北海道黃楊葉片離體培養(yǎng)及其細胞耐鹽性

孫寧++王赫++陳小強++李鳳

摘要：以北海道黃楊葉片為材料進行愈傷組織誘導及細胞增殖培養(yǎng)試驗，同時開展不同濃度NaCl脅迫下愈傷組織培養(yǎng)，探討外源激素對葉片離體培養(yǎng)的影響及其愈傷組織的耐鹽性。結(jié)果表明，北海道黃楊葉片誘導愈傷組織最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.3 g/L，有利于愈傷組織增殖的激素為2，4-D 0.5 mg/L；0.2% NaCl脅迫對愈傷組織生長影響較小，NaCl濃度高于0.4%時，隨鹽濃度升高愈傷組織脯氨酸含量增加，生長量急劇降低。

關(guān)鍵詞：北海道黃楊；愈傷組織；激素；鹽脅迫

中圖分類號：S792.119.04文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0096-02

收稿日期：2015-10-20

基金項目：天津市高等學校創(chuàng)新團隊（編號：TD12-5017）；國家級大學生創(chuàng)業(yè)訓練計劃（編號：201410061114）；天津市學院精品課程建設(shè)（植物細胞工程）。

作者簡介：孫寧（1979—），女，河北承德人，碩士，高級實驗師，從事生物技術(shù)方面的研究與教學。E-mail：sning79@sina.com。

北海道黃楊（Euonymus japonicus L.）是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬的常綠闊葉喬木，它具有極強的耐寒性，能耐-23.9 ℃低溫[1]。北海道黃楊具有樹體高大挺拔、四季常青、冬天有紅果可供觀賞等特點，同時還有較強的凈化空氣的效果，適合作為綠化美化環(huán)境樹種[2]。

我國鹽堿地總面積約3 460萬hm2以上，耕地鹽堿化760萬hm2，大約20%的土地發(fā)生鹽堿化[3]。我國鹽堿地主要分布在東北、華北的農(nóng)產(chǎn)區(qū)，特別是經(jīng)濟比較發(fā)達的沿海城市和生態(tài)環(huán)境比較脆弱的西北內(nèi)陸區(qū)域。要改變這些鹽堿地區(qū)溫帶城市中落葉樹種比較單調(diào)的模式，發(fā)展多層次的城市綠化，需要多種四季常青、環(huán)境污染小的耐鹽樹種。

[JP2]通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)篩選培育耐鹽性相對比較高的植物品種是提高鹽堿地的利用率、減少土地浪費的有效解決方法之一。目前，國內(nèi)外對北海道黃楊的離體培養(yǎng)已有部分研究，但大多集中在離體快繁方面，而利用愈傷組織培養(yǎng)來開展抗性育種研究極少。開展北海道的離體葉片愈傷組織培養(yǎng)及離體細胞鹽脅迫研究，可為篩選北海道黃楊耐鹽細胞系及抗鹽突變株的選育奠定基礎(chǔ)，并可為植物抗鹽育種研究提供理論支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

以完整無受損病蟲的北海道黃楊新生葉片為試驗材料。

1.2試驗方法

1.2.1外植體消毒將葉片用流水沖洗30 min，無菌條件下在75%乙醇中浸泡30 s后，用無菌水沖洗3次，再用0.1%氯化汞浸泡6 min，后用無菌水清洗4～5次。將葉片放置于無菌濾紙上吸干水分，剪為1 cm2左右?guī)~脈的方形葉塊，葉背向下平鋪接種于不同配方的培養(yǎng)基上。

1.2.2初代培養(yǎng)試驗基本培養(yǎng)基采用MS（蔗糖30 g/L、瓊脂6.3 g/L，pH值5.8左右），附加不同濃度的6-BA、NAA、2，4-D，共設(shè)10個處理。培養(yǎng)溫度25 ℃，光照強度1 200～1 500 lx，光照時間12～14 h/d。接種后每隔7 d觀察統(tǒng)計1次誘導率。

