糞菌移植的方法學(xué)及其治療炎癥性腸病的研究進(jìn)展

向　杰　張發(fā)明　黃光明

南京醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院　南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化醫(yī)學(xué)中心(210011)

?

糞菌移植的方法學(xué)及其治療炎癥性腸病的研究進(jìn)展

向杰*張發(fā)明黃光明#

南京醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化醫(yī)學(xué)中心(210011)

摘要炎癥性腸病(IBD)是一組病因尚不明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，越來越多的證據(jù)表明腸道微生態(tài)在IBD發(fā)病中起有重要作用。糞菌移植(FMT)作為重建腸道菌群的微生態(tài)治療方法，對多種胃腸道和代謝性疾病的治療有效。本文主要針對FMT的方法學(xué)研究及其在IBD治療中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞糞菌移植；方法；腸道微生態(tài)；炎癥性腸??；治療

Advances in Methodology of Fecal Microbiota Transplantation and its Application in Treatment of Inflammatory Bowel Disease

XIANGJie,ZHANGFaming,HUANGGuangming.TheSecondClinicalMedicalCollegeofNanjingMedicalUniversity;MedicalCenterforDigestiveDiseases,theSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing(210011)

Correspondence to: HUANG Guangming, Email: hgming681@163.com

AbstractInflammatory bowel disease (IBD) is a group of chronic and nonspecific intestinal inflammatory diseases of unknown etiology. A growing body of evidence indicated that the intestinal microflora might play an important role in the pathogenesis of IBD. As a microecological therapy, fecal microbiota transplantation (FMT) has been used in various of gastrointestinal and metabolic diseases for reconstruction of intestinal flora and achieved favorable results. This article mainly reviewed the progress of technical innovation in FMT and its application in the treatment of IBD.

Key wordsFecal Microbiota Transplantation;Methods;Intestinal Microbiota;Inflammatory Bowel Disease;

Therapy

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組病因尚不十分明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)。近年來，隨著環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)的改變、抗菌藥物的廣泛使用、社會(huì)和心理壓力等多種因素的影響以及診斷技術(shù)的提高，IBD患病率逐年升高[1]。目前，越來越多的證據(jù)表明腸道微生態(tài)在IBD發(fā)病中起有重要作用，腸道菌群失調(diào)和腸黏膜屏障功能受損為IBD的發(fā)病特征，因此維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)、保護(hù)腸上皮屏障完整性成為IBD預(yù)防和治療的關(guān)鍵[2]。

糞菌移植(fecal microbiota transplantation, FMT)是一種從健康捐贈(zèng)者糞便中分離功能菌群，將其移植至患者消化道，從而重建患者腸道菌群的微生態(tài)治療方法，已被用于多種胃腸道和代謝性疾病的治療，如難治性艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)、IBD等[3-7]，被認(rèn)為可在短時(shí)間內(nèi)改變患者的腸道菌群組成[8]。本文主要針對FMT的方法學(xué)研究及其在IBD治療中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

一、FMT方法學(xué)進(jìn)展

隨著FMT在臨床上的廣泛應(yīng)用，關(guān)于其供體選擇和篩查、糞菌液制備以及移植流程等正逐漸形成一套統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。所謂的“標(biāo)準(zhǔn)化FMT”，就是在篩選合格糞便捐贈(zèng)者和選擇適宜治療對象的同時(shí)，對人性化分離菌群、量化移植細(xì)菌、規(guī)范移植流程、建立標(biāo)準(zhǔn)化糞菌庫、有效減少細(xì)菌死亡等方面進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[9-10]。

1. 供體來源：FMT的供體來源主要有兩個(gè)途徑，一是夫妻、父母、子女、密友等與受體關(guān)系密切的個(gè)體，另一個(gè)是健康捐贈(zèng)者，年齡結(jié)構(gòu)包括兒童和成人。多項(xiàng)研究證實(shí)，供體與受體間有無相關(guān)性、性別差異、新鮮或凍存菌液等因素對FMT治療CDI的臨床療效并無明顯影響[11-12]，這是建立標(biāo)準(zhǔn)化糞菌庫的重要前提條件之一。Youngster等[13]的研究結(jié)果顯示，口服源自無關(guān)供體的凍存菌液膠囊對復(fù)發(fā)性CDI患者有良好療效，總體臨床有效率達(dá)90%，且無嚴(yán)重FMT相關(guān)不良事件發(fā)生。

