硫酸軟骨素酶ABC聯(lián)合超短波治療對(duì)脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)及膠質(zhì)瘢痕形成的影響

王笑男，張志強(qiáng)，張立新

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重威脅人類健康及生存質(zhì)量的疾病，并且主要發(fā)病人群為青壯年,目前尚無(wú)有效治療方法。SCI后形成的膠質(zhì)瘢痕對(duì)中樞神經(jīng)有一定的保護(hù)作用，使其免受進(jìn)一步損害，但是膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了神經(jīng)再生，影響功能恢復(fù)。因此，在治療SCI過(guò)程中，抑制膠質(zhì)瘢痕形成是非常重要的。Zhang等[1]通過(guò)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合硫酸軟骨素酶ABC(Chondritinase ABC, ChABC)注射治療，證實(shí)二者聯(lián)合作用對(duì)大鼠SCI后神經(jīng)修復(fù)有效。臨床上，小劑量超短波治療具有改善血液循環(huán)、組織營(yíng)養(yǎng)及消炎等作用,應(yīng)用廣泛。 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillaty acidic protein, GFAP)是活化星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的神經(jīng)抑制因子——硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulphate proteoglycans, CSPGs)，CSPGs是參與膠質(zhì)瘢痕形成的重要分子[2]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)術(shù)后觀察大鼠運(yùn)動(dòng)功能及檢測(cè)GFAP、CSPGs表達(dá)水平，來(lái)觀察ChABC聯(lián)合超短波治療能否進(jìn)一步抑制膠質(zhì)瘢痕形成，從而進(jìn)一步促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材與試劑 ①器材：腦損傷打擊器，PE10微導(dǎo)管，微量注射器。②試劑： 硫酸軟骨素酶ABC(Sigma公司，10U)。GFAP第一抗體，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)液I，GFAP第二抗體，SABC，DAB顯色劑A、DAB顯色劑B、DAB顯色劑C。CSPGs第一抗體、抗原修復(fù)液。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，CSPGs第二抗體，動(dòng)物非免疫血清，鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化氫酶(SP)溶液，DAB緩沖液，DAB底物，DAB色原。

