傷寒沙門菌LeuO調節(jié)蛋白研究進展

趙澤慧，李 強，何小麗，李凡飛，許立華

(寧夏大學農(nóng)學院動物科學系，寧夏銀川 750021)

傷寒沙門菌LeuO調節(jié)蛋白研究進展

趙澤慧，李 強，何小麗，李凡飛，許立華*

(寧夏大學農(nóng)學院動物科學系，寧夏銀川 750021)

LeuO是傷寒沙門菌復雜調控網(wǎng)絡的一個全局轉錄調節(jié)蛋白，其調控傷寒沙門菌許多參與生物過程的基因表達，尤其是可以調控幫助菌體在嚴苛環(huán)境下生存的基因。作為H-NS的備份LeuO根據(jù)不同的濃度作為活化劑和抑制劑差異性調節(jié)基因表達。LeuO還可誘導孔蛋白的表達，孔蛋白是一種良好的免疫原，當作為疫苗接種動物，刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，產(chǎn)生特異性免疫力。論文重點圍繞LeuO作為調節(jié)蛋白的調節(jié)機制和在免疫學以及其他相關最新研究成果進行綜述，以期為該類研究的開展提供參考。

LeuO；傷寒沙門菌；H-NS；孔蛋白

沙門菌(Salmonella)是革蘭陰性致病菌，一旦感染可以引起人和動物很高的發(fā)病率和病死率[1]。沙門菌通過污染食物和水感染人和動物。大部分的沙門菌血清型經(jīng)過小腸感染，最終導致宿主自限性胃腸炎；少部分沙門菌血清型可以引起宿主全身感染，如傷寒沙門菌，鼠傷寒沙門菌等。由于沙門菌感染宿主范圍廣泛，對生存條件要求低，且具有多重耐藥性，導致預防沙門菌病非常困難[2]。

革蘭陰性菌中大多數(shù)細菌外膜蛋白(outer membrane protein，Omp)均具有抗原特異性。與其他革蘭陰性菌一樣，沙門菌Omp能刺激易感的宿主產(chǎn)生細胞和體液免疫反應，因而可用于高效價抗體和疫苗的研究開發(fā)[3]。在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，OmpC和OmpF膜孔蛋白可以引起機體產(chǎn)生長時間抗體反應，產(chǎn)生的特異性免疫力可以保護宿主免受傷寒沙門菌的侵染[4]。除此之外，沙門菌Omp還可以幫助其抵御惡劣的外界環(huán)境，嵌入的蛋白質對細菌細胞也具有至關重要的作用，如溶質、蛋白質參與運輸和信號轉導。

LeuO全局調控涉及細胞多種多樣的功能如細菌毒力和菌體的生存。LeuO調節(jié)基因表達在沙門菌免疫應答的方面尤其重要，如上所述的菌體外膜孔蛋白。對LeuO的研究不但有助于了解傷寒沙門菌與外界的相互關系尤其是在極端條件下依然生存的機理，而且在免疫學上為開啟研發(fā)傷寒沙門菌疫苗和作為其他疫苗佐劑成為可能性。本文綜述了探究Leuo調節(jié)蛋白的過程，調控機制，表達條件以及生物學功能等方面的研究進展，并展望了其在生物技術領域中的應用前景。

1 LeuO調節(jié)蛋白

LeuO是原核生物最大轉錄調節(jié)器(LysR-type transcriptional regulators，LTTRs)的成員。LTTRs通過調控菌體基因的表達影響菌體細胞功能，如氨基酸的生物合成、芳香族化合物的分解代謝、抗生素耐藥性、氧化應激應答、固氮作用、細菌群體感應以及毒力因子的產(chǎn)生。LTTRs在經(jīng)典模式中不但可以活化不同基因的轉錄而且抑制自身的轉錄。一些LTTRs成員調節(jié)自身的表達，還有一些LTTRs的成員調節(jié)(激活或抑制)不止一個靶基因。研究普遍認為LTTRs的成員是雙重調節(jié)子。而LeuO可以作為解除抑制劑，研究表明其具有復雜的與DNA結合的位點[5]。LeuO的低聚物結構是一個四聚體，保證可以與DNA具有高親和力[6]。

