D—對(duì)羥基苯海因的細(xì)胞催化水解工藝優(yōu)化

賀瑩++高曉麗++段利強(qiáng)++喬元彪

摘 要： 從菌中的酶含量和酶活力兩方面對(duì)微生物酶催化水解的最佳條件進(jìn)行了探究。結(jié)果顯示，通過對(duì)試驗(yàn)菌種生長曲線的測定，發(fā)現(xiàn)該菌在22 h之內(nèi)為對(duì)數(shù)期，22～36 h為穩(wěn)定期，36 h后進(jìn)入衰退期。在此基礎(chǔ)上檢測前期誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌種內(nèi)的酶含量為3.6%，然后對(duì)該菌破胞后的酶粗提物和不破胞的菌體（全細(xì)胞）進(jìn)行了不同溫度和pH值梯度下的水解情況對(duì)比，得到兩者酶活力最高時(shí)的最佳溫度和pH值，前者最佳溫度為40 ℃，pH值為8，后者則最佳溫度為40 ℃，pH值為6。最后通過對(duì)比得出，酶粗提物的水解效果比全細(xì)胞的更佳。

關(guān)鍵詞：D-對(duì)羥基苯甘氨酸；D-海因酶；N-氨甲酰水解酶；微生物酶催化法

中圖分類號(hào)：O643.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.03.021

D-對(duì)羥基苯甘氨酸（D-HPG）主要用作合成青霉素和半合成頭孢霉素類藥物的重要中間體。用其生產(chǎn)的主要藥品有羥氨芐青霉素·阿莫西林、羥氨芐青霉素克拉維酸鹽、羥氨芐頭孢、羥氨芐唑頭孢、頭孢哌酮等，這些藥物用途廣泛，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、弓形菌、螺旋體等均有殺滅作用。此外，還被用于感光領(lǐng)域和用作鐵、磷、硅等的分析試劑，需求量呈逐年遞增趨勢(shì)。

我國作為青霉素生產(chǎn)大國，青霉素母核（6-APA）來源十分豐富，但是中國D-對(duì)羥基苯甘氨酸生產(chǎn)技術(shù)一直沒有很好解決，主要原料仍然依靠進(jìn)口，從而嚴(yán)重制約了半合成抗生素的發(fā)展，產(chǎn)品供求緊張、生產(chǎn)成本高、沒有競爭力。傳統(tǒng)的D-對(duì)羥基苯甘氨酸（D-HPG）的合成主要是化學(xué)合成和生物酶催化法。然而，化學(xué)合成D-HPG的方法污染較大，會(huì)產(chǎn)生氰化物，毒性高，污染嚴(yán)重，污水處理復(fù)雜，這種方法現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。與化學(xué)合成相比，生物酶催化法的污染較小，反應(yīng)條件相對(duì)溫和，而且選擇性和轉(zhuǎn)化效率都有一定的優(yōu)勢(shì)。所以，人們漸漸重視生物催化法的研究，主要集中在利用D，L-對(duì)羥基苯海因（D，L-HPH）為原料的經(jīng)酶催化合成 D-HPG 的方法上[5]。因此，發(fā)展我國自主原料D-p-HPG有極其深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義[1-2]。

目前有報(bào)道稱土壤桿菌（Agrobacterium sp），梭菌（Clostridium sp），消化球菌P（Petococus sp）、節(jié)桿菌（Arthrobacter sp）、賽氏桿菌（Serratia sp）、棒桿菌（Corynebacterium sp）具有D-p-對(duì)羥基苯海因酶活性，假單胞菌（Pseudomonas sp）和芽胞桿菌（Bacillus sp）具有D-p-對(duì)羥基苯海因酶和N-氨甲酰對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶雙酶活性。

酶法合成對(duì)羥基苯甘氨酸的反應(yīng)先后經(jīng)過兩個(gè)過程，即D-海因酶先催化底物DL-對(duì)羥基苯海因生成N-氨甲?；?D-對(duì)羥基苯甘氨酸，然后產(chǎn)物再在D-N-氨甲?；被崴饷傅淖饔孟律蒁-對(duì)羥基苯甘氨酸[3-4]。

