香菇液體菌種深層發(fā)酵工藝探索

劉世玲，盧興潮，江 坤，尚東妮，唐 悅，田少平，李克彬，曹現(xiàn)濤*

（1．湖北五林中地農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖北 宜昌 443000；2．宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖北 宜昌 443000）

香菇液體菌種深層發(fā)酵工藝探索

劉世玲2，盧興潮1，江 坤1，尚東妮1，唐 悅1，田少平1，李克彬2，曹現(xiàn)濤1*

（1．湖北五林中地農(nóng)業(yè)科技有限公司，湖北 宜昌 443000；2．宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，湖北 宜昌 443000）

在香菇菌種液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選、50 L發(fā)酵罐工藝試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，探索500 L發(fā)酵罐發(fā)酵工藝。發(fā)酵30 h時(shí)pH開始降低；38 h時(shí)溶氧開始下降；120 h菌絲球固形物體積達(dá)92．16%；76 h～120 h流加堿（飽和Na2CO3溶液）頻率最高；168 h發(fā)酵菌絲體接種栽培袋的菌絲體活力明顯下降；192 h在顯微鏡下可觀測到大量菌絲體片段；接種量在5 mL和10 mL時(shí)菌絲萌發(fā)最好。運(yùn)用無菌培養(yǎng)接種罐接種（已申請專利），可有效降低接種環(huán)節(jié)培養(yǎng)基被污染的風(fēng)險(xiǎn)；香菇液體菌種深層發(fā)酵在24℃，pH4．5，溶氧量90%～98%，攪拌速率180 r·min-1條件下進(jìn)行比較適宜；最佳接種時(shí)間為96 h～144 h，接種量為每個(gè)接種孔5 mL～10 mL。

香菇；液體菌種；發(fā)酵；工藝

香菇隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 小皮傘科（Marasmiaceae）香菇屬（Lentinus）[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國香菇產(chǎn)量占世界香菇總產(chǎn)量約70%，香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展關(guān)系到國家食用菌產(chǎn)業(yè)的整體發(fā)展。目前香菇的種植主要依靠固體菌種，而固體菌種具有成本高、生長周期長、接種效率低等缺點(diǎn)。隨著科技進(jìn)步和食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，食用菌生產(chǎn)方式由家庭作坊式操作、季節(jié)性生產(chǎn)的模式向設(shè)施化、工廠化、周年化、規(guī)?；a(chǎn)模式轉(zhuǎn)變，采用深層發(fā)酵工藝制備食用菌菌種已成為研發(fā)熱點(diǎn)[2]。金針菇、杏鮑菇等在工廠化生產(chǎn)中已運(yùn)用液體菌種[3-4]。液體菌種具有生長周期短、菌絲生長快、多點(diǎn)萌發(fā)、出菇整齊等優(yōu)勢[5]。香菇液體菌種尚未在實(shí)際生產(chǎn)中大規(guī)模采用，目前香菇液體菌種的研究多停留在實(shí)驗(yàn)室搖瓶和小型發(fā)酵罐中培養(yǎng)的階段[6-8]。本研究在前期培養(yǎng)基篩選、搖瓶培養(yǎng)、50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用500 L發(fā)酵罐深層發(fā)酵香菇液體菌種，對發(fā)酵過程全程監(jiān)控，并進(jìn)行接種試驗(yàn)，以其得到可運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中的香菇液體菌種發(fā)酵工藝。

1 材料和方法

1.1 材料

1．1．1 香菇菌種

香菇菌種為香菇808A，由宜昌微生物研究所提供。

1．1．2 主要儀器和設(shè)備

超凈工作臺、往復(fù)式恒溫震蕩培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、無菌培養(yǎng)接種罐、5 mL移液槍、500 L攪拌式發(fā)酵罐。

