人卵泡液蛋白質(zhì)組學的研究進展

溫曉薇，周麗霞，解軍，匡延平，柴蔚然

?

·綜述·

人卵泡液蛋白質(zhì)組學的研究進展

溫曉薇，周麗霞，解軍，匡延平，柴蔚然△

卵泡液是由卵母細胞、顆粒細胞和膜細胞等共同分泌的一種含多種蛋白質(zhì)的生物液，其作為卵母細胞生長的微環(huán)境或培養(yǎng)基，直接影響到卵泡的發(fā)育和卵母細胞的成熟。過去十幾年，對卵泡液蛋白質(zhì)組學的研究主要集中于新蛋白篩選及疾病相關(guān)蛋白等的識別上。本文從卵泡液新蛋白的篩選、年齡相關(guān)生物學標志鑒定、確定卵泡成熟標志、疾病相關(guān)標志的篩選和體外受精（IVF）成功的標志等5方面介紹近年卵泡液蛋白質(zhì)組學的相關(guān)研究。篩選和鑒定某些生殖和發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，并可能成為卵泡液中的生物標志，可用于預測卵母細胞的質(zhì)量、受精及胚胎發(fā)育潛能。

卵泡液；蛋白質(zhì)組學；生物學標記；受精，體外

【Abstract】Follicular fluid is a biological fluid containing a varity of the proteins and factors secreted by oocytes，granulosa cells and theca cells，which is important for the follicular development and oocytematuration as the medium or micro-environment of oocyte growth.Over the past ten years，the proteomic studies of follicular fluid were focused on the identification of some novel proteins and screening of disease-related proteins.In this article，five aspects related to the proteomic studies of follicular fluid were reviewed as follows:some new proteins identified from follicular fluid，the age-related biomarkers，some definite biomarkers of follicular maturation，the disease-related markers，and the biomarkers related to IVF success.It is possible that the quality of follicle and oocyte，and the potential of fertilization and embryo development，be predicted by some potential biomarkers of follicular fluid that are the key reproduction-related and（or）developemnt-related proteins screened and identified from those proteomic studies.

【Keywords】Follicular fluid；Proteomics；Biologicalmarkers；Fertilization in vitro

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：303-307）

卵泡液是人體內(nèi)由卵母細胞產(chǎn)生并包含多種蛋白質(zhì)的一種重要分泌物，其作為卵母細胞生長的培養(yǎng)基或微環(huán)境，對卵泡發(fā)育和卵母細胞的成熟發(fā)揮著重要的作用。在卵泡形成過程中，原始卵泡發(fā)育為初級生長卵泡，初級生長卵泡再發(fā)育為次級生長卵泡，原始卵泡、初級生長卵泡和次級生長卵泡也稱為竇卵泡前期。在卵泡周圍包圍著數(shù)層顆粒細胞，顆粒細胞會蓄積卵泡液，而卵泡液會隨著卵母細胞的增大而不斷增加。一般認為，卵泡液是由于卵泡在形成過程中對血漿蛋白通透性不斷增加，使得血漿蛋白跨過血-卵屏障與卵泡周圍的顆粒細胞、卵母細胞及卵泡膜細胞分泌物共同構(gòu)成的。因此，卵泡液的成分與血漿成分非常類似［1］，其可以反映顆粒細胞和膜細胞的新陳代謝活動以及卵泡滲透率的變化。卵泡液中含有多種活性成分，如生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、白細胞介素、活性氧簇（ROS）、抗凋亡因子、蛋白質(zhì)、糖以及多種類固醇激素等。這些活性成分對卵母細胞的成熟發(fā)揮著重要作用。本文旨在通過對卵泡液的蛋白質(zhì)組學相關(guān)研究進行概述，發(fā)現(xiàn)與卵母細胞發(fā)育與成熟相關(guān)的蛋白，篩選與識別影響卵母細胞質(zhì)量的潛在生物標志，以期有助于成功對卵母細胞的質(zhì)量與受孕的成功率進行預測。

1　蛋白質(zhì)組學概述

基金項目：上海市科學技術(shù)委員會科研計劃項目（15411953000，15411964500），默克雪蘭諾中國生殖醫(yī)學研究基金作者單位：200001上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院（溫曉薇，周麗霞，匡延平，柴蔚然）；山西醫(yī)科大學（解軍）通信作者：柴蔚然，E-mail：chaiwrsh@126.com

