2014年甘肅省部分地區(qū)蚊蟲及蚊媒病毒調(diào)查

于德山，崔世恒，付士紅，曹蕾，曹玉璽，陳生邦，李國太，蔣建祥，梁國棟

1. 甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 730000； 2. 青島大學(xué)，青島 266071； 3. 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

*同為第一作者

2014年甘肅省部分地區(qū)蚊蟲及蚊媒病毒調(diào)查

于德山1,*，崔世恒2,*，付士紅3,*，曹蕾3，曹玉璽3，陳生邦1，李國太1，蔣建祥1，梁國棟3

1. 甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 730000； 2. 青島大學(xué)，青島 266071； 3. 中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206

摘要：為調(diào)查甘肅省部分地區(qū)蚊蟲及蚊媒病毒的種類及分布，本課題組2014年在甘肅省酒泉市和隴南市地區(qū)共采集蚊蟲4 412只。酒泉市共采集蚊蟲2屬3種2 833只，其中背點伊蚊(Aedes dorsalis)2 665只(94.1%)、刺擾伊蚊(Aedes vexans)150只(5.3%)、淡色庫蚊(Culex pipiens pallens)18只(0.6%)；隴南市共采集2屬2種1 579只蚊蟲，其中淡色庫蚊1 451只(91.9%)、中華按蚊(Anopheles sinensis)128只(8.1%)。經(jīng)實驗室常規(guī)處理后，將蚊蟲標(biāo)本分為96批，接種于C6/36、BHK和Vero細(xì)胞，進(jìn)行病毒分離和多種病毒基因特異性擴(kuò)增檢測。結(jié)果顯示，96批蚊蟲標(biāo)本在3種細(xì)胞中均未出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，在18批蚊蟲標(biāo)本研磨液中檢測到遼寧病毒(Liaoning virus，LNV)基因陽性。病毒核苷酸序列的遺傳進(jìn)化分析顯示，在甘肅省檢測到的遼寧病毒與此前在我國新疆維吾爾自治區(qū)發(fā)現(xiàn)的遼寧病毒親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞：甘肅省；酒泉市；隴南市；蚊蟲；蚊媒病毒；遼寧病毒

蟲媒病毒是指由吸血節(jié)肢動物傳播的病毒，可引起發(fā)熱、出血、腦炎、失明、孕畜流產(chǎn)等人獸共患病[1]。已證實蟲媒病毒傳播的媒介有586種[2]，其中300余種為蚊蟲。蚊媒病毒分布廣，在全球大多數(shù)地區(qū)有分布[3]，其中黃熱病病毒曾是世界性公共衛(wèi)生問題，給人類健康和經(jīng)濟(jì)帶來了嚴(yán)重危害[4]。

自20世紀(jì)50年代以來，我國主要有4種蟲媒病毒病存在和流行，即流行性乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒(又稱春夏季腦炎病毒)、新疆出血熱病毒(又稱克里米亞-剛果出血熱病毒)、登革病毒[5]。近年來在我國發(fā)現(xiàn)了一些新的蟲媒病毒及其感染疾病，如西尼羅病毒及其群體性病毒性腦炎的流行[6]、辛德畢斯病毒及其臨床感染病例[7]。

甘肅省地處我國西北部，位于青藏高原、黃土高原和內(nèi)蒙古高原的交界處。此前曾在甘肅省東南地區(qū)(天水市、隴南市)分離到乙型腦炎病毒、蓋塔病毒和版納病毒[8]，在甘肅省中部地區(qū)(白銀市)分離到乙型腦炎病毒[9]，在甘肅省西北部河西走廊地區(qū)分離到遼寧病毒(Liaoning virus, LNV)[10]。隴南市位于甘肅省東南部，地處北亞熱帶，降水充足，適宜蚊蟲滋生。自2006年以來，該地區(qū)未進(jìn)行蚊蟲及蚊媒病毒調(diào)查。而酒泉市位于甘肅省西北部地區(qū)，屬于大陸性干旱氣候，未進(jìn)行過系統(tǒng)的蟲媒病毒調(diào)查。鑒于此，本研究調(diào)查了近10年來隴南地區(qū)蚊蟲及蚊媒病毒的種類與分布變化，還首次對酒泉地區(qū)蚊蟲及蚊媒病毒的種類與分布進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查。