標(biāo)準(zhǔn)化糞菌庫有利于保存并合理利用富余的純化菌群，能有效降低FMT的推廣難度。Smith等于2012年在美國麻省理工學(xué)院建立了糞便銀行OpenBiome[13]，該機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)收集糞便、對其進(jìn)行檢測，并向美國33個(gè)州的122所醫(yī)院提供FMT所需的糞便樣本。該機(jī)構(gòu)創(chuàng)建的初衷是降低FMT成本，并使之更具安全性，以便于更廣泛的普及FMT。筆者所在的南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院已建立國內(nèi)第一家非盈利性標(biāo)準(zhǔn)化糞菌庫(www.fmtbank.org)，采用合適的保存技術(shù)將富余的純化菌群凍存于深低溫冰箱，需實(shí)施FMT時(shí)，于室溫下解凍、重懸使用。除用于本單位擇期或急診治療外，還能為外院符合FMT指征的患者提供應(yīng)急救援。

2. 供體篩查：為保證FMT的安全性和有效性，對供體進(jìn)行全方位的嚴(yán)格篩查是一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)。無論是美國的OpenBiome還是國內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)化糞菌庫，對捐贈(zèng)者執(zhí)行的篩查標(biāo)準(zhǔn)均高于獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn)。盡管目前尚無關(guān)于FMT供體篩查的指南性文件，但各研究中心的主要檢測項(xiàng)目總體上較為一致，檢測技術(shù)包括血清學(xué)、分子生物學(xué)、培養(yǎng)、顯微鏡檢等。主要檢測項(xiàng)目包括：①血常規(guī)；②血生化；③病毒學(xué)檢測，包括肝炎病毒(HAV、HBV、HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、人類T細(xì)胞病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、輪狀病毒、梅毒螺旋體等。同時(shí)，供體捐贈(zèng)前3個(gè)月內(nèi)須無抗菌藥物使用史，無自身免疫性疾病、代謝性疾病、慢性消化道疾病等亦為重要排除指標(biāo)。確定為合格捐贈(zèng)者后，糞便采集前3 d起須遵照相應(yīng)飲食指導(dǎo)進(jìn)食。

3. 糞菌液制備：傳統(tǒng)糞菌液制備方法是在完成糞便采集 后，將約50 g新鮮供體糞便樣本置于攪拌器中，加入250 mL 無菌0.9% NaCl溶液進(jìn)行初步均質(zhì)加工；再以不銹鋼濾網(wǎng)過濾去除糞便漿體中的大顆粒物質(zhì)；樣本冰上轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，在氮?dú)馍锕こ虖N內(nèi)稱重并在勻漿器中作進(jìn)一步均質(zhì)處理。

然而，傳統(tǒng)糞菌液制備方法繁瑣，消耗大量人力、物力且效率低下，無法滿足臨床需要。自動(dòng)化菌群分離設(shè)備的研發(fā)成為FMT臨床應(yīng)用和推廣的關(guān)鍵因素。2014年，由南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院張發(fā)明教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)與天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院聯(lián)合開發(fā)的智能糞菌處理系統(tǒng)GenFMTer實(shí)現(xiàn)了糞菌分離、提純過程的智能化和標(biāo)準(zhǔn)化[14]，全程質(zhì)量可控，操作過程人性化，操作人員無不適感。該系統(tǒng)從糞便收集到得到移植前最終糞菌液一般在60 min內(nèi)完成，減少了樣本在空氣中暴露的時(shí)間，使樣本中微生物活性得以最大限度地保存。目前國內(nèi)開展FMT的醫(yī)院多已配備該設(shè)備，其臨床應(yīng)用為FMT在國內(nèi)的推廣奠定了基礎(chǔ)。

4. 移植途徑：移植途徑是FMT相關(guān)研究的另一重點(diǎn)課題，現(xiàn)有移植途徑包括經(jīng)胃鏡、結(jié)腸鏡、鼻空腸管、造瘺口、灌腸等，其中灌腸可能無法解決糞菌液不能到達(dá)結(jié)腸深部，以及在腸道內(nèi)留存時(shí)間較短等問題。Agrawal等[15]的研究結(jié)果顯示，對于CDI患者，經(jīng)結(jié)腸鏡途徑的FMT緩解率最高，平均可達(dá)82.9%。2013年，Smith等研制出口服糞菌膠囊，膠囊到達(dá)腸道時(shí)釋放菌群，為無法接受胃腸內(nèi)鏡移植途徑的患者提供了治療機(jī)會(huì)[13]，該方法簡便易行，但活菌消耗、膠囊封裝技術(shù)、膠囊胃內(nèi)滯留等問題尚有待解決。對于嚴(yán)重腹瀉、結(jié)腸炎癥范圍廣泛、內(nèi)鏡插入結(jié)腸有風(fēng)險(xiǎn)或不能插入的患者，經(jīng)中消化道可能是最佳移植途徑[16]。