1．1．3 培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。液體菌種及發(fā)酵罐培養(yǎng)基相同：糖蜜7%、豆粕粉0．3%、玉米粉0．3%、酵母浸粉 0．1%、KH2PO40．05%、MgSO40．03%。另外在發(fā)酵罐中添加0．029%的消泡油，以及在發(fā)酵過程中流動加堿流（飽和NaCO3溶液），使pH保持在一定范圍內(nèi)。PDA培養(yǎng)基和液體菌種培養(yǎng)基121℃滅菌。

1.2 方法

1．2．1 供試菌種活化

在無菌條件下將母種菌絲接種至PDA斜面上，24℃溫度下培養(yǎng)14 d后，挑選菌絲生長濃密、潔白、健壯的試管作為供試菌株。

1．2．2 液體菌種的制備

將2塊1 cm3的供試菌株菌絲塊，接種至含100 mL液體菌種培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，24℃搖床培養(yǎng)，前2 d轉(zhuǎn)速為160 r·min-1，后4 d轉(zhuǎn)速為180 r·min-1。6 d后擴(kuò)大培養(yǎng)，即將液體菌種轉(zhuǎn)接至裝有2 L培養(yǎng)基的5 L三角瓶中，接種量為5%，培養(yǎng)方法與上述相同，6 d后得到液體菌種。

1．2．3 發(fā)酵罐滅菌

發(fā)酵罐及配套設(shè)備空消（未加培養(yǎng)基前對設(shè)備滅菌），時(shí)間1 h，溫度121℃，壓力0．1 MPa～0．15 MPa；配料后（裝料系數(shù)為70%，初始pH調(diào)至5．0）發(fā)酵原料液和發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)消（加培養(yǎng)基后滅菌），時(shí)間1 h，溫度121℃，壓力0．1 MPa～0．15 MPa；流加罐實(shí)消，時(shí)間1 h，溫度121℃，壓力0．1 MPa～0．15 MPa。

1．2．4 接種

實(shí)消后，培養(yǎng)液溫度冷卻到24℃～25℃時(shí)接種，將液體菌種無菌條件下轉(zhuǎn)入旁氏罐中，利用旁氏罐將種子液接入500 L發(fā)酵罐，接種量為2%。

1．2．5 參數(shù)控制及發(fā)酵過程中檢測要求

培養(yǎng)基初始pH值為5；整個(gè)發(fā)酵過程中pH設(shè)定值為4．5，溫度設(shè)定24℃，壓力0．13 MPa；整個(gè)發(fā)酵過程中要求溶氧量為90%～98%（通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速與空氣流量實(shí)現(xiàn)）。攪拌轉(zhuǎn)速：前36 h，100 r·min-1～150 r·min-1；后期36 h～120 h，160 r·min-1～250 r·min-1（視溶氧量和菌絲球直徑大小調(diào)整）。進(jìn)風(fēng)量100 L·min-1～250 L·min-1（視溶氧量調(diào)整）。前24 h，取樣2次，取樣要求檢測菌絲體濃度和離線pH值，同時(shí)鏡檢香菇菌絲形態(tài)，并檢測是否感染雜菌；25 h～120 h，每隔6 h取樣一次，檢測總菌絲體濃度和離線pH值，同時(shí)鏡檢香菇菌絲形態(tài)，并檢測是否感染雜菌。整個(gè)發(fā)酵過程中每小時(shí)記錄1次在線pH值、通風(fēng)量、溶氧量、溫度、堿加入量等數(shù)據(jù)。

1．2．6 菌絲萌發(fā)試驗(yàn)

當(dāng)香菇菌絲體發(fā)酵至第6天和第7天時(shí)，分別取樣接種至栽培袋中。栽培料配方為木屑68%、棉籽殼10%、麩皮20%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%左右，栽培袋大小15 cm×30 cm。滅菌冷卻后，無菌條件下在栽培袋同一側(cè)面相隔約15 cm處，用打孔器打2個(gè)孔（大小1 cm×1 cm×10 cm）。用移液槍接種，接種量分別為每孔1．5 mL、2．5 mL、5 mL、10 mL、15 mL，接種后用膠帶及時(shí)封住接種口。每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，同時(shí)栽培袋接固體菌種作為對照。所有處理均置于24℃環(huán)境下暗培養(yǎng)，觀察菌絲萌發(fā)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH的變化