研究LeuO的歷史過程曲折而復雜。有關LeuO調節(jié)蛋白首次報告指出，leuO基因的位置在leuABCD和ilvIH操縱子之間。由于LeuO的氨基酸序列與LysR家族的成員相似，所以當時將其歸為該家族成員。根據(jù)leuO基因的定位，研究者推測leuABCD為其操縱子，盡管leuABCD基因缺失株并沒有出現(xiàn)LeuO的缺失表現(xiàn)。該報告還闡明LeuO具有轉錄調節(jié)的作用。

LeuO調節(jié)蛋白參與細菌惡劣環(huán)境條件下與生存相關一些重要基因轉錄。在H-NS缺失菌株中尋找替代基因時發(fā)現(xiàn)，在大腸埃希菌中LeuO過表達可以抑制cadC基因的轉錄。這個發(fā)現(xiàn)使LeuO和H-NS產(chǎn)生聯(lián)系提供了新觀點。H-NS 是一種小組蛋白相似蛋白，廣泛存在于革蘭陰性菌中。H-NS 不僅參與基因組裝配，而且在基因調控中也起關鍵作用。CadC可以激活cadAB操縱子，這是在酸性條件下菌體表達的重要機制。在研究霍亂弧菌耐酸反應LeuO的作用表明，LeuO是cadC的抑制劑，LeuO的過表達導致了該菌對于有機酸敏感度增加[7]。LeuO還可以通過抑制小調節(jié)子Dsr-RNA(在低溫的條件下正調控rpoS轉錄)來減少rpoS基因的轉錄。而H-NS對cadC和dsrA基因的轉錄都是抑制作用。有趣的是LeuO對cadAB 操作子以及Rpos基因的轉錄的抑制都是間接作用。

基于LeuO是雙重調節(jié)子的研究，在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)LeuO可以正調節(jié)bgl和yjjQ-bglj操縱子。而H-NS可以抑制這些基因的表達。說明LeuO具有抵消H-NS效應的作用[8]。bgl操縱子參與一些β-糖苷的利用，而yjjQ-bglj基因編碼的轉錄調節(jié)因子是LuxR家族成員。 LuxR 家族調控蛋白是一類在革蘭陰性細菌群體感應中起重要作用的調控蛋白，它們參與由?；呓z氨酸內(nèi)酯介導的多種生物學過程， 如調控細菌生物發(fā)光、 質粒轉移、 生物膜形成以及多種胞外酶、 毒力因子和次生代謝產(chǎn)物的合成[9]。

隨后一些關于鼠傷寒沙門菌的研究中描述了一個叫順式作用啟動子中轉機制模型，其中描述LeuO可以與DNA超螺旋的位點相互作用。在這個復雜的調控機制里，亮氨酸-應答調節(jié)蛋白(Lrp)通過ilvIH啟動子活化從而引起局部DNA超螺旋的改變，暴露了leuO調節(jié)區(qū)域。而以上過程的順利進行都需要leuO的表達。而且，H-NS的結合位點在leuO調節(jié)區(qū)域內(nèi)部[10]。

2 沙門菌的調節(jié)蛋白LeuO

傷寒沙門菌LeuO的過表達引起了沉默編碼OmpS1和OmpS2孔蛋白基因的表達。在大腸埃希菌的研究中表明Leuo調節(jié)蛋白扮演著抑制沉默的作用[11]。而且LeuO的濃度差異會影響OmpS1和OmpS2孔蛋白的表達量。當LeuO濃度低的時候，ompS2基因表達；反之，ompS1基因表達時，ompS2表達被抑制。此外，在研究ompS1基因表達過程中發(fā)現(xiàn)LeuO具有拮抗H-NS的作用[12]。而到目前為止這種功能尚未在LTTRs其他成員中發(fā)現(xiàn)。但別的轉錄調節(jié)子成員，如VirF(AraC/XilS)、RovA(SlyA/Hor)和Ler(H-NS/StpA)在參與調節(jié)毒力基因表達時可作為H-NS的拮抗劑。

