血吸蟲核酸診斷方法研究進(jìn)展*

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·綜述·

血吸蟲核酸診斷方法研究進(jìn)展*

孫莉軍1，葉青2，趙友云3，齊自慧2，楊夢歌2#綜述,王業(yè)富2△#審校

(1.湖北省臨床檢驗中心，湖北武漢 430064；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病毒學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，

湖北武漢 430072；3.湖北省中醫(yī)院，湖北武漢 430061)

關(guān)鍵詞:血吸蟲病；早期診斷；核酸診斷

血吸蟲病是由裂體吸蟲屬血吸蟲引起的一種熱帶性疾病。主要通過接觸血吸蟲疫水，尾蚴經(jīng)接觸部位的皮膚、黏膜侵入人體而造成感染。根據(jù)WHO報告，全世界有超過2億人感染血吸蟲病，孩童的感染率高于成人，我國是日本血吸蟲病流行最嚴(yán)重的4個國家之一。血吸蟲病的診斷通常是通過顯微觀察排泄物中的蟲卵來確定[1]。但這種方法的靈敏度不高，糞便中排出蟲卵分布不均勻和排出量的波動性會對結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響[2]?，F(xiàn)行主要的血吸蟲病診斷方法包括病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和核酸診斷，另外還有超聲診斷技術(shù)，條形碼技術(shù)診斷等方法診斷血吸蟲病[3]?，F(xiàn)有研究表明核酸診斷對發(fā)現(xiàn)血吸蟲早期感染有較明顯優(yōu)勢，本文就核酸診斷的方法進(jìn)展作一綜述。

1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法

PCR采用DNA聚合酶，以單鏈DNA為模板，以脫氧核苷酸為底物合成DNA。到如今PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，演變出了熒光定量PCR、巢式PCR等一系列PCR技術(shù)。

1.1常規(guī)PCR法常規(guī)PCR法是提取患者的糞便、尿液與血液中的血吸蟲DNA為模板用于PCR檢測的一種核酸檢測方法。有研究表明，在最初的感染后4周，在宿主體內(nèi)血清中的日本血吸蟲DNA主要來自于死亡的血吸蟲蚴體和血吸蟲在生長過程中的外皮脫落物。這就為血吸蟲的早期檢測核酸引物設(shè)計奠定了基礎(chǔ)[4]。陸正賢等[5]探索了PCR檢測法在日本血吸蟲感染早期檢測的特異性和敏感性。最終能在早期感染后1周在日本血吸蟲的成蟲、蟲卵、日本血吸蟲感染家兔的肝組織、糞便和外周血清中均擴(kuò)增到相對分子質(zhì)量為230 bp的特異性陽性條帶，比糞檢法和免疫學(xué)方法早3～6周。該方法首創(chuàng)在感染第1周即能擴(kuò)增出特異性DNA陽性條帶，且從日本血吸蟲感染宿主血清中檢測出特異性DNA。說明PCR檢測法具有一定的療效考核價值。Lodh等[6]用濾紙過濾尿液沉降物，提取其中物種專一性的重復(fù)片段，使用曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲的特異引物PCR擴(kuò)增，相比糞檢蟲卵法，PCR擴(kuò)增特異性引物有著更高的敏感性和特異性。此種方法有著更高的敏感性和特異性，可以檢測糞檢法和血尿癥未檢測出來的患者。此外，此種方法可使用單個尿液標(biāo)本單個或同時檢測出曼氏血吸蟲和埃及血吸蟲。

1.2熒光定量PCR熒光定量PCR(FQ-PCR)是1996 年由美國Applied Biosystems 公司推出的一種新定量試驗技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。秦圓方[7]在國內(nèi)首次建立了SYBR GREEN熒光定量糞檢PCR法，建立了糞樣蟲卵數(shù)與定量PCR結(jié)果的定量關(guān)系，可望以PCR法精確測定日本血吸蟲感染度。此方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、可估計感染度等優(yōu)點(diǎn)。18SrRNA是核糖體RNA中的一類，存在核糖體當(dāng)中與其他核糖體RNA和核糖體蛋白構(gòu)成核糖體參與蛋白質(zhì)的翻譯，18SrRNA經(jīng)研究具有很高的保守性，且在血吸蟲基因組中拷貝數(shù)相當(dāng)大。周立等[8]根據(jù)日本血吸蟲18S小亞基單位核糖體核酸(18SrRNA)基因設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測克隆后的日本血吸蟲18SrRNA基因。最終重復(fù)性試驗表明穩(wěn)定性好，整個實驗可在3 h內(nèi)完成對樣品的檢測，用時短，最低能夠檢測出6.15 pg的血吸蟲18SrRNA，靈敏度高。王本敬[9]通過比較4種基因：pSjrh1.0、18SrRNA、SjR2的G55A克隆在基因組中的豐度，初步確定SYBR Green I熒光實時定量PCR(RQ-PCR)方法檢測日本血吸蟲的較適宜靶基因和反應(yīng)條件。結(jié)論表明RQ-PCR具有較高的準(zhǔn)確性、特異性。官威[10]建立了一種靈敏，高效的日本血吸蟲Taqman real-time PCR定量檢測法，選取日本血吸蟲高度重復(fù)基因SjR2為靶序列設(shè)計引物和Taqman探針，和曼氏血吸蟲、肝吸蟲、旋毛蟲、肺吸蟲均無交叉反應(yīng)，檢測日本血吸蟲SjR2基因重組質(zhì)粒梯度最小濃度為4.47×10 copies/μL，表明熒光定量PCR檢測法敏感度高、特異性強(qiáng)，具有潛在的應(yīng)用價值。