1材料與方法

1.1蚊蟲標(biāo)本的采集

用誘蚊誘卵器和功夫小帥牌誘蚊燈(武漢市吉星環(huán)?？萍加邢挢?zé)任公司)進(jìn)行蚊蟲采集。采集時間為當(dāng)日19∶00至次日凌晨7∶00左右，采集地點為動物圈、房舍旁等。將蚊蟲標(biāo)本在低溫下進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類，每50只分為一管，編號登記，并放入液氮中保存，用干冰轉(zhuǎn)移至實驗室。

1.2蚊蟲標(biāo)本的實驗室處理

將每批蚊蟲標(biāo)本轉(zhuǎn)移至離心管中，加入1 mL組織培養(yǎng)液，封閉后放入TissueLyser振蕩器(Qiagen公司)，震蕩2.5 min，然后4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，小心吸除上清液，冰浴保存。

1.3組織培養(yǎng)細(xì)胞

金黃地鼠腎細(xì)胞(BHK-21細(xì)胞)、非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)和白紋伊蚊卵細(xì)胞(C6/36細(xì)胞)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所提供。其中C6/36細(xì)胞置于28 ℃孵育箱中培養(yǎng)，BHK和Vero細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。

1.4病毒分離

取離心后的蚊蟲研磨液各100 μL，分別接種于BHK-21、Vero和C6/36細(xì)胞，于37 ℃和28 ℃孵育箱中培養(yǎng)。每隔12 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)CPE并達(dá)細(xì)胞總量的75%時，收集細(xì)胞，-20 ℃反復(fù)凍融3次，將每批蚊蟲上清液在3種細(xì)胞中盲傳3代，無病變者視為病毒分離結(jié)果陰性。

1.5病毒核酸提取及cDNA文庫制備

使用QIAamp?Viral RNA試劑盒(Qiagen公司)對蚊蟲研磨液進(jìn)行RNA提取，操作見試劑盒說明書。使用ready-to-go試劑盒(GE Healthcare公司)對每份蚊蟲標(biāo)本研磨上清液進(jìn)行cDNA文庫制備，標(biāo)本凍存于低溫冰箱。

1.6病毒基因的特異性檢測

使用GOTaq?Green MIX PCR擴(kuò)增試劑(Promega公司)，利用表1中的引物[11-14]，對蚊蟲cDNA文庫進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR)擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。對陽性結(jié)果進(jìn)行DNA測序。

1.7測序結(jié)果分析

采用ClastalX 1.8軟件對測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，MEGA 6.0軟件制作基因系統(tǒng)發(fā)生樹，MegAlign軟件分析核酸與氨基酸的同源性[15]。

2結(jié)果

2.1蚊蟲標(biāo)本采集

2014年7月在甘肅省隴南市及酒泉市(圖1)進(jìn)行蚊蟲采集工作。隴南市位于甘肅省東南地區(qū)(N33°40′，E104°92′)，海拔900～2 500 m；酒泉市位于甘肅省西北部(N39°44′，E98°31′)，海拔200～5 700 m。隴南市采集點選在房舍、動物圈旁，酒泉市采集點選在豬圈旁。兩地共采集蚊蟲4 412只，剔除雄蚊，并經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，隴南市共采集2屬2種1 579只蚊蟲，其中淡色庫蚊1 451只(91.9%)、中華按蚊128只(8.1%)，表明淡色庫蚊是當(dāng)?shù)貎?yōu)勢蚊種；酒泉市共采集蚊蟲2屬3種2 833只，其中淡色庫蚊18只(0.6%)、背點伊蚊2 665只(94.1%)、刺擾伊蚊150只(5.3%)，表明背點伊蚊是當(dāng)?shù)貎?yōu)勢蚊種(表2)。

