• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    硫酸軟骨素酶ABC聯(lián)合超短波治療對(duì)脊髓損傷大鼠的功能恢復(fù)及膠質(zhì)瘢痕形成的影響

    2016-03-13 08:48:18王笑男張志強(qiáng)張立新
    中國(guó)康復(fù) 2016年6期
    關(guān)鍵詞:光密度超短波星形

    王笑男,張志強(qiáng),張立新

    脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重威脅人類健康及生存質(zhì)量的疾病,并且主要發(fā)病人群為青壯年,目前尚無(wú)有效治療方法。SCI后形成的膠質(zhì)瘢痕對(duì)中樞神經(jīng)有一定的保護(hù)作用,使其免受進(jìn)一步損害,但是膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了神經(jīng)再生,影響功能恢復(fù)。因此,在治療SCI過(guò)程中,抑制膠質(zhì)瘢痕形成是非常重要的。Zhang等[1]通過(guò)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合硫酸軟骨素酶ABC(Chondritinase ABC, ChABC)注射治療,證實(shí)二者聯(lián)合作用對(duì)大鼠SCI后神經(jīng)修復(fù)有效。臨床上,小劑量超短波治療具有改善血液循環(huán)、組織營(yíng)養(yǎng)及消炎等作用,應(yīng)用廣泛。 膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillaty acidic protein, GFAP)是活化星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌大量的神經(jīng)抑制因子——硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulphate proteoglycans, CSPGs),CSPGs是參與膠質(zhì)瘢痕形成的重要分子[2]。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)術(shù)后觀察大鼠運(yùn)動(dòng)功能及檢測(cè)GFAP、CSPGs表達(dá)水平,來(lái)觀察ChABC聯(lián)合超短波治療能否進(jìn)一步抑制膠質(zhì)瘢痕形成,從而進(jìn)一步促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)器材與試劑 ①器材:腦損傷打擊器,PE10微導(dǎo)管,微量注射器。②試劑: 硫酸軟骨素酶ABC(Sigma公司,10U)。GFAP第一抗體,內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,抗原修復(fù)液I,GFAP第二抗體,SABC,DAB顯色劑A、DAB顯色劑B、DAB顯色劑C。CSPGs第一抗體、抗原修復(fù)液。內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,CSPGs第二抗體,動(dòng)物非免疫血清,鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化氫酶(SP)溶液,DAB緩沖液,DAB底物,DAB色原。

    1.2 方法 ①動(dòng)物分組:8周齡SD大鼠,雌雄不限,共42只。隨機(jī)分成3組,每組14只。分別為對(duì)照組(其中8只為單純損傷組,另外6只為加PBS溶液治療的安慰劑組)、ChABC組、聯(lián)合組(ChABC聯(lián)合超短波治療)。②造模:按改良Allen's法制作大鼠脊髓損傷模型:大鼠在5%水合氯醛腹腔麻醉(0.6ml/100g)下俯臥固定,依據(jù)T2椎體,找到T10,以T10為中心作皮膚切口長(zhǎng)約3cm,剝離周圍軟組織后顯露并咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板,骨窗大小約4×8mm,暴露脊髓背側(cè)硬脊膜,將動(dòng)物固定在致傷裝置底座上,使沖擊棒套管下端之弧形面與脊髓背面貼附良好,之后用10g沖擊棒自10cm高處自由下落打擊脊髓,形成脊髓損傷模型,沖擊棒直徑2mm,致傷能量為100gcf。然后,對(duì)照組中的單純損傷組逐層關(guān)閉切口。術(shù)中操作注意嚴(yán)格無(wú)菌。術(shù)后腹腔注射青霉素3d,4萬(wàn)單位/日/只,觀察有無(wú)血尿,必要時(shí)繼續(xù)注射青霉素。根據(jù)傷情膀胱擠壓協(xié)助排尿,2次/日,直至恢復(fù)自行排尿。此外,ChABC組和聯(lián)合組及加PBS治療的對(duì)照組打擊脊髓后,再咬除T12右側(cè)半椎板作為蛛網(wǎng)膜下腔置管區(qū),將PE10導(dǎo)管置入蛛網(wǎng)膜下腔,孔尖距損傷區(qū)1~2mm。將導(dǎo)管固定于肌肉上。逐層關(guān)閉切口,同時(shí)進(jìn)一步固定PE10導(dǎo)管。④干預(yù):對(duì)照組中的加PBS安慰劑組、ChABC組和聯(lián)合組術(shù)后立即用微量注射器經(jīng)PE10導(dǎo)管注射1U/mL ChABC或PBS溶液6μl,以后每天同量給藥1次,1周后停藥。此外,聯(lián)合組術(shù)后第2天予小劑量超短波治療(上海產(chǎn)五官超短波治療儀用2個(gè)2號(hào)極板放置于大鼠的兩側(cè),位置在損傷的脊髓區(qū),極板距離大鼠2cm),用無(wú)熱量治療,治療前用氖泡燈調(diào)諧,每天1次,每次7min,至取材前一天。