香菇液體菌種發(fā)酵過程中pH隨時(shí)間的變化情況見圖1。

由圖1可見，發(fā)酵前36 h時(shí)pH變化緩慢，由5．00降低至4．95，表明這一階段香菇菌絲處在適應(yīng)期，代謝緩慢；65 h時(shí)pH下降至4．44，此時(shí)開始流動加堿，將pH調(diào)至4．50附近；152 h后pH開始上升，76 h～120 h流加堿的頻率最高（每次約0．10 kg），表明期間菌絲體大量增多，代謝活躍，產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，這個(gè)階段應(yīng)該是菌絲生長的對數(shù)期至穩(wěn)定期。

2.2 溶氧的變化

圖1 香菇液體菌種發(fā)酵過程中pH隨時(shí)間的變化Fig．1 pH changed with time during the fermenting

在菌絲發(fā)酵進(jìn)行38 h后溶氧量開始降低，54 h～76 h之間培養(yǎng)基溶氧量低于50%，84 h后溶氧量恢復(fù)至初始值。此期間通過增加攪拌轉(zhuǎn)速（最高250 r·min-1）和增大通風(fēng)量（閥門開量由15%增至33%）來保持培養(yǎng)基中的溶氧量，以保證菌絲體生長代謝所需要的氧氣。這期間菌絲代謝旺盛，需要消耗大量的氧氣，因此造成培養(yǎng)基中溶氧量明顯下降。溶氧量開始下降的時(shí)間點(diǎn)（38 h）與pH開始降低的時(shí)間點(diǎn)（36 h） 較一致，同樣標(biāo)志香菇菌絲體大量繁殖，菌絲由適應(yīng)期進(jìn)入對數(shù)生長期。

2.3 菌絲球固形物體積的變化

由于培養(yǎng)基中有難以分解的豆粕粉顆粒等固體物質(zhì)，通過檢測培養(yǎng)基中菌絲球的干重或者濕重，難以真實(shí)反映菌絲體的生物量。本研究通過檢測取樣樣品中發(fā)酵固形物（主要是香菇菌絲體）的體積占樣品總體積的百分?jǐn)?shù)，來反映生成的香菇菌絲體的量。具體方法為每隔6 h取樣一次，將樣品混勻后取100 mL倒入100 mL量筒中，靜置2 h后等固形物體積不再減少，記錄固形物的體積，并計(jì)算固形物的百分比，見圖2。

圖2 固形物體積比隨時(shí)間的變化Fig．2 Volume ratio of solid content changed with time

由圖2可見，香菇菌絲體量在36 h之前很少，無法統(tǒng)計(jì)；在48 h開始明顯增多，達(dá)15%，此時(shí)菌絲體處于對數(shù)生長期。相對于pH和溶氧量，這個(gè)指標(biāo)反映的香菇菌絲的生長時(shí)期較滯后，因?yàn)橹挥芯z體體積累到一定量時(shí)才能反映出來。48 h～102 h固形物體積增長最快，由15%增至88%，平均每小時(shí)增加量達(dá)1．35%，114 h固形物體積比達(dá)到92．1%；此后不再增加，198 h后固形物體積開始減少，其原因可能是菌絲體開始自溶。