表1本研究所用引物

Tab.1Primers used in this study

引物名稱擴(kuò)增區(qū)段引物序列(5'-3')引用文獻(xiàn)屬特異性 引物黃病毒屬布尼亞病毒屬甲病毒屬FU1CFD2BUPBDWM2WcM3WM2W2NS5(310bp)S(251bp)NSP1(434/310bp)TACCACATGATGGGAAAGAGAGAGAAGTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGCATGACTGAGTTGGAGTTTGATGTCGCTGTTCCTGTTGCCAGGAAAATYAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHWACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCC- DAYCCTGYCCNVTGMDNWSYVCNGARGAYCC[11][11][11]種特異性 引物GETE病毒遼寧病毒OYA病毒西藏環(huán)狀病毒版納病毒TYMONS3FNS3RLNV12s1LNV12r1OYA-11FOYA-2R6-4-2F6-4-2RBAV-12-854-SBAV-12-B2-RCuTLV-FCuTLV-RNS3(810bp)12S(435bp)NS(310bp)4S(848bp)12S(850bp)RDRP(400bp)CTTTCAGAGAGGACAGAGCGTCTCTTCTGCCGTTATCAAAGTTAGCACTGGCTCCGGCTGTAGTAACAGCTGTTCGGATCATCTGGAATTTGAGGTTAATAACCATTTTCCCCAACCTTCCTCATGAAGTTGACACGACAGACCAAAAGATATTCAACACGTAATCCAATAAAATTGATAGYGYTTGCGTAAGACGTTCTAAATTGGATACGGCGTGCTTTTCTGTGGCTATCTATTGGGCGTACAAGGAATCCGATGCTAGG[11][12][13][14][11]-

TYMO virus primer is self-designed and verified by RT-PCR.

圖12014年甘肅省蚊蟲采集分布圖

Fig.1Mosquito collection sites in Gansu Province, 2014

表22014年甘肅省不同采集點蚊蟲采集背景

Tab.2Background information of mosquito sample collection in Gansu Province, 2014

采集點蚊種中華按蚊數(shù)量(只)百分比淡色庫蚊數(shù)量(只)百分比背點伊蚊數(shù)量(只)百分比刺擾伊蚊數(shù)量(只)百分比合計數(shù)量(只)百分比隴南市稻圭村00611.38%0000611.38%黃鹿壩村60.14%58313.21%000058913.35%馬營村1222.76%80718.29%000092921.06%酒泉市拐壩村00180.41%106524.14%00108324.55%南壩村0000100022.67%00100022.67%瓜州000060013.60%1503.40%75016.99%合計1282.90%146933.30%266560.40%1503.40%4412100%

2.2病毒分離

將96批蚊蟲標(biāo)本研磨液分別接種至BHK、Vero和C6/36細(xì)胞，每批標(biāo)本連續(xù)觀察1周，與對照細(xì)胞相比，未見明顯CPE。

2.3病毒基因檢測

2.3.1病毒核酸檢測以96批蚊蟲研磨液制備的cDNA文庫為基因擴(kuò)增模板，用9種病毒(屬)基因擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示，布尼亞病毒、黃病毒和甲病毒屬引物擴(kuò)增均為陰性，GETE病毒、OYA病毒、西藏環(huán)狀病毒、版納病毒、TYMO病毒特異性引物擴(kuò)增也呈陰性，僅LNV特異性引物擴(kuò)增呈陽性。18批蚊蟲研磨液為LNV基因擴(kuò)增陽性，相應(yīng)標(biāo)本在C6/36細(xì)胞培養(yǎng)上清液中也呈LNV陽性(表3)。其中隴南市采集的中華按蚊中4批LNV陽性，占4.2%(4/96)；淡色庫蚊中11批LNV陽性，占11.5%(11/96)。酒泉市采集的淡色庫蚊中1批LNV陽性，占1.0%(1/96)；背點伊蚊中2批LNV陽性，占2.1%(2/96)。