二、FMT在IBD中的應(yīng)用進(jìn)展

盡管FMT的應(yīng)用已有近1 700年的歷史[10]，但真正得到關(guān)注還是在其用于治療難治性CDI獲得較好療效之后。2013年，F(xiàn)MT治療被列入美國CDI臨床診治指南[17]。除CDI外，F(xiàn)MT還被嘗試用于多種疾病的治療，如IBD、腸易激綜合征(IBS)、肥胖、糖尿病、代謝綜合征等，并有成功用于腸外疾病如帕金森病、系統(tǒng)性硬化病、特發(fā)性血小板減少性紫癜等的個(gè)案報(bào)道。

自1989年Bennet等[18]首次以FMT成功治愈1例嚴(yán)重UC以來，大量證據(jù)表明FMT對IBD尤其是UC有一定治療作用，不僅能使部分患者的臨床癥狀得到改善，減少藥物用量，且長期隨訪發(fā)現(xiàn)FMT具有緩慢促進(jìn)黏膜愈合的作用[19]。一項(xiàng)系統(tǒng)綜述顯示，截至2014年5月，共有18項(xiàng)研究報(bào)道了FMT用于IBD初始治療的臨床緩解率和(或)黏膜愈合情況，其中隊(duì)列研究9項(xiàng)，病例8項(xiàng)，隨機(jī)對照研究1項(xiàng)，含UC患者79例，CD患者39例；隨訪期間患者總體臨床緩解率為45%，在納入分析的隊(duì)列研究中，UC臨床緩解率為22%，CD為60.5%，但各研究間療效差異較大[16]。有研究[20]對5例中重度活動(dòng)期難治性UC患者經(jīng)鼻空腸管和灌腸給予FMT治療，結(jié)果顯示供體菌群定植的穩(wěn)定性和療效個(gè)體差異較大，僅1例患者12周后表現(xiàn)出顯著臨床應(yīng)答，且FMT可引起發(fā)熱和一過性CRP升高。由于目前關(guān)于FMT治療UC的報(bào)道多為小規(guī)模試驗(yàn)研究，缺乏高質(zhì)量的隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)，導(dǎo)致FMT對UC的療效及其安全性的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)不足。2015年7月，《Gastroenterology》雜志同期發(fā)表了2篇關(guān)于FMT治療UC的隨機(jī)對照試驗(yàn)結(jié)果[21-22]，作者分別來自加拿大和荷蘭，無疑填補(bǔ)了這一研究領(lǐng)域缺乏高質(zhì)量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的空白。

加拿大Moayyedi等[21]的隨機(jī)對照試驗(yàn)納入75例輕中度UC患者(均排除感染性腹瀉)，隨機(jī)分為FMT組和對照組，分別接受健康匿名捐贈(zèng)者的糞便分離物50 mL和 0.9% NaCl溶液50 mL灌腸治療，每周1次，連續(xù)6周，第7周時(shí)24%的FMT組患者和5%的對照組患者獲得臨床緩解，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組間不良反應(yīng)無明顯差異。FMT組9例臨床緩解者中7例接受的糞便分離物來自同一供體，提示捐贈(zèng)者可能影響FMT療效。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)病程≤1年的UC患者臨床緩解率顯著高于病程>1年的患者(75%對17.6%)，提示初發(fā)患者更易獲得臨床緩解，對于初發(fā)患者早期采用FMT或可延長緩解期，減少復(fù)發(fā)。

荷蘭Rossen等[22]的隨機(jī)雙盲試驗(yàn)納入50例輕中度活動(dòng)期UC患者，患者隨機(jī)分為兩組，分別接受健康供體和自體FMT治療，經(jīng)鼻十二指腸管灌入糞便分離物，研究開始時(shí)和3周后各一次，結(jié)果顯示12周時(shí)30.4%的異體FMT組患者和20.0%的自體FMT組患者獲得臨床緩解，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測可能與樣本量較小有關(guān)。異體FMT組獲得臨床緩解者的腸道菌群多樣性與其健康供體高度接近。自體FMT組患者不良事件較多，包括嘔吐、發(fā)熱、腹瀉等，但未見FMT相關(guān)嚴(yán)重不良事件。

