斷，也可用于血清流行病學(xué)調(diào)查和疫苗效果臨床評價等。

關(guān)鍵詞：發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒；酶聯(lián)免疫吸附試驗；中和抗體

發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)[1]是我國近年來出現(xiàn)的一種新的病毒性傳染病，已在多省市出現(xiàn)，多分布于山地或丘陵地區(qū)的農(nóng)村。在日本、韓國、美國也發(fā)現(xiàn)了相似病例。該病可引起發(fā)熱、白細(xì)胞和血小板減少、消化道癥狀等，嚴(yán)重者可致死亡[2-3]。其病原體為發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)，分類上屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬。病毒顆粒呈球形，直徑80～100 nm，外有脂膜包被，基因組包含大(large，L)、中(middle，M)、小(small，S)3個單股負(fù)鏈RNA片段。其中L片段編碼RNA依賴的RNA聚合酶，M片段編碼表面糖蛋白Gn和Gc，S片段以雙向方式編碼病毒核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，NP)和非結(jié)構(gòu)(nonstructural，NS)蛋白[4]。實驗室診斷方法主要有病毒分離、核酸分子檢測和血清抗體檢測等[5-6]。血清抗體水平在流行病學(xué)研究、疫苗免疫效果評價、臨床診斷等方面均有重要意義，但針對血清中和抗體的檢測還缺乏快速、有效的方法。本研究利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)的特異性及敏感性，建立了一種新布尼亞病毒中和抗體的間接檢測方法。

1材料與方法

1.1血清樣本

臨床上診斷為SFTS的患者血清樣本20份(恢復(fù)期、急性期各10份)來自江蘇省疾病預(yù)防控制中心。

1.2病毒

SFTSV毒株JS-2010-014由江蘇省疾病預(yù)防控制中心分離保存。

1.3細(xì)胞、主要試劑及儀器

非洲綠猴腎細(xì)胞系(Vero-E6)由江蘇省疾病預(yù)防控制中心保存。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)-胰酶、雙抗生素、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)均購自美國Gibco公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，脫脂奶粉購自美國Bio-Rad公司，TMB Substrate Kit購自美國Thermo公司，平底96孔、24孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Costar公司，自動洗板機(jī)購自瑞士TECAN公司，酶標(biāo)儀購自安圖綠科生物工程有限公司。

1.4NP單克隆抗體制備

設(shè)計引物，用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)擴(kuò)增SFTSV毒株JS-2010-014 NP編碼基因，克隆至表達(dá)載體pET-28a(+)(Novagen公司)。將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-NP轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)[7]，純化后的NP與免疫佐劑混合，按常規(guī)方法免疫Balb/c小鼠，篩選高效價的SFTSV NP特異性單克隆抗體。

1.5病毒增殖

將Vero-E6細(xì)胞傳代至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)，待其生長至單層且覆蓋率為80%左右時，棄培養(yǎng)上清液；PBS洗2～3次，每孔加200～400 μL SFTSV液，37 ℃、5% CO2靜置吸附1～2 h，每0.5 h輕輕搖晃一次；吸附完成后棄病毒液，每孔加1 mL含2% FBS的DMEM維持液，37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)4～7 d；-70 ℃反復(fù)凍融2次，收集并分裝至1.5 mL離心管中，-70 ℃保存。

1.6ELISA檢測

將SFTSV于96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板A1～A10孔中進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，稀釋度為10-1～10-10，A12孔加入等量細(xì)胞維持液作為空白對照；每孔加入密度為1.5×105個/mL的Vero-E6細(xì)胞懸液100 μL，每個稀釋度及空白對照均設(shè)4個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)；棄培養(yǎng)上清液，PBS洗2次，每孔加100 μL 80%冷丙酮(PBS配制)固定10 min，室溫干燥后PBS洗3次，除去殘余丙酮，加入封閉液(5%脫脂牛奶)稀釋(1∶7 000)的鼠抗SFTSV NP單克隆抗體100 μL，37 ℃孵育1 h；用含吐溫20的PBS(PBS with Tween 20，PBST)洗4次，室溫干燥后加入封閉液稀釋(1∶5 000)的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG 100 μL，37 ℃孵育0.5 h；PBST洗6次，室溫干燥后加入顯色液50 μL，室溫靜置5～10 min，待其充分顯色后加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀450 nm波長測光密度(optical density，OD)值。

1.7病毒增殖曲線檢測

取7塊96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行上述處理，37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288 h停止培養(yǎng)，用上述ELISA方法進(jìn)行檢測。