    1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 評(píng)估各組大鼠術(shù)后1天及1~4周每周的運(yùn)動(dòng)能力,測(cè)量術(shù)后2周、4周大鼠脊髓標(biāo)本損傷區(qū)的GFAP、CSPGs平均光密度值。①運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分:采用BBB(Basso,Beattie & Bresnahan locomotor rating scale, BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)分法,BBB評(píng)分包括:評(píng)判動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)活動(dòng)(0~7分);評(píng)判動(dòng)物后肢的步態(tài)和協(xié)調(diào)功能(8~13分);評(píng)判動(dòng)物運(yùn)動(dòng)過(guò)程中爪的精細(xì)動(dòng)作(14~21分),滿分21分。②免疫組織化學(xué)染色:各組大鼠脊髓取材做免疫組織化學(xué)染色。用裝有圖像采集軟件NIS-Elements F 3.0的設(shè)備采集圖像。先在低倍鏡下確定脊髓損傷位置,再用400倍放大鏡下采集脊髓損傷部位圖像。圖像采集方法是均勻沿瘢痕周邊拍5張圖片,以保證覆蓋損傷區(qū)。用NIS-Elements Br 3.0對(duì)所有采集的圖像進(jìn)行半定量分析,直接測(cè)出GFAP、CSPGs的平均光密度值。因每個(gè)標(biāo)本采集了5張圖像,因此測(cè)出了5個(gè)平均光密度值。最后對(duì)每個(gè)標(biāo)本的5個(gè)平均光密度值取算術(shù)平均值,并將其輸入表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2 結(jié)果

    2.1 BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 對(duì)照組:術(shù)后1周的評(píng)分雖然比1d高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后2周到3周連續(xù)提高(P<0.05,0.01);術(shù)后4周的評(píng)分雖然比3周高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ChABC組:術(shù)后1周的評(píng)分雖然高于1d但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,術(shù)后2周開(kāi)始均開(kāi)始連續(xù)調(diào)高(P<0.05)。聯(lián)合組:術(shù)后1周到2周評(píng)分連續(xù)提高(P<0.01,0.05);雖然3周與2周相比,4周與3周相比均有升高趨勢(shì),差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而4周評(píng)分明顯高于2周(P<0.01)。組間比較:聯(lián)合組在術(shù)后1~4周各時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分均高于對(duì)照組(P<0.05,0.01)。ChABC組僅在術(shù)后第4周高于對(duì)照組(P<0.01);其余各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ChABC治療組與聯(lián)合治療組在各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

    表1 3組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分比較 分,

    與組內(nèi)前一時(shí)間點(diǎn)比較,aP<0.05,bP<0.01;與術(shù)后2周比較,cP<0.01;與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較,dP<0.01

    2.2 GFAP免疫組化 術(shù)后2周至4周,3組各自的GFAP平均光密度值均無(wú)明顯變化。術(shù)后2周,ChABC組和聯(lián)合組的GFAP平均光密度值均明顯低于對(duì)照組(P<0.01);術(shù)后4周,對(duì)照組的GFAP平均光密度值與兩個(gè)治療組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1,表2。