表32014年甘肅省蚊媒病毒基因檢測

Tab.3Mosquito-borne arbovirus gene detection in Gansu Province, 2014

引物cDNA蚊蟲研磨液中華按蚊隴南市淡色庫蚊隴南市酒泉市背點伊蚊酒泉市刺擾伊蚊酒泉市C6/36細(xì)胞上清液中華按蚊隴南市淡色庫蚊隴南市酒泉市背點伊蚊酒泉市刺擾伊蚊酒泉市遼寧病毒4/611/311/12/550/34/611/311/12/550/3版納病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3西藏環(huán)狀病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3GETE病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3TYMO病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3OYA病毒0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3布尼亞病毒屬0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3黃病毒屬0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3甲病毒屬0/60/310/10/550/30/60/310/10/550/3

2.3.2病毒核酸序列進(jìn)化分析對18批LNV基因檢測陽性標(biāo)本進(jìn)行LNV第12片段基因的核酸序列擴(kuò)增和測序，經(jīng)BLAST對比證明所有病毒株均為LNV。登錄GenBank查詢其他地區(qū)LNV DNA序列(表4)，并與本研究對比(圖2)。結(jié)果顯示這些LNV病毒株分兩型，其中1997年遼寧NE97-31為Ⅰ型，其他毒株為Ⅱ型。這18株陽性分離株處于同一進(jìn)化分支，與遼寧NE97-12[16]、新疆HM745537-B9、新疆HM745559-J60[17]株的同源性最高，達(dá)95%以上。與新疆HM745538-B10[9]的同源性次之。

表4本研究所用遼寧病毒毒株的序列信息

Tab.4Sequence information of the Liaoning virus strains used in this study

基因地區(qū)病毒株GenBank號采集地點年份宿主第12片段新疆HM745559-J60HM745537-B9HM745538-B10HM745559HM745537HM745538豬圈2006庫蚊遼寧NE97-12NE97-31AY701350AY317110豬圈1997背點伊蚊

圖2新分離病毒第12片段基因系統(tǒng)發(fā)生樹

Fig.2Phylogenetic trees of the 12th segment of Liaoning virus isolates

3討論

本研究在酒泉市和隴南市開展蚊蟲及蚊媒病毒調(diào)查工作，共采集蚊蟲4 412只，其中中華按蚊占2.90%(128只)、淡色庫蚊占33.30%(1 469只)、背點伊蚊占60.40%(2 665只)、刺擾伊蚊占3.40%(150只)。酒泉市背點伊蚊占酒泉市蚊蟲總數(shù)的94.1%，隴南市淡色庫蚊占隴南市蚊蟲總數(shù)的91.9%，可見背點伊蚊和淡色庫蚊分別是酒泉市和隴南市的優(yōu)勢蚊種。背點伊蚊為干旱草原的主要蚊種[18]，這與酒泉市干燥少雨的大陸性干旱氣候條件相吻合；而隴南市部分地區(qū)屬于亞熱帶氣候，長期水分充足，適宜幼蟲在污水中滋生的淡色庫蚊大量繁殖，與2007—2008年的蚊蟲調(diào)查結(jié)果一致，表明近幾年當(dāng)?shù)匚孟x種群結(jié)構(gòu)變化不大。在兩地還分別發(fā)現(xiàn)了刺擾伊蚊和中華按蚊，表明當(dāng)?shù)匚孟x種群復(fù)雜多樣，應(yīng)加強滅蚊、防蚊技能及相關(guān)疾病的防治宣傳，提高人們防蚊、滅蚊和預(yù)防疾病的意識。