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審校者

蛋白質(zhì)組學是1995年相對于基因組學而在人類基因組計劃研究成果逐步公布后出現(xiàn)的，旨在通過對蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組學的研究而尋求基因產(chǎn)物與人類疾病之間關(guān)系的新的研究領(lǐng)域?；蚪M學即通常意義上的DNA或者RNA，指一個細胞所包含的全部遺傳信息。而蛋白質(zhì)組學不同于基因組學，其在生物體中并不是恒久不變的，在生物體中會隨著不同生長階段、不同組織器官、甚至是不同生理狀態(tài)下呈動態(tài)表達。因此，蛋白質(zhì)組學是指一個細胞所表達的全部蛋白質(zhì)的總和［2］。通常，蛋白質(zhì)組學可分為功能蛋白質(zhì)組學與結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學。功能蛋白質(zhì)組學即一般意義上的蛋白質(zhì)組學，而結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學指基因組所編碼的所有蛋白質(zhì)的總和。一種生物一般只有一種基因組，卻有不同的功能蛋白質(zhì)組［3］。理論上同一個組織或者同一類細胞中有相同或相似的蛋白質(zhì)組。而這些同組織或同類型細胞中蛋白質(zhì)組學的差異表達，為人類對相關(guān)疾病的研究提供了新的生物標志?；虻漠a(chǎn)物為蛋白質(zhì)，基因與蛋白之間遵循中心法則的規(guī)律，從DNA的自我復制，轉(zhuǎn)錄為RNA，翻譯為蛋白質(zhì)，而生物表型正是通過蛋白質(zhì)來表現(xiàn)，基因與蛋白之間密不可分。從蛋白質(zhì)的表達、氨基酸序列以及蛋白與蛋白之間相互作用來了解細胞的結(jié)構(gòu)與功能及與疾病的關(guān)系。通過對蛋白質(zhì)中氨基酸的序列與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、表達量的變化來揭示相關(guān)疾病的發(fā)生原因。同時，通過蛋白質(zhì)組學所提供的豐富數(shù)據(jù)，可為未來科學探究更多未知蛋白的功能與作用。所以，利用蛋白質(zhì)組學的方法在整體水平上對卵泡液進行分析，可以克服卵泡液中成分復雜這一障礙［4］。

2　卵泡液蛋白質(zhì)組學研究進展

卵泡液是卵泡中一種重要的且動態(tài)的組成，被稱為卵母細胞生長的微環(huán)境。在卵泡發(fā)育早期，由血漿蛋白跨過血-卵屏障與卵泡周圍的顆粒細胞、卵母細胞和卵泡膜細胞分泌物共同累積到濾泡腔所構(gòu)成的［5］，其主要成分為類固醇激素、代謝物、多糖、蛋白質(zhì)、ROS以及抗氧化物。這些物質(zhì)對顆粒細胞的增殖與分化、卵母細胞的成熟與受精至關(guān)重要。同時，這些物質(zhì)也能帶來生理損害與氧化應(yīng)激壓力。卵泡液同時還扮演著卵母細胞與卵泡細胞之間的信息傳遞者，而這對卵母細胞的發(fā)育是非常重要的。因此，對卵泡液蛋白質(zhì)組學的認識可以加深對卵泡發(fā)育過程的理解，更好地評價卵母細胞的質(zhì)量。同時，通過蛋白質(zhì)組學的方法對卵泡液成分的認識，可更好地了解卵泡發(fā)育的潛在機制。

人類蛋白質(zhì)組學研究可以尋找有用的生物標志來發(fā)現(xiàn)與治療蛋白相關(guān)疾病。目前最全面的蛋白質(zhì)組學研究是關(guān)于人類卵泡液的蛋白質(zhì)組學研究。從1996年Spitzer等［6］開啟了對人卵泡液蛋白質(zhì)組學的研究至今，卵泡液蛋白質(zhì)組學的研究已經(jīng)發(fā)展了20年。但由于最初蛋白質(zhì)組學相關(guān)技術(shù)的限制，只有少數(shù)相關(guān)蛋白能被鑒定出，并且這些蛋白的具體作用機制也并不明確。迄今，關(guān)于人類卵泡液的蛋白質(zhì)組學研究大體分為以下幾個方面。