    2.3 CSPGs免疫組化 對(duì)照組術(shù)后4周時(shí),CSPGs陽(yáng)性表達(dá)明顯低于術(shù)后2周(P<0.01),ChABC治療組和聯(lián)合組各自的GFAP平均光密度值均無(wú)明顯變化。術(shù)后2周,ChABC組和聯(lián)合組與對(duì)照組比較CSPGs平均光密度值明顯降低(P<0.01),術(shù)后4周,組間差異消失。兩個(gè)治療組相比,兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2,表2。

    圖1 術(shù)后2周及4周時(shí)3組CSPGs免疫組化比較(×400)

    圖2 術(shù)后2周及4周3組GFAP免疫組化比較(×400)

    組別nGFAP2周4周CSPGs2周4周對(duì)照組70.27±0.050.28±0.080.44±0.020.34±0.02aChABC組70.22±0.01b0.22±0.010.33±0.01b0.34±0.02聯(lián)合治療組70.22±0.01b0.22±0.010.34±0.02b0.34±0.02

    與組內(nèi)術(shù)后2周時(shí)比較,aP<0.01;與對(duì)照組比較,bP<0.01

    3 討論

    SCI后會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的免疫反應(yīng),包括細(xì)胞免疫、體液免疫。在此過(guò)程中,星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活,活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕形成。膠質(zhì)瘢痕中的星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為胞體增大,突起增多變粗,膠質(zhì)瘢痕將空洞與周圍脊髓組織隔離[3]。雖然SCI后形成的膠質(zhì)瘢痕可以起到保護(hù)作用,阻止了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)一步損害,但是膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了神經(jīng)再生,影響了SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)。所以,SCI后對(duì)膠質(zhì)瘢痕形成的抑制是一個(gè)有價(jià)值的治療。GFAP是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要細(xì)胞骨架成分,在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中,主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞中。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物,它的變化反應(yīng)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài)。在SCI后,GFAP早期促進(jìn)神經(jīng)再生,后期形成膠質(zhì)瘢痕[4]。SCI后,活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌表達(dá)CSPGs,而CSPGs主要是由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的,其是參與膠質(zhì)瘢痕形成的重要分子[2]。Plant等[5]通過(guò)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為CSPGs很可能是阻礙軸索再生的分子抑制屏障。Morgenstern等[6]認(rèn)為在中樞神經(jīng)損傷處CSPGs是一重要的抑制因子,使中樞神經(jīng)成功再生就要抑制產(chǎn)生CSPGs的細(xì)胞或分子。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇GFAP、CSPGs來(lái)觀察ChABC治療和超短波聯(lián)合ChABC治療對(duì)膠質(zhì)瘢痕形成的抑制效果。張海燕等[7]的研究表明,CSPGs在損傷后開(kāi)始上調(diào),傷后7天開(kāi)始達(dá)到高峰,至2周開(kāi)始下調(diào),1個(gè)月后開(kāi)始趨于穩(wěn)定;黃凱等[8]通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)表明,脊髓損傷后4周膠質(zhì)瘢痕厚度達(dá)到高峰,囊腔與殘存軸突之間開(kāi)始形成機(jī)械屏障,與我們對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。因此,本實(shí)驗(yàn)在大鼠SCI術(shù)后立即給藥,并選擇術(shù)后2周、4周作為CSPGs、GFAP因子的觀察時(shí)間點(diǎn)。