本研究用RT-PCR共檢出18株LNV陽性分離株，隴南市15株、酒泉市3株。其中隴南市淡色庫蚊11株、中華按蚊4株；酒泉市背點伊蚊2株、淡色庫蚊1株。這是繼2014年在河西走廊地區(qū)發(fā)現(xiàn)LNV以來再次在甘肅省蚊蟲中發(fā)現(xiàn)，且在甘肅省東南地區(qū)和西北地區(qū)同時檢測到，充分表明加強甘肅省蟲媒病毒檢測及相關(guān)媒介調(diào)查相當(dāng)必要。

研究顯示我國LNV主要分布在高緯度地區(qū)，如新疆維吾爾自治區(qū)、青海省、山西省和遼寧省，且主要在庫蚊和背點伊蚊中分離到[19]。本研究在甘肅省發(fā)現(xiàn)LNV，再次證明了LNV的高緯度分布特征；不僅從庫蚊和背點伊蚊中分離到LNV，還首次從中華按蚊中分離到，為以后開展蚊蟲調(diào)查提供了重要參考依據(jù)。

LNV屬于新分離的12節(jié)段雙鏈RNA病毒，在國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第8次報告中被歸為Seadorna病毒屬[20]。據(jù)文獻(xiàn)報道，小鼠感染LNV后出現(xiàn)軟弱無力，再次感染可導(dǎo)致出血、死亡[16]。雖還未有報道稱LNV可致人獸患病及死亡，但其對人獸有潛在的威脅，因此對LNV的調(diào)查必不可少。

從基因進(jìn)化方向來看，本研究中18株LNV位 于同一進(jìn)化分支，與新疆HM745537-B9、HM745559-J60和 HM745538-B10株及遼寧NE97-12株的同源性達(dá)95%以上，可能為LNV進(jìn)化方向及地域傳播方向的研究提供重要依據(jù)。

綜上所述，應(yīng)深化隴南市和酒泉市兩地蚊蟲防治工作，加大蚊媒病毒的宣傳，提高人們的認(rèn)知程度及加強相關(guān)疾病的預(yù)防。

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Investigation of mosquitoes and mosquito-borne arboviruses in Gansu Province，China

YU Deshan1,*, CUI Shiheng2,*, FU Shihong3,*, CAO Lei3, CAO Yuxi3, CHEN Shengbang1, LI Guotai1, JIANG Jianxiang1, LIANG Guodong3

1. Gansu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Gansu 730000, China; 2. Qingdao University, Qingdao 266071, China; 3. Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China

Abstract:The purpose of the current study is to investigate the distribution of mosquitoes and mosquito-borne arboviruses in Gansu Province. The mosquitoes were collected from Jiuquan and Longnan in 2014. 2 833 mosquitoes were collected from Jiuquan, including Aedes dorsalis 2 665 (94.1%), Aedes vexans 150 (5.3%) and Culex pipiens pallens 18 (0.6%). 1 579 mosquitoes were collected from Longnan, including Culex pipiens pallens 1 451 (91.9%) and Anopheles sinensis 128 (8.1%). All mosquitoes were divided into 96 pools and then inoculated onto C6/36, BHK and Vero cells for virus isolation and identification. The results showed that the 96 pools of mosquitoes inoculated on three cells revealed negative cytopathic effect (CPE). Eighteen pools of the mosquito samples showed positive for Liaoning virus (LNV) detection. The genetic evolution analysis of viral nucleotide sequences showed that Liaoning virus in Gansu Province had the closest relationship with the Liaoning virus isolated in Xinjiang Uygur Autonomous Region.

Key words:Gansu Province; Jiuquan; Longnan; Mosquito；Mosquito-borne arbovirus; Liaoning virus

基金項目：國家自然科學(xué)基金(81290342)

通信作者：梁國棟

Corresponding author. LIANG Guodong, E-mail: gdliang@hotmail.com

(收稿日期：2016-02-29)

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