1 材料和方法

1.1 試 劑

酵母浸膏，胰蛋白胨，NaCl，D-對(duì)羥基苯海因，標(biāo)準(zhǔn)品D-對(duì)羥基苯甘氨酸， DL-對(duì)羥基苯海因，氫氧化鈉，鹽酸，水合茚三酮，正丁醇為天津市天力化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Boxun潔凈工作臺(tái)（上海博訊有限公司），HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司），cence湘儀TDZ4-WS臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），cenceTGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），WiseMix VM-10漩渦混合器（Daihan scientific），弘祥隆DCTZ/W系列多用途恒溫超聲提取機(jī)，UV-2100雙光束紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光有限公司），1 mL和200 μL移液器，SY-8100高效液相色譜儀（北京北分瑞利分析儀器有限責(zé)任公司），LGJ-10冷凍干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 生長曲線的制作 根據(jù)所測得的不同培養(yǎng)時(shí)間段的OD值，計(jì)算出不同培養(yǎng)時(shí)間的5號(hào)菌的生長狀況的實(shí)際值，并制作成該菌的生長曲線[5]。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品D-對(duì)羥基苯甘氨酸（D-HPG）的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參照文獻(xiàn)[6]。

1.3.3 全細(xì)胞與酶粗提物的制備 發(fā)酵后離心，然后倒掉上清液，用超濾水重復(fù)上述步驟離心洗滌3次，洗滌完后，用該緩沖液將菌體配制成 1∶3 的菌懸液，置于合適的大塑料試管內(nèi)備用（全細(xì)胞）。

將大塑料試管置于冰浴中，采用恒溫超聲提取機(jī)超聲波破碎，破碎液于12 000 r·min-1下高速冷凍離心30 min，收集上清夜備用（粗酶液）。

1.3.4 酶活力的測定 酶活力單位：每1 mL發(fā)酵液收集的菌體每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol底物定義為1活力單位，參照文獻(xiàn)[7-8]。

1.3.5 溫度對(duì)酶活力的影響 取28個(gè)干凈的10 mL試劑瓶按表1分成14組，每組兩個(gè)重復(fù)，按表2稱取底物和細(xì)胞或酶粗提物，然后向每個(gè)試劑瓶中添加10 mL超濾水，pH值=7，封口，用保鮮膜包裹，放入不同溫度的搖床中水解4 h。

4 h后，將試劑瓶從搖床取出，用1 mL移液器按編號(hào)從試劑瓶中各取1 mL試劑移入1.5 mL離心管中，10 000 r·min-1，10 min離心。然后用高效液相色譜儀檢測產(chǎn)物的峰電平并記錄。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同溫度下全細(xì)胞和酶粗提物的酶活力，制作曲線，進(jìn)行對(duì)比。

1.3.6 pH值對(duì)酶活力的影響 試驗(yàn)方法與1.3.5相同，將 45 ℃培養(yǎng)并經(jīng)過分步誘導(dǎo)的5號(hào)菌液產(chǎn)生的全細(xì)胞和酶粗提物在40 ℃和pH值分別為4，5，6，7，8，9，10條件下進(jìn)行酶活力測定，并制作對(duì)比曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 5號(hào)菌的生長曲線

通過對(duì)37 ℃培養(yǎng)的菌液每2 h測1次OD值，做出5號(hào)菌的生長曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，5號(hào)菌的基本生長情況，因?yàn)榻拥木菍?duì)數(shù)期的菌，所以從培養(yǎng)開始到22 h這一段是菌的對(duì)數(shù)生長期，22～36 h是穩(wěn)定期，36 h后菌開始衰落。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品D-對(duì)羥基苯甘氨酸（D-HPG）的標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)品D-對(duì)羥基苯甘氨酸（D-HPG）的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

2.3 溫度對(duì)酶活力的影響

將 45 ℃分步誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h的菌液產(chǎn)生的全細(xì)胞和酶粗提物在pH值為7.0和溫度分別為30，35，40，45，50，55 ℃條件下水解進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，等量的5號(hào)菌的全細(xì)胞和酶粗提物在水解溫度為40 ℃時(shí)酶活力最高，酶粗提物的酶活力為15.23 μmol·g-1·h-1。然而從整個(gè)趨勢(shì)看來，在pH值=7的條件下，隨著溫度的變化，酶粗提物的水解酶活力要比全細(xì)胞水解的酶活力高。由此表明，在pH值=7，溫度為40 ℃的條件下，適合做酶粗提物水解。