    硫酸軟骨素是一種酸性粘多糖類生物大分子,常見(jiàn)的有3種類型ChS-A、ChS-B、ChS-C。ChABC是一種裂解酶,具有降解ChS-A、ChS-B、ChS-C及透明質(zhì)酸等功能,能特異性破壞大部分的CSPGs的葡糖胺聚糖鏈(GAG),酶的半衰期較短。Xu等[9]通過(guò)蛛網(wǎng)膜下腔注射ChABC,發(fā)現(xiàn)ChABC能抑制膠質(zhì)瘢痕,改善損傷區(qū)微環(huán)境,提高GAP-43的表達(dá),促進(jìn)軸索生長(zhǎng)和延伸。因此,本實(shí)驗(yàn)采用蛛網(wǎng)膜下腔給藥,連續(xù)給藥1周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ChABC組和聯(lián)合組在術(shù)后2周的CSPGs平均光密度值均明顯低于對(duì)照組,術(shù)后4周的CSPGs平均光密度值無(wú)明顯差異,說(shuō)明在損傷后用ChABC治療或超短波聯(lián)合ChABC治療確實(shí)能夠較大幅度抑制CSPGs的上調(diào),使CSPGs維持在較低的水平,從而有效抑制了阻礙軸索再生的化學(xué)屏障,但隨著病程的延長(zhǎng),CSPGs的表達(dá)也可自然恢復(fù)到較低水平。因?yàn)镚FAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物,活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞參與構(gòu)成膠質(zhì)瘢痕的機(jī)械屏障。Zhang等[10]通過(guò)實(shí)驗(yàn)認(rèn)為ChABC能夠抑制GFAP的表達(dá),減弱膠質(zhì)瘢痕形成,促進(jìn)軸索再生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在術(shù)后2周,聯(lián)合組與ChABC組的GFAP的平均光密度值均明顯低于對(duì)照組,而術(shù)后4周,雖然對(duì)GFAP有作用,但是因平均光密度值結(jié)果差異較大,而且樣本量不足,雖有趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明用ChABC治療也能夠在SCI后有效抑制GFAP增高,進(jìn)而抑制了SCI后膠質(zhì)瘢痕形成的機(jī)械屏障。綜上所述,ChABC治療組和聯(lián)合治療組對(duì)SCI后膠質(zhì)瘢痕形成產(chǎn)生了明顯的抑制作用。

    Starkey等[11]通過(guò)實(shí)驗(yàn),認(rèn)為用ChABC治療能夠促進(jìn)功能恢復(fù),本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在術(shù)后4周ChABC治療組和聯(lián)合治療組的大鼠后肢功能恢復(fù)均明顯比對(duì)照組要好,證實(shí)了用ChABC治療確實(shí)能夠促進(jìn)大鼠功能恢復(fù)。超短波治療在臨床上應(yīng)用比較廣泛,小劑量超短波可緩解炎癥、提高免疫應(yīng)答。而膠質(zhì)瘢痕形成是在SCI后發(fā)生免疫反應(yīng),激活星形膠質(zhì)細(xì)胞后形成的。Yin等[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,脊髓損傷后用超短波聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療比單純用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或超短波治療功能恢復(fù)更好。因此,在聯(lián)合治療組除用ChABC治療外,還加用小劑量超短波治療以觀察能否進(jìn)一步抑制膠質(zhì)瘢痕的形成及促進(jìn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。然而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,超短波聯(lián)合治療組與ChABC治療組相比,在對(duì)CSPGs和GFAP的抑制上,均沒(méi)有差異。表明在抑制膠質(zhì)瘢痕形成上,超短波聯(lián)合ChABC治療效果和單純ChABC治療效果沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此說(shuō)明,小劑量超短波治療雖然能緩解炎癥、減輕水腫;但是,對(duì)SCI后抑制膠質(zhì)瘢痕形成上沒(méi)有明顯治療作用。但是,本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠術(shù)后1天以及以后每周一次的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分觀察結(jié)果顯示:雖然術(shù)后各組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能都在恢復(fù),但是在術(shù)后1~4周各時(shí)間觀察點(diǎn)上,應(yīng)用超短波聯(lián)合ChABC治療的大鼠肢體功能恢復(fù)明顯比對(duì)照組的大鼠好。而術(shù)后1至3周各時(shí)間觀察點(diǎn)上,單純ChABC治療組的大鼠肢體功能恢復(fù)相比對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,只是在術(shù)后4周明顯超過(guò)對(duì)照組,以上結(jié)果說(shuō)明ChABC聯(lián)合小劑量超短波治療能更好的促進(jìn)SCI后的功能恢復(fù),其機(jī)制可能與早期抑制膠質(zhì)瘢痕形成有關(guān),但作用不持久,也可能是因?yàn)樾┝砍滩ㄖ委熌芨纳蒲h(huán),營(yíng)養(yǎng)組織,從而促進(jìn)了神經(jīng)功能恢復(fù),加上用ChABC治療在SCI后又有效的抑制了膠質(zhì)瘢痕形成,為神經(jīng)再生及功能恢復(fù)創(chuàng)造了有利條件。因此,超短波聯(lián)合ChABC治療是促進(jìn)SCI后功能恢復(fù)的一個(gè)有效治療手段,其具體機(jī)制尚不清楚,需要進(jìn)一步研究。

    [1] Zhang C,Yao C,He XJ,et al.Repair of subacute spinal cord crush injury by bone marrow stromal cell transplantation and chondroitinase ABC microinjection in adult rats[J].Journal of Southern Medical University,2010,30(9):2030-2035.