1.2.3愈傷組織增殖培養(yǎng)無菌條件下將葉片四周長出的愈傷組織切下，用刀片壓碎至小顆粒狀，均勻接入到繼代增殖培養(yǎng)基中?；九囵B(yǎng)基采用MS（蔗糖30 g/L、瓊脂6.3 g/L，pH值為5.8左右），附加不同濃度的NAA、2，4-D，共設(shè)6個處理。培養(yǎng)溫度25 ℃，暗培養(yǎng)。接種后每隔7 d觀察1次愈傷組織變化。

1.2.4愈傷組織鹽脅迫培養(yǎng)將增殖培養(yǎng)獲得的愈傷組織稱重記錄后，按“2.2.3”節(jié)方法均勻接種到含不同濃度的NaCl的培養(yǎng)基中?；九囵B(yǎng)基采用“2.2.3”節(jié)所篩選優(yōu)化的配方，NaCl濃度設(shè)置0（CK）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、10%，培養(yǎng)條件同上。接種后每隔7 d觀察1次北海道黃楊愈傷組織在NaCl脅迫下的生長情況，測定游離脯氨酸含量。

2結(jié)果與分析

2.1不同激素濃度對葉片愈傷組織誘導的影響

葉片接種30 d后由愈傷組織誘導情況見表1。從表1可以看出，A2處理愈傷組織誘導率高達82.3%，但誘導愈傷組織量很小；而A8、A10處理誘導率相對較高，均為80%，且愈傷組織的形成量也較多；A7處理誘導率相對較低，為59%，但誘導形成的單塊愈傷組織體積較大。

將未誘導出愈傷組織、誘導出少量愈傷組織和誘導出少量愈傷組織且褐化的3種葉片再次轉(zhuǎn)接入A8、A10處理中進行培養(yǎng)。經(jīng)過10 d后，原本未誘導出愈傷組織的葉片四周開始長出黃白色的愈傷組織，質(zhì)地疏松為顆粒狀；而原有少量愈傷組織的葉片四周也開始繼續(xù)增殖愈傷組織，同樣為黃白色，質(zhì)地疏松；誘導出愈傷組織但愈傷組織褐化的葉片，能夠在本已褐化了的組織周圍長出新的淺黃色半透明狀愈傷組織，其質(zhì)地柔軟疏松。

2.2不同激素濃度對愈傷組織增殖的影響

將葉片誘導獲得的愈傷組織接入6種增殖培養(yǎng)基中，14 d 后愈傷組織呈黃白色、質(zhì)地堅硬的小塊狀。用濃度為 0.5 mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基對愈傷組織的增殖效果最好，其次為添加2，4-D 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L的處理，增殖效果也比較好，愈傷組織增殖量較多；而濃度為0.2 mg/L 2，4-D、NAA的處理雖然都對愈傷組織有增殖效果，但是增殖的速度非常慢，且增殖量非常少（表2）。同時發(fā)現(xiàn)在接種20 d后，所有愈傷組織都開始出現(xiàn)褐化，且增殖速度越快、增殖量越多愈傷組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象的時間越早，并且褐化程度也越嚴重；此時的愈傷組織顏色為褐色，質(zhì)地變軟，不再呈堅硬的小塊狀。接種30 d后，全部愈傷組織褐化。因此繼代增殖轉(zhuǎn)接周期以18～20 d為宜。