1.2 方法 ①動(dòng)物分組：8周齡SD大鼠，雌雄不限，共42只。隨機(jī)分成3組，每組14只。分別為對(duì)照組(其中8只為單純損傷組，另外6只為加PBS溶液治療的安慰劑組)、ChABC組、聯(lián)合組(ChABC聯(lián)合超短波治療)。②造模：按改良Allen's法制作大鼠脊髓損傷模型：大鼠在5%水合氯醛腹腔麻醉(0.6ml/100g)下俯臥固定，依據(jù)T2椎體，找到T10，以T10為中心作皮膚切口長(zhǎng)約3cm，剝離周圍軟組織后顯露并咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，骨窗大小約4×8mm，暴露脊髓背側(cè)硬脊膜，將動(dòng)物固定在致傷裝置底座上，使沖擊棒套管下端之弧形面與脊髓背面貼附良好，之后用10g沖擊棒自10cm高處自由下落打擊脊髓，形成脊髓損傷模型，沖擊棒直徑2mm，致傷能量為100gcf。然后，對(duì)照組中的單純損傷組逐層關(guān)閉切口。術(shù)中操作注意嚴(yán)格無(wú)菌。術(shù)后腹腔注射青霉素3d，4萬(wàn)單位/日/只，觀察有無(wú)血尿，必要時(shí)繼續(xù)注射青霉素。根據(jù)傷情膀胱擠壓協(xié)助排尿，2次/日，直至恢復(fù)自行排尿。此外，ChABC組和聯(lián)合組及加PBS治療的對(duì)照組打擊脊髓后，再咬除T12右側(cè)半椎板作為蛛網(wǎng)膜下腔置管區(qū)，將PE10導(dǎo)管置入蛛網(wǎng)膜下腔，孔尖距損傷區(qū)1～2mm。將導(dǎo)管固定于肌肉上。逐層關(guān)閉切口，同時(shí)進(jìn)一步固定PE10導(dǎo)管。④干預(yù)：對(duì)照組中的加PBS安慰劑組、ChABC組和聯(lián)合組術(shù)后立即用微量注射器經(jīng)PE10導(dǎo)管注射1U/mL ChABC或PBS溶液6μl，以后每天同量給藥1次，1周后停藥。此外，聯(lián)合組術(shù)后第2天予小劑量超短波治療(上海產(chǎn)五官超短波治療儀用2個(gè)2號(hào)極板放置于大鼠的兩側(cè)，位置在損傷的脊髓區(qū)，極板距離大鼠2cm)，用無(wú)熱量治療，治療前用氖泡燈調(diào)諧，每天1次，每次7min，至取材前一天。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 評(píng)估各組大鼠術(shù)后1天及1～4周每周的運(yùn)動(dòng)能力，測(cè)量術(shù)后2周、4周大鼠脊髓標(biāo)本損傷區(qū)的GFAP、CSPGs平均光密度值。①運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分：采用BBB(Basso,Beattie & Bresnahan locomotor rating scale, BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)分法，BBB評(píng)分包括：評(píng)判動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)(0～7分)；評(píng)判動(dòng)物后肢的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能(8～13分)；評(píng)判動(dòng)物運(yùn)動(dòng)過(guò)程中爪的精細(xì)動(dòng)作(14～21分)，滿分21分。②免疫組織化學(xué)染色：各組大鼠脊髓取材做免疫組織化學(xué)染色。用裝有圖像采集軟件NIS-Elements F 3.0的設(shè)備采集圖像。先在低倍鏡下確定脊髓損傷位置，再用400倍放大鏡下采集脊髓損傷部位圖像。圖像采集方法是均勻沿瘢痕周邊拍5張圖片，以保證覆蓋損傷區(qū)。用NIS-Elements Br 3.0對(duì)所有采集的圖像進(jìn)行半定量分析，直接測(cè)出GFAP、CSPGs的平均光密度值。因每個(gè)標(biāo)本采集了5張圖像，因此測(cè)出了5個(gè)平均光密度值。最后對(duì)每個(gè)標(biāo)本的5個(gè)平均光密度值取算術(shù)平均值，并將其輸入表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 對(duì)照組：術(shù)后1周的評(píng)分雖然比1d高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后2周到3周連續(xù)提高(P<0.05，0.01)；術(shù)后4周的評(píng)分雖然比3周高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ChABC組：術(shù)后1周的評(píng)分雖然高于1d但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，術(shù)后2周開(kāi)始均開(kāi)始連續(xù)調(diào)高(P<0.05)。聯(lián)合組：術(shù)后1周到2周評(píng)分連續(xù)提高(P<0.01，0.05)；雖然3周與2周相比，4周與3周相比均有升高趨勢(shì)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而4周評(píng)分明顯高于2周(P<0.01)。組間比較：聯(lián)合組在術(shù)后1～4周各時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分均高于對(duì)照組(P<0.05，0.01)。ChABC組僅在術(shù)后第4周高于對(duì)照組(P<0.01)；其余各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ChABC治療組與聯(lián)合治療組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 3組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分比較 分，

與組內(nèi)前一時(shí)間點(diǎn)比較，aP<0.05，bP<0.01；與術(shù)后2周比較，cP<0.01；與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，dP<0.01

2.2 GFAP免疫組化 術(shù)后2周至4周，3組各自的GFAP平均光密度值均無(wú)明顯變化。術(shù)后2周，ChABC組和聯(lián)合組的GFAP平均光密度值均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)；術(shù)后4周，對(duì)照組的GFAP平均光密度值與兩個(gè)治療組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1，表2。

2.3 CSPGs免疫組化 對(duì)照組術(shù)后4周時(shí)，CSPGs陽(yáng)性表達(dá)明顯低于術(shù)后2周(P<0.01)，ChABC治療組和聯(lián)合組各自的GFAP平均光密度值均無(wú)明顯變化。術(shù)后2周，ChABC組和聯(lián)合組與對(duì)照組比較CSPGs平均光密度值明顯降低(P<0.01)，術(shù)后4周，組間差異消失。兩個(gè)治療組相比，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2，表2。