1.8病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose，TCID50)測定

取96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行上述處理，37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)，于168 h停止培養(yǎng)，用上述ELISA方法進(jìn)行檢測。

1.9中和抗體檢測

用所建立的ELISA對10例SFTS患者急性期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本進(jìn)行微量中和抗體檢測。于96孔板中將待檢血清從1∶10開始進(jìn)行2倍連續(xù)稀釋至1∶1 280，每個稀釋度加入50 μL 100 TCID50病毒液，同時設(shè)立血清陽性對照、血清陰性對照、細(xì)胞陽性對照(細(xì)胞與100 TCID50病毒液混合培養(yǎng))和細(xì)胞陰性對照(細(xì)胞與細(xì)胞維持液混合培養(yǎng))。將血清與病毒充分混勻后于37 ℃、5% CO2靜置作用1 h，然后加入密度為1.5×105個/mL的Vero-E6細(xì)胞懸液100 μL，輕輕振蕩，充分混勻后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)96 h，用上述ELISA方法進(jìn)行檢測。血清陽性對照為SFTS患者恢復(fù)期血清，血清陰性對照為健康人血清，兩份血清對照樣本均經(jīng)雙抗原夾心ELISA檢測[7]，陽性血清對照抗體效價為1∶1 280，陰性血清對照的結(jié)果為陰性。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理

以實驗組平均OD值/空白對照平均OD值≥2.1判斷為陽性[8]，根據(jù)ELISA結(jié)果判斷各稀釋度的陽性孔數(shù)和陰性孔數(shù)，采用Reed-Muench方法計算病毒TCID50。用GraphPad Prism6.0軟件作圖，橫坐標(biāo)為病毒增殖時間，縱坐標(biāo)為各時間點病毒TCID50。中和試驗結(jié)果通過細(xì)胞半數(shù)感染閾值[9]判斷：細(xì)胞半數(shù)感染閾值=(細(xì)胞陽性對照平均OD值-細(xì)胞陰性對照平均OD值)/2+細(xì)胞陰性對照平均OD值。每孔OD值低于閾值時，判定為中和試驗反應(yīng)陽性，中和反應(yīng)陽性的血清最高稀釋度即為血清的中和抗體效價。

2結(jié)果

2.1病毒增殖曲線及TCID50測定

ELISA結(jié)果顯示(圖1)，SFTSV可在Vero-E6細(xì)胞內(nèi)有效增殖，0～216 h內(nèi)病毒TCID50呈總體上升趨勢，病毒滴度不斷增加。接種后24 h ELISA即可檢出病毒，216 h病毒增殖進(jìn)入平臺期，TCID50達(dá)10-6。

圖1不同時間病毒TCID50

Fig.1The virus TCID50at different time points

2.2患者標(biāo)本檢測

應(yīng)用建立的ELISA檢測10例SFTS患者急性期和恢復(fù)期雙份血清的中和抗體效價。結(jié)果顯示，2例患者急性期中和抗體為陰性，但恢復(fù)期中和抗體效價顯著增加，分別為1∶320、1∶640。另外8例患者急性期及恢復(fù)期血清中均可檢測到中和抗體，急性期效價最低為1∶10，最高為1∶640；恢復(fù)期效價則顯著增高，其中7份樣本效價升高至1∶1 280，1份為1∶640。10份樣本中有8份恢復(fù)期效價較急性期增高4倍以上，表示為新近感染者(表1)。

表1ELISA檢測10例患者雙份血清抗體效價

Tab.1Serum antibody titers detected with ELISA

SerumNo.OnsetdateDateofbloodcollection(acutephase)TiterofneutralizingantibodyAcutephaseRecoveryphase1--<101∶3202--<101∶6403May5,2014May23,20141∶3201∶6404April22,2013April27,20131∶401∶12805June12,2013June17,20131∶6401∶12806June17,2013June24,20131∶1601∶12807July9,2013July15,20131∶201∶12808August2,2013August9,20131∶401∶12809April13,2014April15,20141∶801∶128010April22,2014April29,20141∶101∶1280