2.4 菌絲形態(tài)變化

正常的香菇雙核菌絲體細(xì)長，壁光滑，隔膜不明顯，隔膜之間的間距較大，且有明顯的鎖狀聯(lián)合，可作為區(qū)分香菇菌絲體和其它雜菌的重要標(biāo)志之一。在發(fā)酵過程中取樣檢測發(fā)現(xiàn)6 d之前香菇菌絲檢測形態(tài)正常，菌絲分節(jié)少，壁光滑，有明顯的鎖狀聯(lián)合，菌絲體短片段較少；而第7天～第9天，攪拌速率保持80 r·min-1時(shí)，取樣發(fā)現(xiàn)有大量菌絲體短片段生成，推測培養(yǎng)基中溶氧偏少、空間不足、營養(yǎng)成分的消耗和次級代謝產(chǎn)物的積累等原因致使香菇菌絲發(fā)生自溶現(xiàn)象，從而觀察到大量菌絲體片段。

2.5 培養(yǎng)基的變化

培養(yǎng)基開始由于一些物質(zhì)不溶而呈渾濁狀，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，發(fā)酵進(jìn)行6 d后，發(fā)酵上清液開始澄清。這一方面可以作為發(fā)酵液是否有細(xì)菌污染的標(biāo)志（細(xì)菌污染發(fā)酵液變渾濁），另一方面也可以作為發(fā)酵終點(diǎn)的標(biāo)志。

2.6 菌絲在栽培袋中的萌發(fā)情況

不同的發(fā)酵時(shí)間及接種量對香菇菌絲萌發(fā)的影響見表1。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間及接種量對香菇菌絲萌發(fā)的影響Tab．1 Influence on germinating of L.edodes of different fermentation time and inoculation volume

由表1可見，接種液體菌種4 d時(shí)，香菇菌絲體已開始萌發(fā)。而接種固體菌種4 d時(shí)，香菇菌絲體均未萌發(fā)；第8天時(shí)才觀察到固體菌種在栽培袋上萌發(fā)，說明液體菌種在栽培料上的萌發(fā)所需要的時(shí)間要比固體菌種快。由表1可以看出，不同的接種量對菌絲在栽培料上萌發(fā)影響較大：接種量在1．5 mL和2．5 mL時(shí)不能萌發(fā)，說明接種量偏少；接種量在5 mL和10 mL時(shí)，菌絲均能萌發(fā)，且長勢良好；接種量為15 mL時(shí)，發(fā)酵144 h的香菇菌絲體可以萌發(fā)，但發(fā)酵168 h的菌絲體只有部分能萌發(fā)；8 d后約40%接種孔沒有萌發(fā)。以上可以看出，香菇菌種液體發(fā)酵不易超過7 d，7 d后菌絲體活力下降，直接影響接種后菌種在栽培料上的萌發(fā)。

3 討論

食用菌液體菌種深層發(fā)酵，其中重點(diǎn)之一是要防止污染，一旦液體菌種被細(xì)菌或者真菌污染，整個(gè)發(fā)酵罐中的菌種將會被丟棄，這在實(shí)際生產(chǎn)中會帶來較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。除了種子本身的質(zhì)量外，另一個(gè)容易引起污染的環(huán)節(jié)就是接種。一般情況下將種子液接種到發(fā)酵罐時(shí)，發(fā)酵罐培養(yǎng)基和種子液是暴露在外界環(huán)境中的，這時(shí)如果環(huán)境的潔凈等級達(dá)不到要求，很容易被雜菌污染。本研究為降低接種環(huán)節(jié)被污染的風(fēng)險(xiǎn)，采用無菌培養(yǎng)接種罐接種。即先將種子在超凈工作臺上轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)接種罐，在無菌空氣中將罐中的種子液壓入發(fā)酵罐中。因接種罐和發(fā)酵罐構(gòu)成的是一個(gè)密閉系統(tǒng)，與外界完全隔離，有效降低這一環(huán)節(jié)被污染的風(fēng)險(xiǎn)。