1.3巢式PCR巢式PCR是一種變異的PCR，使用兩對(而非一對)PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物，結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。劉愛平等[11]通過優(yōu)化巢式PCR反應(yīng)體系，在低存活量的成蟲感染家兔血清中3 d即可擴(kuò)增到特異性目的條帶，檢出血吸蟲成蟲，具有很高的敏感性。Guo[12]篩選出了一段相對分子質(zhì)量為303 bp的序列作為DNA檢測的靶序列，能夠快速在感染血吸蟲的家兔血清中擴(kuò)增到目的片段。童群波等[13]選取日本血吸蟲高拷貝420 bp的Sjα1基因片段，設(shè)計了2對巢式引物擴(kuò)增該基因片段，2周即能從血清和全血樣本中檢出特異性DNA。

2LAMP法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)于2000年由日本學(xué)者Notomi在Nucleic Acids Res雜志上首次公開發(fā)表。其特點(diǎn)是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4種特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60～65 ℃恒溫擴(kuò)增，15～60 min左右即可實現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增，具有操作簡單、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測等特點(diǎn)[14]。

許靜[15]在參考陸正賢已建立的常規(guī)PCR法檢測血吸蟲病的基礎(chǔ)上，建立了LAMP法，LAMP法的靈敏性和特異性均高于PCR法，且敏感性顯著高于PCR法，約為PCR法的104倍。在療效考核的實驗中，LAMP法較PCR法晚一周轉(zhuǎn)陰，即第13周時轉(zhuǎn)為陰性，顯示出其具有更高的敏感性。曹仁祺[16]建立了糞便中血吸蟲蟲卵的LAMP檢測方法和PCR檢測方法，選取日本血吸蟲基因組中高度保守的多拷貝重復(fù)序列rbp基因為靶序列進(jìn)行LAMP引物設(shè)計。不僅顯示出較PCR更高的敏感性，且對牛常見的病原體也有較好的特異性。王岑[17]選取了4種日本血吸蟲基因組重復(fù)序列作為擴(kuò)增片段，并且篩選出一組特異性強(qiáng)、敏感性高的引物，優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了一種檢測全血的簡便、快速和高敏感性LAMP方法。

3基因芯片檢測

基因芯片檢測是一塊帶有DNA微陣列的特殊玻璃片或硅芯片片，在數(shù)平方厘米之面積上布放數(shù)千或數(shù)萬個核酸探針；檢體中的DNA、cDNA、RNA等與探針結(jié)合后，借由熒光或電流等方式偵測。經(jīng)由一次測驗，即可提供大量基因序列相關(guān)信息。它是基因組學(xué)和遺傳學(xué)研究的工具。

周鈞等[18]運(yùn)用基因芯片技術(shù)與曼氏血吸蟲、埃及血吸蟲及其他所有基因進(jìn)行BLAST，均無同源性?；蛐酒梢淮涡源笠?guī)模檢測日本血吸蟲，尤其適用于血吸蟲病流行區(qū)現(xiàn)場的檢測及監(jiān)測，該方法解決了操作效率低和結(jié)果客觀性差等問題，具有快速、靈敏、特異性等優(yōu)勢，可獲得準(zhǔn)確、可靠的日本血吸蟲病流行病學(xué)資料，為及時地報告疫情，有效遏止疫情提供保障[19]。

基因芯片作為一種先進(jìn)的、大規(guī)模、高通量檢測技術(shù)，應(yīng)用于疾病的診斷，研究人員應(yīng)用基因芯片就可以在同一時間定量地分析大量(成千上萬個)的基因表達(dá)，具有信息量大、快速、可進(jìn)行高通量篩選以及數(shù)據(jù)一致性好等優(yōu)勢[20]。有相關(guān)報道利用基因芯片技術(shù)分析曼氏血吸蟲不同性別成蟲接觸后誘導(dǎo)的基因表達(dá)情況[21]。也有報道利用基因芯片技術(shù)分析日本血吸蟲尾蚴階段高表達(dá)的基因[22]。通過侵入，尾蚴將經(jīng)歷巨大的變化，并且釋放分泌產(chǎn)物以適應(yīng)新環(huán)境并且逃避宿主的免疫攻擊，利用基因芯片技術(shù)分析日本血吸蟲在尾蚴階段高表達(dá)的基因?qū)ρ芯垦x的檢測也具有深遠(yuǎn)意義。