這兩項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)都肯定了FMT對UC的治療價(jià)值，但效果有別，可能與兩項(xiàng)研究的治療次數(shù)、治療劑量不同以及實(shí)驗(yàn)室方法學(xué)上的差異有關(guān)。研究討論中所強(qiáng)調(diào)的方法學(xué)問題有待在后續(xù)研究中得到明確。

1989年Borody等[23]采用FMT治療CD，結(jié)果顯示患者臨床癥狀得以緩解，療效持續(xù)4個(gè)月。多項(xiàng)個(gè)案報(bào)道中，F(xiàn)MT對經(jīng)免疫抑制劑、激素治療無效的難治性CD可誘導(dǎo)臨床和(或)內(nèi)鏡緩解，但存在復(fù)發(fā)現(xiàn)象[5-6，24]。前瞻性研究顯示FMT對CD的治療效果并不理想，4例慢性復(fù)發(fā)性CD患者接受3次FMT治療，治療結(jié)束后8周腸道菌群組成與治療前相比雖有一定差異，但并未觀察到顯著臨床療效和內(nèi)鏡下改善，且8周后所有患者的腸道菌群組成均恢復(fù)至治療前水平[25]。國內(nèi)一項(xiàng)大樣本(n=30)臨床研究[26]采用單次經(jīng)中消化道FMT治療難治性CD，結(jié)果顯示治療后1個(gè)月臨床改善率和緩解率分別為86.7%和76.7%，無特殊不良事件發(fā)生，提示FMT用于難治性CD的補(bǔ)救治療安全、有效、可行。FMT對CD的確切療效尚待開展高質(zhì)量隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)作進(jìn)一步探討。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)對于合并CDI的IBD患者，F(xiàn)MT治療會(huì)有更好的獲益[27-28]。Anderson等[29]的meta分析顯示，在8項(xiàng)應(yīng)用FMT治療IBD合并感染性腹瀉的個(gè)案/個(gè)案系列中，15例IBD合并CDI患者經(jīng)治療后均獲緩解，其中12例糞便難辨梭菌外毒素轉(zhuǎn)陰，11例腹瀉癥狀明顯緩解甚至消失。

三、結(jié)語與展望

隨著16S rRNA測序分析、宏基因組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)在腸道微生態(tài)領(lǐng)域應(yīng)用研究的深入，目前對IBD患者FMT治療前后腸道微生物群落及其功能的變化已有了較清晰的認(rèn)識，為FMT的臨床應(yīng)用提供了有效的基礎(chǔ)理論支持。后續(xù)更多高質(zhì)量隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)的開展，將為FMT的有效性和安全性提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。隨著科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)對FMT樣本制備流程相關(guān)技術(shù)革新重視程度的不斷提高，以及相關(guān)倫理準(zhǔn)則、法律法規(guī)的逐步完善，“標(biāo)準(zhǔn)化FMT”將得到廣泛推廣和應(yīng)用，使越來越多的IBD患者獲益。

參考文獻(xiàn)

1 Ananthakrishnan AN. Epidemiology and risk factors for IBD[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2015, 12 (4): 205-217.

2 Peterson CT, Sharma V, Elmén L, et al. Immune homeostasis, dysbiosis and therapeutic modulation of the gut microbiota[J]. Clin Exp Immunol, 2015, 179 (3): 363-377.

3 Damman CJ, Miller SI, Surawicz CM, et al. The microbiome and inflammatory bowel disease: is there a therapeutic role for fecal microbiota transplantation?[J]. Am J Gastroenterol, 2012, 107 (10): 1452-1459.

4 van Nood E, Vrieze A, Nieuwdorp M, et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrentClostridiumdifficile[J]. N Engl J Med, 2013, 368 (5): 407-415.

5 Kao D, Hotte N, Gillevet P, et al. Fecal microbiota transplantation inducing remission in Crohn’s colitis and the associated changes in fecal microbial profile[J]. J Clin Gastroenterol, 2014, 48 (7): 625-628.

6 Zhang FM, Wang HG, Wang M, et al. Fecal microbiota transplantation for severe enterocolonic fistulizing Crohn’s disease[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19 (41): 7213-7216.

7 Kunde S, Pham A, Bonczyk S, et al. Safety, tolerability, and clinical response after fecal transplantation in children and young adults with ulcerative colitis[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2013, 56 (6): 597-601.

8 Khoruts A, Dicksved J, Jansson JK, et al. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrentClostridiumdifficile-associated diarrhea[J]. J Clin Gastroenterol, 2010, 44 (5): 354-360.

9 Kelly CR, Kunde SS, Khoruts A. Guidance on preparing an investigational new drug application for fecal microbiota transplantation studies[J]. Clin Gastroenterol Hepatol, 2014, 12 (2): 283-288.