圖1 術(shù)后2周及4周時(shí)3組CSPGs免疫組化比較(×400)

圖2 術(shù)后2周及4周3組GFAP免疫組化比較(×400)

組別nGFAP2周4周CSPGs2周4周對(duì)照組70.27±0.050.28±0.080.44±0.020.34±0.02aChABC組70.22±0.01b0.22±0.010.33±0.01b0.34±0.02聯(lián)合治療組70.22±0.01b0.22±0.010.34±0.02b0.34±0.02

與組內(nèi)術(shù)后2周時(shí)比較，aP<0.01；與對(duì)照組比較，bP<0.01

3 討論

SCI后會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞免疫、體液免疫。在此過(guò)程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕形成。膠質(zhì)瘢痕中的星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為胞體增大，突起增多變粗，膠質(zhì)瘢痕將空洞與周圍脊髓組織隔離[3]。雖然SCI后形成的膠質(zhì)瘢痕可以起到保護(hù)作用，阻止了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)一步損害，但是膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了神經(jīng)再生，影響了SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)。所以，SCI后對(duì)膠質(zhì)瘢痕形成的抑制是一個(gè)有價(jià)值的治療。GFAP是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞骨架成分，在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中，主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞中。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物,它的變化反應(yīng)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)。在SCI后，GFAP早期促進(jìn)神經(jīng)再生，后期形成膠質(zhì)瘢痕[4]。SCI后，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌表達(dá)CSPGs，而CSPGs主要是由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的,其是參與膠質(zhì)瘢痕形成的重要分子[2]。Plant等[5]通過(guò)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為CSPGs很可能是阻礙軸索再生的分子抑制屏障。Morgenstern等[6]認(rèn)為在中樞神經(jīng)損傷處CSPGs是一重要的抑制因子，使中樞神經(jīng)成功再生就要抑制產(chǎn)生CSPGs的細(xì)胞或分子。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇GFAP、CSPGs來(lái)觀察ChABC治療和超短波聯(lián)合ChABC治療對(duì)膠質(zhì)瘢痕形成的抑制效果。張海燕等[7]的研究表明，CSPGs在損傷后開(kāi)始上調(diào)，傷后7天開(kāi)始達(dá)到高峰，至2周開(kāi)始下調(diào)，1個(gè)月后開(kāi)始趨于穩(wěn)定；黃凱等[8]通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)表明，脊髓損傷后4周膠質(zhì)瘢痕厚度達(dá)到高峰，囊腔與殘存軸突之間開(kāi)始形成機(jī)械屏障，與我們對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。因此，本實(shí)驗(yàn)在大鼠SCI術(shù)后立即給藥，并選擇術(shù)后2周、4周作為CSPGs、GFAP因子的觀察時(shí)間點(diǎn)。