通氣量、攪拌速率、溫度和pH是影響香菇液體菌種發(fā)酵的重要因素。其中通氣量和攪拌速率的目的是為了調(diào)節(jié)溶氧量和菌絲球大小。在菌絲生長的對數(shù)期，有大量菌絲體生成，代謝旺盛，對氧氣的消耗也多，此時(shí)要適當(dāng)增加通風(fēng)量和攪拌速率。但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，攪拌速率過快（250 r·min-1）會導(dǎo)致菌絲球過小，且會產(chǎn)生很多絮狀物。這些絮狀物是否會對接種后菌絲的萌發(fā)產(chǎn)生影響，尚需進(jìn)一步研究。通過將溶氧量、pH及菌絲體生成量相結(jié)合，可以推測菌絲發(fā)酵所處于的階段。在發(fā)酵過程中采用流加飽和Na2CO3的方式，可使pH始終處于較適宜香菇菌絲生長范圍，同時(shí)根據(jù)流加堿的頻率和量，也能反映出香菇菌絲發(fā)酵所處階段。

香菇菌絲液體發(fā)酵時(shí)間和接種量對液體菌種在栽培袋中的萌發(fā)至關(guān)重要。在研究中發(fā)現(xiàn)，液體菌種發(fā)酵6 d時(shí)要比7 d時(shí)萌發(fā)理想，在接種量低于2.5 mL時(shí)不能萌發(fā)；而發(fā)酵7 d，接種量為15 mL時(shí)，香菇菌絲只有部分萌發(fā)。分析認(rèn)為，其可能原因是7 d時(shí)已有部分菌絲自溶，水分過多的不利影響超過了菌絲量增多的影響。在接種量為5 mL和10 mL時(shí)，發(fā)酵6 d和7 d均可萌發(fā)。以上分析結(jié)合經(jīng)濟(jì)考慮，建議香菇液體菌種發(fā)酵不要超過6 d，每個(gè)接種孔接種量在5 mL～10 mL。

[1]Kirk P,Minter DS.Dictionary of the fungi(10th edition)[M]. Oxon:CABI Europe-UK,2008.

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Submerged Fermentation Technology of Liquid Spawn of Lentinus edodes

LIU Shi-ling2,LU Xing-chao1,JIANG Kun1,SHANG Dong-ni1,TANG Yue1, TIAN Shao-ping1,LI Ke-bin2,CAO Xian-tao1
(1．Hubei Wulin Land Agricultural Science&Technology Co．Ltd．,Yichang 443000,China; 2．Yichang Academy of Agricultural Sciences,Yichang 443000,China)

The submerged fermentation technology of liquid spawn of Lentinus edodes with 500 L fermenter based on the media and technology of 50 L fermenter were studied．pH value began to decline after 30 h,the dissolved oxygen tension began to decline after 38 h．The volume ratio of mycelia reached 92．16%after 120 h,the frequency of the flowing-alkaline (saturated solution of Na2CO3)is frequent highest within the range of 76 h-120 h,and the vitality of spawn mycelia cultivated for 168 h declined significantly．Lots of L.edodes mycelia fragments were seen under microscope after 192 h,and the mycelia germinated well when inoculation amount ranged within 5 mL-10 mL．The risk of contamination could be reduced effectively by inoculating with sterile culture and inoculation canister which has been patented,the proper condition for submerged fermentation of L.edodes spawn was 24℃,pH 4．5,dissolved oxygen tension within 90%-98%,agitation speed 180 r·min-1,and the optical inoculating period was within 96 hours-144 hours,inoculation volume was within the range of 5 mL-10 mL．

Lentinus edodes;liquid spawn;fermentation;technology

S646.9

A

1003-8310（2016）01-0021-04

10．13629/j．cnki．53-1054．2016．01．005

劉世玲（1966-），女，本科，正高職高級工程師，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)方面的研究工作。E-mail:2896006619＠qq．com

*通信作者：曹現(xiàn)濤（1989-），男，碩士，工程師，主要從事香菇液體菌種發(fā)酵工藝與應(yīng)用研究。E-mail:wh201206＠126．com

2015-11-20