4小結(jié)

血吸蟲病仍然是我國流行病防治重點(diǎn)工作之一，根據(jù)2012年全國血吸蟲病疫情通報，截至2012年底，全國仍至少有24萬血吸蟲患者[23]，我國日本血吸蟲病流行形勢仍然嚴(yán)峻。能夠在疫區(qū)建立快速準(zhǔn)確診斷血吸蟲病的方法是一種發(fā)展趨勢，而核酸檢測因其高敏感性、高特異性逐漸成為檢測血吸蟲病方法的熱門研究方向。同時，根據(jù)生物信息學(xué)方法、基因比對方法等，針對不同靶序列片段的核酸診斷方法也在進(jìn)一步研究，但目前為止尚未見到用于血吸蟲病流行疫區(qū)現(xiàn)場的核酸診斷報道。推測其原因可能有：(1)DNA的在標(biāo)本的提取過程中會有損失，無論是通過糞便或是血清提取血吸蟲DNA，因其復(fù)雜的提取過程、提取方法、提取試劑盒的不同，都會對血吸蟲基因組DNA造成一定的損失，而多拷貝的靶基因能夠在一定程度上彌補(bǔ)DNA提取有損失的缺陷。(2)通常在實驗室的研究方法是建立實驗動物模型，實驗動物模型中很多因素可人為控制，如選擇相同大小天數(shù)的家兔、感染相同數(shù)量的血吸蟲等，而疫區(qū)患者具有個體的差異性、自身的復(fù)雜性和感染病原體的多樣性。綜合上述情況對現(xiàn)場核酸檢測均會造成一定影響。(3)實驗條件和實驗操作限制了現(xiàn)場核酸檢測，大部分的核酸檢測都需要運(yùn)用PCR儀等，而LAMP技術(shù)對實驗環(huán)境要求極高，這些客觀條件都會對現(xiàn)場核酸檢測造成一定的限制和影響。(4)用于擴(kuò)增靶序列的基因種類有限，目前研究較多用于擴(kuò)增靶序列的基因主要有來源于曼氏血吸蟲的121 bp高度重復(fù)序列、18SrRNA基因、逆轉(zhuǎn)錄子SjR2、Sjrh1.0、線粒體DNA等，這些靶序列的特異性和敏感性在面臨現(xiàn)場核酸檢測時仍不夠理想。

理想的診斷檢測方法應(yīng)具備準(zhǔn)確度高、敏感度高、易于操作、價格低廉，盡量無創(chuàng)等特點(diǎn)。對于一些診斷來說，早期診斷和治療在阻止長期并發(fā)癥或者阻斷致病因子的傳播方面發(fā)揮著重要作用[24]。Zhou等[25]根據(jù)日本血吸蟲18S小亞基單位核糖體核酸(18SrRNA)基因設(shè)計特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測克隆后的日本血吸蟲18SrRNA基因，可以檢測到10 fg的日本血吸蟲，比傳統(tǒng)的PCR檢測靈敏100倍。同時，也能夠在感染后1周的小鼠血清中檢測到日本血吸蟲，在感染后4周的小鼠排泄物中檢測到日本血吸蟲，比鏡檢糞便中的蟲卵早了一個星期。LAMP雖然靈敏度也較高，反應(yīng)時間短，但LAMP方法對實驗環(huán)境要求太高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，假陽性問題比較嚴(yán)重。且相比熒光定量PCR方法，LAMP不能定量。熒光定量PCR相較傳統(tǒng)PCR特異性更強(qiáng)，通過引物和探針設(shè)計的“雙保險”，能夠避免檢測的假陽性。且靈敏度更高，分析PCR產(chǎn)物的對數(shù)期，通過自動化儀器收集的熒光信號，避免了人為因素干擾,且熒光定量PCR不需要對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實驗分析，操作簡單。而巢式PCR相較于熒光定量PCR的靈敏度也較低。目前核酸檢測技術(shù)中易于操作這一項仍有很大的提升空間，而準(zhǔn)確度和敏感度的提高，隨著技術(shù)和研究的不斷發(fā)展，可以用生物信息學(xué)尋找特異性和敏感性更高的靶序列。隨著對實驗環(huán)境和條件的降低，實驗操作步驟的簡化，血吸蟲核酸檢測的成本也能隨即下降。在無創(chuàng)方面，可以多開發(fā)針對糞便的檢測方法，而唾液、尿液也可以選作檢測樣本進(jìn)行開發(fā)研究，以簡化取樣，減少患者取樣這一過程帶來的創(chuàng)傷。

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(收稿日期：2015-07-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.01.032

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)01-0074-03

*基金項目：湖北省自然科學(xué)基金項目(2013CFB461)。

作者簡介：孫莉軍，女，湖北省臨床檢驗中心主任醫(yī)師，主要從事臨床微生物學(xué)檢驗質(zhì)量管理和臨床實驗室管理研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail：wangyefu@whu.edu.cn。