隨后在研究傷寒沙門菌過程中發(fā)現(xiàn)，LeuO正調控assT基因而負調控ompX、tpx等基因。這些基因參與多種多樣的細胞功能。AssT普遍認為是芳基硫酸鹽磺基轉移酶，可以將有毒的酚衍生物轉化為無毒的化合物，參與解毒過程[13]。OmpX是外膜蛋白(Omp), 缺乏OmpX時提高菌體對于十二烷基磺酸鈉和抗生素的耐受性，因而表現(xiàn)影響疏水性化合物的運輸[14]。沙門菌具有較強的生物被膜形成能力，在動物飼養(yǎng)環(huán)境和肉食品中更易存活，是隱性感染和反復感染的重要原因之一。LeuO負調控Tpx的表達量就是為了菌體在不同pH環(huán)境都可以生存[15]。

在研究鼠傷寒沙門菌基因組時，通過使用ChIP-chip,LeuO調節(jié)子成員范圍擴展到SPI-1和SPI-2上的基因。LeuO調節(jié)子由LeuO調節(jié)蛋白的編碼基因leuO及其調控的基因和操縱子所構成。LeuO特異性結合和對基因的調節(jié)主要依靠LeuO的濃度的改變 。另外一個重要發(fā)現(xiàn)是LeuO與內(nèi)含子的結合，因此LeuO很可能作為負調控蛋白抑制基因的轉錄或作為類核結構的蛋白。LeuO與H-NS和RNA聚合酶多個位點結合的發(fā)現(xiàn)確認了LeuO具有拮抗劑作用[5]。

3 LeuO的表達條件

菌體在一般情況下由于H-NS的存在，leuO基因處于靜默狀態(tài)。在惡劣的環(huán)境特別是在營養(yǎng)物質短缺的情況下，研究者才在大腸埃希菌和鼠傷沙門菌中檢測到了leuO基因的表達。另外，在磷酸鹽限制的培養(yǎng)基中也檢測到了LeuO的存在。leuO基因的表達不受rpoS調控，即使它的表達需要ppGpp(GDP 或 GTP 的衍生物四磷酸或五磷酸鳥嘌呤核苷)的存在[16]。LeuO對于恢復細胞生長很重要，當缺乏異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸時，細胞生長將延后2 h[17]。研究表明，leuO基因可以被RcsB和BglJ調節(jié)子激活[18]。在研究霍亂弧菌時發(fā)現(xiàn)ToxR可以激活leuO基因表達幫助菌體對抗膽汁侵蝕[19]。

4 LeuO的生物學功能

4.1 免疫學功能

LeuO在實驗室條件下表達量很少，在體內(nèi)可能主要參與細菌的生存。在小鼠感染模型中，傷寒沙門菌LeuO突變體表現(xiàn)毒力下降。而在霍亂孤菌的研究中，LeuO的缺失導致了生物膜形成的減少。

在小鼠模型中，ompC和ompF的雙突變菌株表現(xiàn)毒力下降。OmpC和OmpF孔蛋白介導機體產(chǎn)生持續(xù)的抗體，提供對于傷寒沙門菌病的免疫保護。這兩個孔蛋白在實驗室條件下都可以高水平表達。同樣的情況發(fā)生在缺乏ompS1和ompS2時，菌株也表現(xiàn)毒力下降。這表明沒有LeuO的調節(jié)或缺乏OmpS1、mpS2蛋白都會影響細菌生存。leuO基因、ompS1、ompS2沉默基因的缺失引發(fā)的菌體毒力下降，表明這些基因可以在體內(nèi)條件下表達。盡管這些孔蛋白在沙門菌的毒力方面發(fā)揮的作用還不是很清楚，但目前的研究都表明這些孔蛋白是溶質、營養(yǎng)物質以及毒素通過細菌外膜的通道。細菌正是因為有了這些孔蛋白得以在不同的環(huán)境下尤其是在有藥物存在的條件下依然可以生存、繁殖。

研究表明，OmpS1和OmpS2孔蛋白介導小鼠很強的免疫應答，且小劑量的孔蛋白就可為對抗傷寒沙門菌的感染提供顯著的保護。這兩種保護性抗原在菌體的感染機體過程中表達。這些研究具有相關性，它們?yōu)槭褂眠@兩種蛋白作為抗原開發(fā)針對傷寒和其他非傷寒沙門菌的疫苗成為可能性[20]。