2.3NaCl脅迫對愈傷組織的影響

2.3.1NaCl脅迫對愈傷組織生長的影響

2.3.1.1愈傷組織在不同濃度NaCl脅迫下的形態(tài)特征

將增殖培養(yǎng)獲得的愈傷組織接入含NaCl培養(yǎng)基中，14 d后，愈傷組織發(fā)生輕微的褐化現(xiàn)象，且隨著培養(yǎng)時間的延長褐化現(xiàn)象逐漸嚴重。其中處理1、處理2仍有部分愈傷組織可保持增殖生長，而處理3-處理6的愈傷組織生長量隨著NaCl濃度的逐漸升高而減少，并且出現(xiàn)較為嚴重的褐化現(xiàn)象。培養(yǎng)20 d的愈傷組織生長狀況見圖1。從圖1可以看出，生長量均隨著NaCl濃度增大而減小，同時褐化現(xiàn)象越來越明顯。

[FK（W9][TPSN1.tif；S+2mm]

2.3.1.2NaCl脅迫對愈傷組織生長量的影響

愈傷組織在6個NaCl濃度處理下培[JP3]養(yǎng)20 d左右，取出愈傷組織進行稱量，并與愈傷組織接種前鮮質(zhì)量取差值，計算出這段時間內(nèi)不同濃度NaCl脅迫下北海道黃楊愈傷組織鮮質(zhì)量增長量的平均值。從圖2可以看出，在NaCl脅迫下，北海道黃楊愈傷組織的鮮質(zhì)量增長量均呈下降趨勢，當NaCl濃度達0.2%時，愈傷組織鮮質(zhì)量增長量與對照相比降低18.69%；當NaCl濃度增大到04%，增長量與對照相比降低58.72%，愈傷組織增長量明顯減少，且褐化情況也比較嚴重。表明0.2% NaCl對北海道黃楊愈傷組織生長影響較小，NaCl含量大于0.4%時對其生長起到了明顯的抑制作用。

2.3.2NaCl脅迫下愈傷組織游離脯氨酸含量的變化

植物在正常狀態(tài)下，其體內(nèi)脯氨酸含量比較低而且較為平穩(wěn)，當植

[FK（W10][TPSN2.tif]

物遇到干旱、鹽堿等逆境時，其體內(nèi)脯氨酸含量會急劇上升，而且其脯氨酸積累指數(shù)與植物的抗逆性有關(guān)，因此，游離脯氨酸含量常作為植物抗逆性檢測的生理指標之一。

不同濃度NaCl脅迫下，北海道黃楊愈傷組織中游離脯氨酸的含量見圖3。北海道黃楊愈傷組織中游離脯氨酸的含量隨鹽濃度升高呈現(xiàn)先比較平緩后急劇上升趨勢，在無鹽及低濃度鹽脅迫的情況下，愈傷組織內(nèi)的游離脯氨酸含量均較低，隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度升高，脯氨酸含量變化呈急劇上升趨勢，在鹽濃度相對較高（1.0%）時游離輔基酸含量最高，達184.2 μg/g。

3討論

在誘導葉片愈傷組織階段，2，4-D 1.5 mg/L、6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L這2個激素配比對愈傷組織的誘導效果最好，誘導率最高。在試驗中發(fā)現(xiàn)在葉片培養(yǎng)前期誘導出愈傷組織量很低的葉片，在轉(zhuǎn)移到6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基中進行2次培養(yǎng)后，會促進葉片四周切口處愈傷組織的形成，誘導出愈傷組織厚度為1.0～1.5 cm。在愈傷組織增殖培養(yǎng)中，愈傷組織增殖生長啟動時間比較晚，15 d左右開始啟動，而在30 d時出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；0.5 mg/L 2，4-D對愈傷組織增殖效果最好。

在加入不同濃度NaCl的培養(yǎng)基中進行愈傷組織培養(yǎng)，NaCl濃度為0.2%時愈傷組織長勢沒有受到太大影響，當NaCl含量上升到0.4%以上時，愈傷組織生長量出現(xiàn)明顯的下降趨勢，褐化現(xiàn)象逐漸嚴重，游離脯氨酸含量增加。因此，在后續(xù)研究中可選用大于0.4%的濃度作為耐鹽細胞的誘變與篩選的NaCl濃度。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

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