    [2] Jones LL,Sajed D,Tuszynski MH.Axonal regeneration through regions of Chond-roitin sulphate proteoglycan deposition after spinal cord injury: abalance of permissiveness and inhibition [J].JNeurosci,2003,23(28):9276-9288.

    [3] 胡榮, 周建軍, 吳國(guó)才,等. 大鼠脊髓損傷后軸突病理變化與膠質(zhì)瘢痕形成的關(guān)系[J]. 中華神經(jīng)外科雜志, 2008,24(4):304-306.

    [4] Homor PJ,Cage FH.Regenerating the damaged central nervouis system[J].Nature,2000,295(5572):1029-1031.

    [5] Plant CW,Bates ML,Bunge MB.Inhibitory proteoglycan immunoreactivity is higher at the caudal than the rostral Schwann cell graft-transected spinal cord interface[J].Mol Cell Neurosci,2001,17(3):471-487.

    [6] Morgenstern DA,AsherRA,F(xiàn)awcett JW.Chondroitin sulphate proteoglycans in the CNS injury response[J].Prog Brain Res,2002,137:313-32.

    [7] 張海燕,楊朝陽(yáng),李曉光,等.大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的病理學(xué)規(guī)律[ J ].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(3):215-218.

    [8] 黃凱,盛偉斌.大鼠脊髓膠質(zhì)瘢痕形成的規(guī)律[J].中國(guó)組織工程研究,2012,16(20):3671-3674.

    [9] Xu J,Sun D,Liu H,et al.Effect of chondroitinase ABC on growth associate protein 43 and glial fibrillary acidic protein after spinal cord injury in rats[J].Chinese Journal of Reparative and Reconstruetive Surgery,2010,24(10):1212-1216.

    [10] Zhang T,Shen Y,Lu L,et al.Effect of chondroitinase ABC on axonal myelination and glial scar after spinal cord in rats[J].Chinese Journal of Reparative and Reconstruetive Surgery,2013,27(2):145-150.

    [11] Starkey ML,Bartus K,Barritt AW,et al.Chondroitinase ABC promotes compensatory sprouting of the intact corticospinal tract and recovery of forelimb function following unilateral pyramidotomy in adult mice [J].Eur J Neurosci,2012,36(12):3665-3678.

    [12] Yin YM,Lu Y,Zhang LX,et al.Bone marrow Stromal cells transplantation combined with ultrashortwave therapy promotes functional recovery on spinal cord injury in rats[J].Synapse,2015,69(3):139-147.