10張發(fā)明. 將標(biāo)準(zhǔn)化糞菌移植推向主流[J]. 中華消化內(nèi)鏡雜志, 2014, 31 (2): 61-63.

11Lee CH, Steiner T, Petrof EO, et al. FrozenvsFresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With RecurrentClostridiumdifficileInfection: A Randomized Clinical Trial[J]. JAMA, 2016, 315 (2): 142-149.

12Mellow MH, Kanatzar A. Colonoscopic fecal bacteriotherapy in the treatment of recurrentClostridiumdifficileinfection -- results and follow-up[J]. J Okla State Med Assoc, 2011, 104 (3): 89-91.

13Youngster I, Russell GH, Pindar C, et al. Oral, capsulized, frozen fecal microbiota transplantation for relapsingClostridiumdifficileinfection[J]. JAMA, 2014, 312 (17): 1772-1778.

14Cui BT, Li P, Xu LJ, et al. Fecal microbiota transplantation is an effective rescue therapy for refractory inflammatory bowel disease[J]. Inflammation & Cell Signaling, 2015, 2 (1): e757.

15Agrawal M, Aroniadis OC, Brandt LJ, et al. The Long-term Efficacy and Safety of Fecal Microbiota Transplant for Recurrent, Severe, and ComplicatedClostridiumdifficileInfection in 146 Elderly Individuals[J]. J Clin Gastroenterol, 2015 Aug 26[Epub ahead of print].

16Colman RJ, Rubin DT. Fecal microbiota transplantation as therapy for inflammatory bowel disease: a systematic review and meta-analysis[J]. J Crohns Colitis, 2014, 8 (12): 1569-1581.

17Surawicz CM, Brandt LJ, Binion DG, et al. Guidelines for diagnosis, treatment, and prevention ofClostridiumdifficileinfections[J]. Am J Gastroenterol, 2013, 108 (4): 478-498; quiz 499.

18Bennet JD, Brinkman M. Treatment of ulcerative colitis by implantation of normal colonic flora[J]. Lancet, 1989, 1 (8630): 164.

19Aroniadis OC, Brandt LJ. Fecal microbiota transplantation: past, present and future[J]. Curr Opin Gastroenterol, 2013, 29 (1): 79-84.

20Angelberger S, Reinisch W, Makristathis A, et al. Temporal bacterial community dynamics vary among ulcerative colitis patients after fecal microbiota transplantation[J]. Am J Gastroenterol, 2013, 108 (10): 1620-1630.

21Moayyedi P, Surette MG, Kim PT, et al. Fecal Microbiota Transplantation Induces Remission in Patients With Active Ulcerative Colitis in a Randomized Controlled Trial[J]. Gastroenterology, 2015, 149 (1): 102-109.e6.

22Rossen NG, Fuentes S, van der Spek MJ, et al. Findings From a Randomized Controlled Trial of Fecal Transplantation for Patients With Ulcerative Colitis[J]. Gastroenterology, 2015, 149 (1): 110-118.e4.

23Borody TJ, George L, Andrews P, et al. Bowel-flora alteration: a potential cure for inflammatory bowel disease and irritable bowel syndrome?[J]. Med J Aust, 1989, 150 (10): 604.

24Espinoza R, Quera R, Meyer L, et al. Fecal microbiota transplantation: first case report in Chile and review [Article in Spanish][J]. Rev Chilena Infectol, 2014, 31 (4): 477-482.

25Merenstein D, El-Nachef N, Lynch SV. Fecal microbial therapy: promises and pitfalls[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2014, 59 (2): 157-161.

26Cui B, Feng Q, Wang H, et al. Fecal microbiota transplantation through mid-gut for refractory Crohn’s disease: safety, feasibility, and efficacy trial results[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2015, 30 (1): 51-58.

27Privalov MA, Sizenko AK. Fecal microbiota transplantation in treatment of inflammatory bowel diseases [Article in Russian][J]. Lik Sprava, 2014 (11): 15-21.

28Barbut F, Collignon A, Butel MJ, et al. Fecal microbiota transplantation: review [Article in French][J]. Ann Pharm Fr, 2015, 73 (1): 13-21.

29Anderson JL, Edney RJ, Whelan K. Systematic review: faecal microbiota transplantation in the management of inflammatory bowel disease[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2012, 36 (6): 503-516.

(2015-05-12收稿；2015-05-17修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.02.015

*Email: 812862173@qq.com

#本文通信作者，Email: hgming681@163.com