4.2 作為H-NS的備選

研究表明，鼠傷寒沙門菌中活化的leuO抑制了SPI-1的轉錄翻譯，從而抑制了菌體侵襲上皮細胞[21]。Espinosa E等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在有金霉素的環(huán)境下表達的LeuO通過HilE抑制SPI-1上基因的表達以及抑制沙門菌入侵上皮細胞。HilE是由非SPI-1編碼的調節(jié)子，可以抑制hilD的表達。而HilD是由SPI-1編碼的正調節(jié)轉錄因子，可以調節(jié)SPI-1上其他基因的表達。通過體內(nèi)使用β半乳糖苷酶融合分析表明LeuO激活了hilE的表達[22]。而通過體外狹線印跡法電泳遷移率以及DNase足跡法分析證實LeuO可以和hilE的啟動子區(qū)域結合[22]。LeuO抑制SPI-1基因表達可能發(fā)生在菌體生長過程中而這時H-NS卻不知什么原因不能執(zhí)行這樣的功能。

LeuO作為菌體替代H-NS的備用選擇可能有兩個意義：一是LeuO可以讓沙門菌依然在不良的環(huán)境下生存。而這樣的條件下SPI-1上基因的表達在細菌生長階段，細菌顯然需要付出更高的成本代價；二是LeuO確保SPI-1基因在菌體侵染腸道時可以按特定順序恰當表達[21-23]。正因為如此,LeuO可以作為沙門菌H-NS的備用調節(jié)子，突出了LeuO作用模式的細微和差異。LeuO的功能就是根據(jù)不同的濃度作為活化劑和抑制劑差異性調節(jié)基因表達。

5 展望

通過對LeuO調控蛋白的研究，在治療以及預防傷寒沙門菌病等方面將具有重要意義。LeuO調控機制的深入研究 ,促進人們進一步了解相關抗生素對沙門菌的作用途徑和機制, 為沙門菌類疾病的治療研究提供分子生物學方面的理論依據(jù)。當然需要在極端環(huán)境或在leuO過表達的條件下探究其功能，直到現(xiàn)在仍沒有發(fā)現(xiàn)與LeuO相同的誘導物，這些都是未來需要研究的課題。

[1] Yue M, Schifferli D M. Allelic variation inSalmonella: an underappreciated driver of adaptation and virulence[J]. Front Microbiol ,2014, 4:419.

[2] Chen H M, Wang Y, Su L H. NontyphoidSalmonellainfection: microbiology, clinical features, and antimicrobial therapy[J]. Pediatr Neonatol ,2013,54(3):147-152.

[3] 郭曉雅. 沙門菌Omp D 介導的rBCG 口服疫苗的制備與鑒定[D].陜西西安：第四軍醫(yī)大學，2010.

[4] Secundino I, López-Macias C, Cervantes-Barragán L, et al.Salmonellaporins induce a sustained,lifelong specific bactericidal antibody memory response[J]. Immunology ,2006,117(1):59-70.

[5] Dillon S C, Espinosa E, Hokamp K,et al. LeuO is a global regulator of gene expression inSalmonellaentericaserovartyphimurium[J]. Mol Microbiol ,2012, 85(6):1072-1089.

[6] Guadarrama C, Medrano-López A, Oropeza R,et al. TheSalmonellaentericaserovartyphiLeuO global regulator forms tetramers: residues involved in oligomerization, DNA binding, and transcriptional regulation[J].Bacteriology,2014,196(12):2143-2154.

[7] Ante V M, Bina X R, Bina J E. The LysR-type regulator LeuO regulates the acid tolerance response inVibriocholerae[J]. Microbiology,2015,161(12):2434-2443.

[8] Stratmann T, Madhusudan S, Schnetz K. Regulation of the yjjQ-bglJ operon,encoding LuxR-type transcription factors, and the divergent yjjP gene by H-NS and LeuO[J]. Bacteriol ,2008, 190(3):926-935.

[9] 鄭世超,羅 瑛,魯 濤. LuxR 家族調控蛋白的結構及功能[J]. 生命科學,2010,22(9)：1004-0374.

[10] Chen C C, Wu H Y. LeuO protein delimits the transcriptionally active and repressive domains on the bacterial chromosome[J].Biol Chem,2005, 280(15):15111-15121.