    猜你喜歡
    光密度超短波星形
    3 種角膜光密度評(píng)估近視Trans-PRK術(shù)后haze的比較
    星形諾卡菌肺部感染1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    傳染病信息(2022年2期)2022-07-15 08:55:02
    病理輔助診斷系統(tǒng)中數(shù)字濾光片的實(shí)現(xiàn)方法
    超短波聯(lián)合穴位按摩治療Ramsay-Hunt綜合征的臨床研究
    溫針灸配合超短波治療腰椎間盤(pán)突出癥的療效觀察
    帶有未知內(nèi)部擾動(dòng)的星形Euler-Bernoulli梁網(wǎng)絡(luò)的指數(shù)跟蹤控制
    小麥種子活力測(cè)定方法的比較
    機(jī)載超短波電臺(tái)鄰道干擾減敏特性建模與評(píng)估
    航空超短波通信鏈路余量分析系統(tǒng)設(shè)計(jì)
    應(yīng)用數(shù)字圖像技術(shù)測(cè)量炮口火焰的方法研究
    夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲色图av天堂| 午夜精品久久久久久毛片777| av国产免费在线观看| 亚洲色图av天堂| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 制服人妻中文乱码| 国产97色在线日韩免费| 99热这里只有是精品50| 不卡av一区二区三区| 激情在线观看视频在线高清| 黄色 视频免费看| 91字幕亚洲| 国产高清激情床上av| 色吧在线观看| 宅男免费午夜| 变态另类丝袜制服| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲av熟女| 欧美激情在线99| 一本久久中文字幕| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 精品久久蜜臀av无| 成人欧美大片| 麻豆成人av在线观看| 日本黄大片高清| 欧美日本亚洲视频在线播放| 岛国视频午夜一区免费看| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲avbb在线观看| 91九色精品人成在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| av中文乱码字幕在线| 日本黄大片高清| 久久人人精品亚洲av| 一进一出好大好爽视频| 国产黄色小视频在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 女同久久另类99精品国产91| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 两性夫妻黄色片| 69av精品久久久久久| 欧美日韩乱码在线| 国产精品av久久久久免费| 亚洲激情在线av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 一个人免费在线观看的高清视频| 日本a在线网址| 丝袜人妻中文字幕| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产日本99.免费观看| 校园春色视频在线观看| 亚洲最大成人中文| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 中文在线观看免费www的网站| 在线观看66精品国产| 国产高清激情床上av| a级毛片在线看网站| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲专区国产一区二区| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本黄大片高清| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 色综合亚洲欧美另类图片| 一进一出好大好爽视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 在线看三级毛片| 天堂影院成人在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 真实男女啪啪啪动态图| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av五月六月丁香网| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产野战对白在线观看| 黄色女人牲交| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 午夜免费激情av| 99热6这里只有精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 色综合婷婷激情| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲国产精品999在线| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产黄片美女视频| 精品乱码久久久久久99久播| bbb黄色大片| 国产成人精品久久二区二区免费| 美女免费视频网站| 欧美在线一区亚洲| 黄色丝袜av网址大全| 在线观看免费视频日本深夜| 色综合站精品国产| 国产日本99.免费观看| 特级一级黄色大片| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲五月婷婷丁香| 免费一级毛片在线播放高清视频| 精华霜和精华液先用哪个| 国产成人精品无人区| 亚洲男人的天堂狠狠| 日韩国内少妇激情av| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产午夜精品论理片| 国产在线精品亚洲第一网站| 中文字幕高清在线视频| 黄色日韩在线| 日本免费一区二区三区高清不卡| av欧美777| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美成人性av电影在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 成人三级做爰电影| 国产综合懂色| 日本熟妇午夜| www.自偷自拍.com| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99精品久久久久人妻精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 午夜福利在线在线| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲第一电影网av| 成人国产一区最新在线观看| 免费搜索国产男女视频| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲精品一区av在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 黄色丝袜av网址大全| 国内精品美女久久久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人三级做爰电影| 国产精品久久久久久久电影 | 国产爱豆传媒在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 怎么达到女性高潮| www日本黄色视频网| 最近最新免费中文字幕在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久欧美精品欧美久久欧美| 免费看十八禁软件| 国产1区2区3区精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 校园春色视频在线观看| 日韩欧美 国产精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 色综合婷婷激情| 亚洲国产看品久久| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 啦啦啦免费观看视频1| 久久久久九九精品影院| 99精品在免费线老司机午夜| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 午夜精品久久久久久毛片777| 无限看片的www在线观看| 久久这里只有精品中国| 偷拍熟女少妇极品色| 久久精品91无色码中文字幕| 久久久久性生活片| 国产精品99久久99久久久不卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产97色在线日韩免费| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲无线在线观看| 