2.1卵泡液新蛋白的篩選正常人卵泡液中含有2 000～3 000種蛋白，這些蛋白與卵泡發(fā)育和卵母細胞的成熟密不可分。由于蛋白質(zhì)組學研究的興起較晚，卵泡液中全部蛋白還未完全篩選出，且被證實的參與卵泡發(fā)育的調(diào)控蛋白只占很少部分［7］。許多未知蛋白和已知蛋白參與調(diào)節(jié)的具體過程尚不清楚，需要進一步研究。2007年李黎等［8］利用雙向凝膠電泳與質(zhì)譜技術(shù)成功篩選出5個可能與卵母細胞成熟相關(guān)的候選蛋白：免疫球蛋白G、轉(zhuǎn)鐵蛋白、載脂蛋白E、PR02044及假想蛋白，這些蛋白不僅具有誘導精子頂體反應(yīng)的作用，同時具有可結(jié)合、轉(zhuǎn)運鐵至特定的組織器官，甚至可以影響體內(nèi)的雌激素水平。而雌激素對卵泡的發(fā)育是必需的，雌激素水平的降低將不利于卵泡的發(fā)育成熟，甚至影響受孕。盡管成功鑒定出這些相關(guān)蛋白，然而并沒有對這些蛋白進行驗證與功能分析。2008年Hanrieder等［9］利用同樣技術(shù)在人成熟卵泡液中確定了69種與生殖相關(guān)的蛋白。這相對于之前的研究來說，是篩選出蛋白最多的一次研究。2013年，Lo Turco等［10］利用同位素標記的絕對和相對定量（iTRAQ）技術(shù)確定了卵泡液蛋白與血漿蛋白表達存在差異，從理論上證實了卵泡液不同于血漿，而是作為卵母細胞的微環(huán)境而發(fā)揮作用。也有研究利用該技術(shù)在卵泡液中發(fā)現(xiàn)了246種特殊蛋白，同時發(fā)現(xiàn)這些蛋白可能參與卵母細胞的成熟過程，并對這些蛋白的功能進行了簡單預測，但這些蛋白是通過何種通路來影響卵泡的，并沒有說明［11］。另有研究利用iTRAQ技術(shù)在正常人的卵泡液中鑒定出了742種蛋白，其中有329種蛋白是新發(fā)現(xiàn)的，如胰島素生長因子、胰島素生長因子連接蛋白家族、生長因子相關(guān)蛋白、受體信號和抗凋亡蛋白等，這些功能性調(diào)控因子對卵泡發(fā)育與成熟發(fā)揮著重要作用，如胰島素生長因子會影響優(yōu)勢卵泡的選擇，增加黃體生成激素（LH）受體的表達等［12］。由于技術(shù)的限制，目前發(fā)現(xiàn)的這些相關(guān)蛋白是如何影響卵母細胞的，其機制并不明確。但隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展和蛋白質(zhì)組學的日益成熟，未來可能從人卵泡液中發(fā)現(xiàn)更多的功能性蛋白并了解這些蛋白更多的生物信息。

2.2年齡相關(guān)生物學標志鑒定臨床流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，女性的不孕已經(jīng)非常普遍，而年齡是女性生育障礙的首要因素。女性在胚胎時期，原始的生殖細胞就會發(fā)育為卵原細胞，卵原細胞經(jīng)過有絲分裂后，發(fā)育為初級卵母細胞。在出生前，女性體內(nèi)大約有70萬個初級卵母細胞。這些初級卵母細胞在初級卵泡中等待著減數(shù)分裂，而這些初級卵母細胞要發(fā)育成為成熟的卵母細胞，大致需要14年左右。在女性的青春期，少數(shù)的初級卵母細胞會每個月隨著月經(jīng)周期而發(fā)生減數(shù)分裂，但通常只有一個成熟的卵子從卵巢中排出，其余的在不同發(fā)育階段凋亡、退化。出生后，女性體內(nèi)一生中只會排出約400個的成熟卵子，隨著年齡的增加，可排出的卵子越來越少，再加上環(huán)境、生活方式、疾病等因素，體內(nèi)剩余的正常卵子數(shù)會越來越少。因此，許多研究發(fā)現(xiàn)，與年齡相關(guān)的不孕癥，不僅與卵子質(zhì)量、子宮內(nèi)膜及陰道分泌物改變、女性健康水平的下降有關(guān)，同時還可能與卵泡液中相關(guān)蛋白質(zhì)含量的變化有關(guān)。因此，一些研究者將視角轉(zhuǎn)向?qū)β雅菀旱鞍踪|(zhì)組學的研究，試圖通過對卵泡液中相關(guān)蛋白的篩選，找到治療的突破口。Anahory等［13］發(fā)現(xiàn)，中年女性卵泡液中的載脂蛋白A1的表達明顯低于年輕女性，而載脂蛋白E的表達上調(diào)，其中載脂蛋白A1可作為抗氧化劑而降低卵母細胞受到損傷，提高受孕率；載脂蛋白E可能通過抑制卵泡雄性激素的合成而影響類固醇的生成。2014年Hashemitabar等［14］發(fā)現(xiàn)，年輕女性（20～32歲）與中年女性（38～42歲）的卵泡液蛋白質(zhì)中有19種蛋白存在差異，經(jīng)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，相較于年輕女性，中年女性的卵泡液中，有5種蛋白質(zhì)（血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、血液結(jié)合素、激肽原-Ⅰ、補體C3和補體C4）的表達發(fā)生下調(diào)。許多研究者都發(fā)現(xiàn)了補體蛋白在卵泡發(fā)育中的重要性，認為補體的活化可致血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的缺乏，而VEGF是卵母細胞成熟的必要因子。同時，卵泡液中還含有多種抗氧化蛋白，如血清轉(zhuǎn)鐵蛋白與血液結(jié)合素，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白可以作為鐵離子螯合劑而降低ROS的產(chǎn)生，而ROS可能會導致卵泡閉鎖而影響生育。血液結(jié)合素可作為細胞外的抗氧化物，抵抗衰老而促進卵泡發(fā)育。因此，這些相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)，不僅可以作為與年齡相關(guān)的不孕癥的生物標志，同時在未來研究中，通過對其機制的研究，可能為臨床提供新的干預措施。