2.4 pH值對(duì)酶活力的影響

將 45 ℃分步誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h的菌液產(chǎn)生的全細(xì)胞和酶粗提物在溫度為40 ℃和pH值分別為4，5，6，7，8，9，10條件下水解進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，等量的5號(hào)菌的全細(xì)胞和酶粗提物在40 ℃水解時(shí)，隨著pH值的升高，全細(xì)胞和酶粗提物的水解酶活力先升高后降低，在pH值=6時(shí)全細(xì)胞活力達(dá)到最高，酶粗提物酶活力達(dá)到最高時(shí)的pH值為8。由此表明，在溫度為40 ℃，pH值=8的條件下，適合做酶粗提物水解。

通過以上的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出，5號(hào)菌中的蛋白含量占到細(xì)胞的3.6%，在此前提下，取等量的細(xì)胞一部分破胞，一部分保留全細(xì)胞做水解，檢測出兩者酶活力最高的最佳溫度和pH值，前者為40 ℃，pH值=8，后者為40 ℃，pH值=6。然后在兩者各自酶活力最高的最佳條件下做水解，仍然是取等量的細(xì)胞一部分破胞，一部分保留全細(xì)胞，檢測得出在水解相同時(shí)間后，只占細(xì)胞3.6%的酶粗提物的水解效果更好，反應(yīng)速度更快。

3 結(jié) 論

筆者通過試驗(yàn)，利用自選菌種，從菌的酶含量和酶活力兩方面對(duì)微生物酶催化水解的最佳條件進(jìn)行了研究。通過對(duì)試驗(yàn)菌種生長曲線的測定，發(fā)現(xiàn)該菌在22 h之內(nèi)為對(duì)數(shù)期，22～36 h為穩(wěn)定期，36 h后進(jìn)入衰退期。在此基礎(chǔ)上檢測前期誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌種內(nèi)的酶含量為3.6%，然后對(duì)該菌破胞后的酶粗提物和不破胞的菌體（全細(xì)胞）進(jìn)行了不同溫度和pH值梯度下的水解情況對(duì)比，得到兩者酶活力最高時(shí)的最佳溫度和pH值，前者最佳溫度為40 ℃，pH值為8，后者則最佳溫度為40 ℃，pH值為6。研究認(rèn)為，酶粗提物的水解效果比全細(xì)胞的更佳。

參考文獻(xiàn)：

[1] 董妍玲，譚新國，潘學(xué)武.海因酶法制備D-對(duì)羥基苯甘氨酸的研究進(jìn)展[J].氨基酸和生物資源，2009，31（3）：47-52.

[2] CHAO Y P， JUANG T Y， CHEM J T， et al. Production of d-p-hydroxyphenylglycine by n-carbamoyl-d-amino acid amidohydrolase-overproducing escherichia coli strains[J]. Biotechnology Progress， 1999， 15（4）：603-607.

[3] 科技部西南信息中心.D-對(duì)羥基苯甘氨酸的生產(chǎn)技術(shù)與市場要求[J]. 化工文摘， 2001（11）：44-45.

[4] 李業(yè)英，闞振榮，朱寶成，等.D-對(duì)羥基苯甘氨酸生產(chǎn)菌株的選育方法探討[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，24（5）：523-525.

[5] 王燕妮.D-對(duì)羥基苯甘氨酸生物合成研究進(jìn)展[J].雞西大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，11（11）：61-64.

[6] 張彥嶺，李公春.D-對(duì)羥基苯甘氨酸的合成研究[J].許昌學(xué)院學(xué)報(bào)，20102，29（2）：96-98.

[7] 付建忠，劉守信，周志輝，等.采用非均相酶催化法生產(chǎn)d-對(duì)羥基苯甘氨酸的方法：CN 1928103 B[P].2010-09-01.

[8] 宋慧敏，屠春燕，歐陽平凱.高效液相色譜法測定D-對(duì)羥基苯甘氨酸[J].南京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（4）：97-99.