成人18禁在线播放| av中文乱码字幕在线| a级毛片在线看网站| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲片人在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲熟女毛片儿| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人欧美在线观看| 久久国产精品影院| 国产成人福利小说| 高清在线国产一区| 美女大奶头视频| 十八禁人妻一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 1024香蕉在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产亚洲av高清不卡| 综合色av麻豆| 午夜成年电影在线免费观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美高清成人免费视频www| 久久这里只有精品中国| av女优亚洲男人天堂 | 岛国在线免费视频观看| 麻豆一二三区av精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久国产成人免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 中文亚洲av片在线观看爽| 综合色av麻豆| 黑人欧美特级aaaaaa片| avwww免费| 欧美日韩一级在线毛片| 麻豆成人av在线观看| 九九热线精品视视频播放| 亚洲avbb在线观看| av中文乱码字幕在线| 俺也久久电影网| 韩国av一区二区三区四区| 美女黄网站色视频| 色av中文字幕| 999精品在线视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| www.熟女人妻精品国产| 在线视频色国产色| 很黄的视频免费| 久久香蕉精品热| 听说在线观看完整版免费高清| 精品久久久久久成人av| 男人舔女人的私密视频| 久久久久国内视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲av美国av| 高清在线国产一区| 国产三级在线视频| 青草久久国产| 国产黄片美女视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 99热精品在线国产| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲人成电影免费在线| 国产99白浆流出| 69av精品久久久久久| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| av在线蜜桃| 啪啪无遮挡十八禁网站| 最新美女视频免费是黄的| 成年版毛片免费区| 午夜福利18| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲人与动物交配视频| 成人三级黄色视频| 美女 人体艺术 gogo| 欧美日韩综合久久久久久 | 中文在线观看免费www的网站| 精品久久久久久,| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产黄色小视频在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 草草在线视频免费看| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一个人看视频在线观看www免费 | 免费在线观看成人毛片| 亚洲成人久久性| 天天躁日日操中文字幕| 国产午夜精品论理片| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美中文综合在线视频| 一a级毛片在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 母亲3免费完整高清在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 88av欧美| 国产人伦9x9x在线观看| 美女大奶头视频| 国产麻豆成人av免费视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美激情在线99| 国产熟女xx| 国产午夜精品久久久久久| 99久久成人亚洲精品观看| 在线视频色国产色| 国产成人欧美在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99精品久久久久人妻精品| 全区人妻精品视频| 成人午夜高清在线视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 99久久成人亚洲精品观看| 99re在线观看精品视频| 狂野欧美激情性xxxx| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 一本一本综合久久| 亚洲熟女毛片儿| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 成人国产一区最新在线观看| 久99久视频精品免费| 九九在线视频观看精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲国产欧美网| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 男女那种视频在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久久国产成人精品二区| 亚洲 国产 在线| 青草久久国产| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 韩国av一区二区三区四区| 国产精品九九99| 国产在线精品亚洲第一网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 精品久久久久久久久久久久久| 最新中文字幕久久久久 | 精品电影一区二区在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲熟女毛片儿| 一边摸一边抽搐一进一小说| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲精华国产精华精| 国产毛片a区久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 少妇的逼水好多| 变态另类丝袜制服| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品美女久久av网站| 午夜精品一区二区三区免费看| 日韩欧美三级三区| 国内精品久久久久精免费| 97超视频在线观看视频| xxx96com| 亚洲精品色激情综合| 精品久久久久久久久久久久久| 日本 av在线| 亚洲人成电影免费在线| 97碰自拍视频| e午夜精品久久久久久久| 国产高清视频在线播放一区| 国产精华一区二区三区| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久午夜亚洲精品久久| 色哟哟哟哟哟哟| www.www免费av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 波多野结衣巨乳人妻| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美性猛交黑人性爽| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产一区二区激情短视频| 中文字幕久久专区| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品电影一区二区三区| 综合色av麻豆| 无限看片的www在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一夜夜www| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 亚洲av熟女| 成人国产综合亚洲| 日本 欧美在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| h日本视频在线播放| 午夜福利在线观看吧| 成年版毛片免费区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 美女cb高潮喷水在线观看 | 日本黄色片子视频| 日韩欧美精品v在线| 国产97色在线日韩免费| 色噜噜av男人的天堂激情| 成人三级做爰电影| 一进一出好大好爽视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日本精品一区二区三区蜜桃| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产一区二区激情短视频| 中文字幕av在线有码专区| 舔av片在线| 国产精品99久久久久久久久| 51午夜福利影视在线观看| 岛国在线观看网站| 国产精品久久视频播放| 