2.3確定卵泡成熟標志一般認為正常成熟卵泡的直徑在18～25mm之間，而當卵泡直徑達到18mm時即認為成熟。早在1996年Spitzer等［6］利用雙向凝膠電泳技術(shù)對成熟與未成熟卵泡的卵泡液進行了分析，通過氨基酸序列的方法辨認出7種與卵泡成熟相關(guān)蛋白。隨后，Bayasula等［15］比較了成熟卵母細胞與未成熟卵母細胞的卵泡液，發(fā)現(xiàn)了二者卵泡液中有503種差異蛋白，其中53種蛋白差異明顯，最終篩選出人硫酸肝素糖蛋白（HSPG）進行驗證，確認了HSPG可以作為預測受精成功的生物標志。同時發(fā)現(xiàn)有些蛋白只在成熟的卵母細胞中表達，這個發(fā)現(xiàn)可以幫助臨床輔助生殖中更加精確地辨別卵母細胞的成熟［16］。Estes等［17］分析小于32歲女性的卵泡液發(fā)現(xiàn)，11種蛋白在卵母細胞大于11mm和小于11mm的卵泡液中存在明顯差異，發(fā)現(xiàn)結(jié)合珠蛋白α、三磷酸腺苷酶（ATPase）、載脂蛋白H、二氫硫辛酸脫氫酶、溶菌酶C、纖維蛋白原α鏈、免疫球蛋白重鏈V-Ⅲ在大于11mm卵母細胞中的表達是上調(diào)的，而抗凝血酶、維生素D連接蛋白、補體C3的表達下調(diào)。但是，這些蛋白并不是在所有樣本中穩(wěn)定表達，正是這些上調(diào)或者下調(diào)的差異表達蛋白可以幫助更好地理解卵母細胞的發(fā)育，甚至未來可能會成為臨床鑒定卵母細胞質(zhì)量、成熟度和不孕原因的新生物標志。

2.4疾病相關(guān)標志的篩選影響女性生育的疾病有多種，如輸卵管性、卵巢性、子宮性、免疫性和內(nèi)分泌性疾病等。其中子宮內(nèi)膜異位癥是一種慢性婦科病，其特點是具有生長功能的子宮內(nèi)膜組織存在于子宮腔外［18］。子宮內(nèi)膜異位會導致疼痛和不孕。許多研究報道了子宮內(nèi)膜異位會降低妊娠率。研究者們試圖從多方面解釋妊娠率降低的機制。研究發(fā)現(xiàn)妊娠率降低與排卵障礙、卵子數(shù)量少和非正常胚胎的形成有關(guān)。同時，卵巢功能的改變也會影響妊娠。但這些研究并沒有從分子生物學角度來揭示這些疾病所導致的不孕機制。蛋白質(zhì)組學可以更好地理解疾病的病理生理學進展，識別疾病過程中不同階段所涉及的蛋白質(zhì)［19］。Anifandis等［20］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者卵泡液中VEGF的水平下降，正常婦女的VEGF周期性地表達于卵巢顆粒細胞與卵泡膜細胞，起著促進卵巢血管生成、維持卵巢功能的作用，且能夠促進卵巢排卵前卵泡轉(zhuǎn)變?yōu)檠芑S體，因此VEGF與囊胚著床和早期妊娠有關(guān)［21］，VEGF缺乏將降低胚胎質(zhì)量與移植率。另有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者卵泡液中激肽原Ⅰ的表達下調(diào)［22］。激肽原Ⅰ對于維持炎癥與血管生成起重要作用，而炎癥與血管生成是導致卵巢過度刺激綜合征的關(guān)鍵。這