3討論

SFTSV特異性血清抗體檢測在實驗室診斷、血清流行病學(xué)調(diào)查等方面均有重要作用，目前已建立多種血清抗體檢測方法。NP是病毒顆粒中含量最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，具有很強(qiáng)的免疫原性，感染早期即能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng)。Jiao等[7]通過體外表達(dá)NP建立了雙抗原夾心ELISA，可對人和多種動物的NP總抗體進(jìn)行檢測。Yu等[10]建立了基于NP檢測SFTSV特異性IgG和IgM抗體的間接ELISA。陳堃等[11]以基因重組表達(dá)的NP作為抗原，建立了檢測SFTSV IgG抗體的ELISA。然而，NP主要參與病毒轉(zhuǎn)錄及復(fù)制過程，不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此上述方法不能用于中和抗體的檢測[12]。此外，也有通過制備全病毒抗原片段建立間接免疫熒光法而對特異性IgG和IgM抗體進(jìn)行檢測的報道[13]，能檢測總抗體，但不能區(qū)分中和抗體，且結(jié)果主觀性強(qiáng)，實驗過程影響因素多。

一般認(rèn)為，布尼亞病毒的中和抗體主要由糖蛋白(Gn和Gc)誘導(dǎo)產(chǎn)生。病毒感染過程中，糖蛋白通過受體識別介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的吸附和融合過程[14]。微量中和試驗是目前常用的病毒中和抗體檢測方法。除DH28細(xì)胞外，SFTSV感染的多數(shù)宿主細(xì)胞(如Vero、Vero-E6、L929等)產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)不明顯，因此通過觀察CPE判定病毒是否增殖有一定困難。目前主要通過間接免疫熒光測定病毒滴度和判定微量中和試驗終點。Yu等[1]通過熒光抗體等建立了檢測SFTSV中和抗體的微量中和試驗，一般需在病毒培養(yǎng)至12 d時進(jìn)行，耗時較長，且存在操作繁瑣、觀察困難、敏感性差、結(jié)果判定主觀性較強(qiáng)、定量結(jié)果不理想、不適合大量標(biāo)本檢測等問題。本研究以抗NP鼠源單克隆抗體為一抗，建立間接ELISA，檢測SFTSV NP，改進(jìn)了病毒微量中和試驗終點判定方法。該ELISA通過檢測病毒NP的特異性抗體IgG，可直接反映病毒液中的病毒含量，特異度和靈敏度較高；檢測結(jié)果通過OD值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的客觀判定，可對病毒含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，從而消除了判定過程中的人為主觀因素。此外，在病毒培養(yǎng)第6天就可進(jìn)行中和抗體檢測，大大縮短了時間，同時能對大量標(biāo)本進(jìn)行檢測。

本研究通過建立的ELISA方法檢測了SFTS患者血清與病毒作用后的增殖狀況，間接反映患者血清抗體中和病毒的能力，可用于病毒中和抗體的定量檢測，對臨床上評估重癥患者的病情發(fā)展有重要參考價值。該ELISA方法最早可在患者發(fā)病2 d內(nèi)檢出中和抗體，且恢復(fù)期中和抗體效價明顯高于急性期，表明患者在恢復(fù)期已產(chǎn)生高效價中和抗體，在清除病毒和疾病康復(fù)過程中起了關(guān)鍵作用。但由于條件限制，本研究尚存在不足之處，如只對10例患者雙份血清進(jìn)行了檢測，缺少多種方法比較和大量樣本的驗證，尚需進(jìn)一步探討。

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Detection of neutralizing antibodies against severe fever with thrombocytopenia syndrome virus with enzyme-linked immunosorbent assay-based endpoint assessment

LIU Dandan1, JIAO Yongjun2, ZHANG Qianyun1, LI Zhifeng2, QI Xian2, SONG Yongchun1

1. School of Life Science, Nanjing University, Nanjing 210093, China; 2. Jiangsu Provincial Center for Disease Prevention and Control, Nanjing 210009, China

Abstract:An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method was developed for the detection of neutralizing antibodies against severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTSV). Vero-E6 cells in a 96-well micro-plates were challenged with SFTSV first, and then subjected to the treatment with an anti-nucleocapsid protein (SFTSV-NP) monoclonal antibody at different concentrations. The 50% tissue culture infective dose (TCID50) was calculated with Reed-Muench method. 10 double serum samples collected at two different stages of infection were subjected to the assay. 8 specimens demonstrated higher (>4 times) antibody levels in the recovery phase than that in the acute phase. In conclusion, the established ELISA method is specific, operation friendly and with an application potential for clinical research.

Key words:Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus; Enzyme-linked immunosorbent assay; Neutralizing antibody

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31570926)，江蘇省自然科學(xué)基金(BK20131450)，江蘇省醫(yī)學(xué)重點人才基金(RC2011084)

通信作者：祁賢，宋勇春

Corresponding authors. QI Xian, E-mail: qixiansyc@hotmail.com; SONG Yongchun, E-mail: songych@nju.edu.cn

(收稿日期：2015-12-17)