国产一区二区三区视频了| 久久久色成人| 好男人电影高清在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日本黄色片子视频| av欧美777| 级片在线观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 少妇的逼水好多| av在线天堂中文字幕| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品不卡国产一区二区三区| 一级作爱视频免费观看| 日韩精品青青久久久久久| 免费在线观看成人毛片| 美女午夜性视频免费| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产不卡一卡二| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美午夜高清在线| 国产激情欧美一区二区| 免费大片18禁| 黄色成人免费大全| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 国产美女午夜福利| 国产成人系列免费观看| 级片在线观看| 久久香蕉国产精品| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲成人久久性| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美3d第一页| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产熟女xx| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产 一区 欧美 日韩| 天堂动漫精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 制服人妻中文乱码| 国产黄a三级三级三级人| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av熟女| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 91麻豆精品激情在线观看国产| av黄色大香蕉| 99久久精品热视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 视频区欧美日本亚洲| 国产亚洲精品一区二区www| 91在线精品国自产拍蜜月 | 丰满的人妻完整版| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久中文字幕人妻熟女| 黄色成人免费大全| 久99久视频精品免费| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品,欧美在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲性夜色夜夜综合| 午夜日韩欧美国产| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 97超视频在线观看视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜亚洲福利在线播放| 在线a可以看的网站| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| av天堂在线播放| 午夜福利成人在线免费观看| 宅男免费午夜| netflix在线观看网站| 两个人视频免费观看高清| 亚洲熟女毛片儿| 午夜激情欧美在线| 国产不卡一卡二| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲九九香蕉| 九九在线视频观看精品| x7x7x7水蜜桃| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 99热精品在线国产| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 全区人妻精品视频| xxxwww97欧美| 国产欧美日韩一区二区三| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩欧美免费精品| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 日韩欧美免费精品| 日本黄色视频三级网站网址| 很黄的视频免费| 国产精品av视频在线免费观看| 日日夜夜操网爽| 我要搜黄色片| 久久精品91蜜桃| 国产亚洲欧美98| 精品国产美女av久久久久小说| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 一区二区三区激情视频| e午夜精品久久久久久久| 免费av毛片视频| 一级毛片精品| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国模一区二区三区四区视频 | 亚洲欧美精品综合久久99| 免费电影在线观看免费观看| 色综合婷婷激情| 中亚洲国语对白在线视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 精品人妻1区二区| 伦理电影免费视频| 舔av片在线| 女同久久另类99精品国产91| 欧美色欧美亚洲另类二区| 婷婷六月久久综合丁香| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品久久久久久久毛片微露脸| 欧美日韩精品网址| 日韩有码中文字幕| 男人舔女人下体高潮全视频| 看片在线看免费视频| 久久久久久久精品吃奶| 999久久久国产精品视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 在线免费观看的www视频| 国产精品亚洲美女久久久| 男人的好看免费观看在线视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产久久久一区二区三区| 国产一区二区在线av高清观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩av在线大香蕉| 黄色 视频免费看| 亚洲人与动物交配视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美日本视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲七黄色美女视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲avbb在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 午夜两性在线视频| 久久草成人影院| 十八禁网站免费在线| 国产毛片a区久久久久| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产亚洲精品av在线| 禁无遮挡网站| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩欧美 国产精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品99久久99久久久不卡| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲激情在线av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜a级毛片| 亚洲成av人片在线播放无| 免费观看的影片在线观看| www日本黄色视频网| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品免费久久久久久久清纯| 国内精品美女久久久久久| 国产激情久久老熟女| 久久久精品欧美日韩精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品久久蜜臀av无| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日韩三级视频一区二区三区| 曰老女人黄片| 亚洲成a人片在线一区二区| www.999成人在线观看| 成人国产综合亚洲| 免费在线观看成人毛片| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久这里只有精品19| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲最大成人中文| 在线免费观看不下载黄p国产 | 在线观看舔阴道视频| 久久性视频一级片| 午夜a级毛片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产淫片久久久久久久久 | 一区二区三区激情视频| 成人亚洲精品av一区二区| 舔av片在线| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美日本亚洲视频在线播放|