表明激肽原Ⅰ可用于臨床檢測是否出現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥與卵巢過度刺激綜合征的生物標記物。2013年，Várnagy等［23］利用雙向凝膠電泳和高性能串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對比了正常組、子宮內(nèi)膜異位癥妊娠組與子宮內(nèi)膜異位癥未妊娠組3組的卵泡液，最終發(fā)現(xiàn)了29個差異蛋白點，并確認了21種差異表達蛋白，如VEGF、激肽原Ⅰ、補體因子Ⅰ、玻連蛋白、黏著斑激酶1、載脂蛋白-AⅣ等。其中補體因子Ⅰ是一種血清糖蛋白，其可以調(diào)控補體活化，從而保護自身組織免受損害。玻連蛋白是細胞外約束整合素的基質(zhì)蛋白，在子宮內(nèi)膜異位癥患者卵泡液中表達上調(diào)。盡管目前的技術(shù)還無法確定所有變化的蛋白的功能，但這些發(fā)現(xiàn)對于了解更多的功能蛋白提供了支持。今后這些蛋白被明確作用機制后，有可能成為臨床檢測不孕相關(guān)疾病新的生物標志。

2.5體外受精（IVF）成功的標志IVF是指在體外將哺乳動物的精子與卵子，采用人工控制的方法完成受精過程的一種技術(shù)。由于人體個性差異，IVF的受精卵并不能保證在體內(nèi)都能孕育成為個體，其妊娠率并不是百分之百。因此，對提高IVF成功率的研究顯得尤為重要。一些研究者將研究視角轉(zhuǎn)向?qū)β雅菀旱鞍椎难芯浚噲D尋找到影響妊娠成功率的關(guān)鍵蛋白。有研究利用雙向凝膠電泳和高性能串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜技術(shù)從IVF成功者與未成功者的卵泡液中發(fā)現(xiàn)3種差異表達的蛋白，即硫氧還蛋白過氧化物酶1、甲狀腺素運載蛋白與視黃醇結(jié)合蛋白［13，24］。這些蛋白對于維持卵母細胞的成熟、正常受精發(fā)揮著重要作用。隨后，Kim等［25］發(fā)現(xiàn)二者中纖維蛋白原γ與抗凝血酶的差異表達，因此認為凝血因子對于維持正常妊娠是必需的。Severino等［26］利用iTRAQ技術(shù)對IVF成功者與未成功者的卵泡液進行了分析，發(fā)現(xiàn)二者中有300種蛋白同時表達，其中30種差異表達的蛋白中，相較于成功進行IVF的患者，未成功者有28種蛋白上調(diào)，2種蛋白下調(diào)。在上調(diào)的蛋白中同樣包括補體C3、補體C4和補體C9，在驗證與功能分析中發(fā)現(xiàn)，補體的抑制是維持卵母細胞活性所必需的，而補體抑制的缺乏可能會導致流產(chǎn)［27］。盡管由于技術(shù)原因，這些蛋白的具體作用機制并不明確，但是這些篩選出的差異蛋白，可能會成為預測妊娠與否的生物學標志。

3結(jié)語

蛋白質(zhì)組學從分子生物學角度揭示了人類的生殖相關(guān)疾病。目前對卵泡液蛋白質(zhì)組學的研究只停留在對未知蛋白進行篩選與鑒定上。盡管這些新發(fā)現(xiàn)的蛋白為預測卵母細胞的成熟與質(zhì)量提供了一定的理論支持，但是對于這些蛋白是如何影響、通過何種途徑來影響生殖的，還需要更多的研究來探索。卵泡液蛋白質(zhì)組學的研究將有助于更好地理解卵泡液的功能、評價卵母細胞質(zhì)量和預測妊娠結(jié)局。然而目前由于技術(shù)的限制，尚不能成功將這些已知的生物標記物應(yīng)用于臨床實踐中。相信隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，人類可以通過各種技術(shù)探究出更多的導致不孕相關(guān)的蛋白，從而通過對體外蛋白的鑒定更加精確和簡便地檢測與預防生殖相關(guān)疾病，提高輔助生殖的成功率，改善其結(jié)局。

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［本文編輯秦娟］

Research Progress of Human Follicular Fluid Proteom ics

CHAIWei-ran，E-mail：chaiwrsh@126.com

（2016-03-29）