[11] Ishihama A, Shimada T, Yamazaki Y. Transcription profile ofEscherichiacoli: genomic SELEX search for regulatory targets of transcription factors[J]. Nucleic Acids Res,2016,44(5):2058-2074.

[12] Dela Cruz M A, Fernández-Mora M, Guadarrama C, et al. LeuO antagonizes H-NS and StpA-dependent repression inSalmonellaentericaompS1[J]. Mol Microbiol ,2007, 66(3):727-743.

[13] Kang J W, Kwon A R, Kim D H. Cloning and sequencing of the astA gene encoding arylsulfate sulfotransferase fromSalmonellatyphimurium[J]. Biol Pharm Bull,2001,24(5):570-574.

[14] Otto K, Hermansson M. Inactivation of ompX causes increased interactions of type 1 fimbriatedEscherichiacoliwith abiotic surfaces[J]. Bacteriology ,2004,186(1):226-234.

[15] Kim Y H, Lee Y, Kim S, et al. The role of periplasmic antioxidant enzymes (superoxide dismutase and thiol peroxidase) of the Shiga toxin-producingEscherichiacoliO157:H7 in the formation of biofilms[J].Proteomics ,2006, 6(23):6181-6193.

[16] Fang M, Majumder A, Tsai K J. ppGpp-dependent leuO expression in bacteria under stress[J]. Biochem Biophys Res Commun,2000, 276(1):64-70.

[17] Majumder A, Fang M, Tsai K J,et al. LeuO expression in response to starvation for branched-chain amino acids[J]. Biol Chem,2001,276(22):19046-19051.

[18] Stratmann T, Pul U, Wurm R,et al. RcsB-BglJ activates theEscherichiacolileuO gene, encoding an H-NS antagonist and pleiotropic regulator of virulence determinants[J]. Mol Microbiol ,2012, 83(6):1109-1123.

[19] Ante V M, Bina X R, Howard M F,et al.VibriocholeraeleuO transcription is positively regulated by toxR and contributes to bile resistance[J]. J Bacteriol, 2015 ,197(22):3499-3510.

[20] Moreno-Eutimio M A, Tenorio-Calvo A, Pastelín-Palacios R,et al.SalmonellatyphiOmpS1 and OmpS2 porins are potent protective immunogens with adjuvant properties[J]. Immunology ,2013, 139(4):459-471.

[21] Sturm A, Heinemann M, Arnoldini M,et al. The cost of virulence: retarded growth ofSalmonellatyphimuriumcells expressing type III secretion system1[J]. PLoS Pathog ,2011, 7(7):e1002143.

[22] Espinosa E, Casadesús J. Regulation ofSalmonellaentericapathogenicity island 1 (SPI-1) by the LysR-type regulator LeuO[J]. Mol Microbiol ,2014,91: 1057-1069.

[23] Bustamante V H, Calva E. LeuO, a dormant sentinel for SPI-1[J]. Mol Microbiol,2014,91(6):1054-1056.

Advance in LeuO Transcriptional Regulator ofSalmonellatyphi

ZHAO Ze-hui，LI Qiang，HE Xiao-li，LI Fan-fei ，XU Li-hua

(SchoolofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia, 750021,China)

LeuO,as a transcriptional global regulator,is part of a complex regulatory network. It regulates the expression of genes involved in multiple biological processes，and specifically contributes to regulate expression of genes that help bacteria to survive stress conditions. LeuO could act as a backup regulator for H-NS，and as an activator or as a repressor depends on its concentration to regulate differential gene.It also can induce the expression of porins that have been shown to be immunogens and can be considered as antigenic candidates for vaccines.The porins can induce the host immune response and provide protective immunity toSalmonellainfection. Based on the recent research, the focus on the LeuO a transcriptional regulator in regulatory mechanism and immunology was summarized to provide new ideas for conducting such research in this review.

LeuO；Salmonellatyphi；H-NS ;porins

2016-05-27

寧夏“優(yōu)質高產(chǎn)奶牛遺傳改良與選育”專項(2013NYYZ0501)

趙澤慧(1990-),女,山西晉中人,碩士，主要從事預防獸醫(yī)學研究。 *通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2016)12-0086-04