硫酸軟骨素是一種酸性粘多糖類生物大分子，常見(jiàn)的有3種類型ChS-A、ChS-B、ChS-C。ChABC是一種裂解酶，具有降解ChS-A、ChS-B、ChS-C及透明質(zhì)酸等功能，能特異性破壞大部分的CSPGs的葡糖胺聚糖鏈(GAG)，酶的半衰期較短。Xu等[9]通過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔注射ChABC，發(fā)現(xiàn)ChABC能抑制膠質(zhì)瘢痕，改善損傷區(qū)微環(huán)境，提高GAP-43的表達(dá)，促進(jìn)軸索生長(zhǎng)和延伸。因此，本實(shí)驗(yàn)采用蛛網(wǎng)膜下腔給藥，連續(xù)給藥1周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ChABC組和聯(lián)合組在術(shù)后2周的CSPGs平均光密度值均明顯低于對(duì)照組，術(shù)后4周的CSPGs平均光密度值無(wú)明顯差異，說(shuō)明在損傷后用ChABC治療或超短波聯(lián)合ChABC治療確實(shí)能夠較大幅度抑制CSPGs的上調(diào)，使CSPGs維持在較低的水平，從而有效抑制了阻礙軸索再生的化學(xué)屏障，但隨著病程的延長(zhǎng)，CSPGs的表達(dá)也可自然恢復(fù)到較低水平。因?yàn)镚FAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞參與構(gòu)成膠質(zhì)瘢痕的機(jī)械屏障。Zhang等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為ChABC能夠抑制GFAP的表達(dá)，減弱膠質(zhì)瘢痕形成，促進(jìn)軸索再生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在術(shù)后2周，聯(lián)合組與ChABC組的GFAP的平均光密度值均明顯低于對(duì)照組，而術(shù)后4周，雖然對(duì)GFAP有作用，但是因平均光密度值結(jié)果差異較大，而且樣本量不足，雖有趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明用ChABC治療也能夠在SCI后有效抑制GFAP增高，進(jìn)而抑制了SCI后膠質(zhì)瘢痕形成的機(jī)械屏障。綜上所述，ChABC治療組和聯(lián)合治療組對(duì)SCI后膠質(zhì)瘢痕形成產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

Starkey等[11]通過(guò)實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為用ChABC治療能夠促進(jìn)功能恢復(fù)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在術(shù)后4周ChABC治療組和聯(lián)合治療組的大鼠后肢功能恢復(fù)均明顯比對(duì)照組要好，證實(shí)了用ChABC治療確實(shí)能夠促進(jìn)大鼠功能恢復(fù)。超短波治療在臨床上應(yīng)用比較廣泛，小劑量超短波可緩解炎癥、提高免疫應(yīng)答。而膠質(zhì)瘢痕形成是在SCI后發(fā)生免疫反應(yīng)，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞后形成的。Yin等[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，脊髓損傷后用超短波聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療比單純用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或超短波治療功能恢復(fù)更好。因此，在聯(lián)合治療組除用ChABC治療外，還加用小劑量超短波治療以觀察能否進(jìn)一步抑制膠質(zhì)瘢痕的形成及促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。然而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，超短波聯(lián)合治療組與ChABC治療組相比，在對(duì)CSPGs和GFAP的抑制上，均沒(méi)有差異。表明在抑制膠質(zhì)瘢痕形成上，超短波聯(lián)合ChABC治療效果和單純ChABC治療效果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此說(shuō)明，小劑量超短波治療雖然能緩解炎癥、減輕水腫；但是，對(duì)SCI后抑制膠質(zhì)瘢痕形成上沒(méi)有明顯治療作用。但是，本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠術(shù)后1天以及以后每周一次的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分觀察結(jié)果顯示：雖然術(shù)后各組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能都在恢復(fù)，但是在術(shù)后1～4周各時(shí)間觀察點(diǎn)上，應(yīng)用超短波聯(lián)合ChABC治療的大鼠肢體功能恢復(fù)明顯比對(duì)照組的大鼠好。而術(shù)后1至3周各時(shí)間觀察點(diǎn)上，單純ChABC治療組的大鼠肢體功能恢復(fù)相比對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，只是在術(shù)后4周明顯超過(guò)對(duì)照組，以上結(jié)果說(shuō)明ChABC聯(lián)合小劑量超短波治療能更好的促進(jìn)SCI后的功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與早期抑制膠質(zhì)瘢痕形成有關(guān)，但作用不持久，也可能是因?yàn)樾┝砍滩ㄖ委熌芨纳蒲h(huán)，營(yíng)養(yǎng)組織，從而促進(jìn)了神經(jīng)功能恢復(fù)，加上用ChABC治療在SCI后又有效的抑制了膠質(zhì)瘢痕形成，為神經(jīng)再生及功能恢復(fù)創(chuàng)造了有利條件。因此，超短波聯(lián)合ChABC治療是促進(jìn)SCI后功能恢復(fù)的一個(gè)有效治療手段，其具體機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

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