干細胞和支架與牙髓再生及其血運重建

李州許慶安，2.口腔基礎醫(yī)學省部共建國家重點實驗室培育基地和口腔生物醫(yī)學教育部重點實驗室，武漢大學口腔醫(yī)學院；2.武漢大學口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 武漢 430079

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干細胞和支架與牙髓再生及其血運重建

李州1許慶安1，2
1.口腔基礎醫(yī)學省部共建國家重點實驗室培育基地和口腔生物醫(yī)學教育部重點實驗室，武漢大學口腔醫(yī)學院；2.武漢大學口腔醫(yī)院牙體牙髓病科 武漢 430079

［摘要］在牙髓再生中，獲取干細胞的方法包括干細胞移植、細胞歸巢和誘導出血。干細胞移植可產(chǎn)生異位的牙髓樣組織，可控制移植細胞的數(shù)量并選擇對牙髓再生潛在效能最佳的細胞亞種。細胞歸巢是指利用信號分子招募宿主內(nèi)源性干細胞至需治療的牙體根管中增殖和分化，形成牙髓-牙本質(zhì)樣組織。誘導根尖出血進入根管為年輕恒牙牙髓再生的一個重要步驟。支架是細胞在合成組織時的支撐結(jié)構(gòu)，可促進細胞黏附，為牙髓再生提供有利的環(huán)境。牙髓再生離不開血運重建或者血管再生，感染控制、根管預處理、冠方封閉等操作，可為牙髓再生包括其血運重建提供適宜的環(huán)境?？傊M織工程技術在牙髓領域的應用發(fā)展為牙髓再生帶來了新的希望。

［關鍵詞］牙髓再生；組織工程；干細胞；支架；細胞因子

牙髓被無讓性的牙本質(zhì)包圍，其血液供給缺乏有效的側(cè)支循環(huán)，因此牙髓一旦發(fā)生病變一般難以自身修復。此時通常會選擇去除牙髓、保留患牙為目的的治療方法，譬如根管治療。目前根管治療技術已臻成熟，成功率也較高，但根管治療后的牙體存在低血運和低感覺，易折，牙根不再發(fā)育等缺點，牙髓再生或許是解決這一問題的辦法之一。牙髓再生被定義為更換包括牙本質(zhì)、牙根結(jié)構(gòu)和牙髓-牙本質(zhì)復合體細胞這些受損結(jié)構(gòu)的基于生物學的過程［1］。就概念而言，再生包括牙髓血運以及神經(jīng)及其分布在牙本質(zhì)表面的成牙本質(zhì)細胞層等。與干細胞、支架和生長因子組織工程三大要素相類似，在牙髓再生中，干細胞、支架和生長因子以及適宜的環(huán)境都是不可或缺的重要要素。

1　干細胞與牙髓再生

據(jù)悉［2-3］至少有5種間質(zhì)干細胞可分化為牙髓干細胞（dental pulp stem cell，DPSC）、脫落乳牙牙髓干細胞、牙乳頭干細胞、牙囊干細胞、骨髓基質(zhì)干細胞等成牙本質(zhì)樣細胞，牙髓再生中優(yōu)先選擇DPSC［4］。目前，牙髓再生中利用干細胞的方式包括干細胞移植、細胞歸巢和誘導出血等。

1.1干細胞移植

細胞重現(xiàn)和組織工程技術在人體其他系統(tǒng)中發(fā)展較快，但其還沒有很好地應用到再生性牙髓治療當中。研究［5-9］證明，牙髓或其他干細胞移植可產(chǎn)生異位的牙髓樣組織，而且可以控制移植細胞的數(shù)量并選擇對牙髓再生潛在效能最佳的細胞亞種。

在臨床上，在一個需要做牙髓再生的患者口中獲取DPSC較難操作。當感染局限時，保留部分健康活髓或許可以提供內(nèi)源性干細胞，但這依賴于對牙髓狀態(tài)的準確判斷，且活髓切斷術在恒牙的成功率較乳牙要低。對于死髓牙，則需考慮從根尖區(qū)或血液中獲取干細胞，而且干細胞的數(shù)量和潛能隨著人年齡的增長而下降。理論上可以從第三磨牙中提取DPSC，經(jīng)試驗室培養(yǎng)處理后移植到需治療的牙體中。Alongi等［10］認為，炎癥會刺激干細胞的補充和分化，可以從感染的牙髓組織中提取干細胞，但仍有風險。其他的干細胞能否再生牙髓組織目前還缺乏確切的報道。異種和同種異體細胞移植都有免疫排斥的風險。細胞低溫貯藏有潛在的細胞損失和額外費用。細胞移植的花費和技術要求以及污染和細胞變異等風險，對于牙髓治療來說似乎較難接受。通過細胞移植進行牙髓再生還需要技術、管理及商業(yè)化上的發(fā)展作為支持，否則干細胞移植就只能停留在科學試驗階段而難以應用于臨床實踐［11］。

1.2細胞歸巢

細胞歸巢是細胞移植的替代選擇之一。細胞歸巢最初是指造血干細胞從骨髓遷移到外周形成干細胞龕，可擴展為宿主內(nèi)源性細胞的補充及隨后的組織［12］。牙髓再生中的細胞歸巢是指利用信號分子的誘導作用，招募宿主內(nèi)源性干細胞至需治療的牙體根管中增殖和分化，形成牙髓-牙本質(zhì)樣組織。信號分子被認為是激活再生過程的生物線索，包括生長因子、細胞因子以及一些化合物或激素等。Kim等［13］曾運用細胞歸巢的方法在仿上頜第一磨牙支架中實現(xiàn)了牙樣結(jié)構(gòu)的再生。

用于牙髓再生的生長因子有堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生長因子（plateletderived growth factor，PDGF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）7、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）β1和胰島素樣生長因子等［14-15］。bFGF、VEGF、PDGF和FGF2均有促進血管新生的作用，bFGF、VEGF和FGF2還能促進細胞趨化，VEGF促進有細胞絲分裂，NGF有利于神經(jīng)細胞的存活和生長，BMP7促進組織礦化。Kim等［16］將含生長因子的膠原蛋白支架置于預備后的根管中，再將其植入鼠背皮下3～6周發(fā)現(xiàn)，有血管、成牙本質(zhì)樣和神經(jīng)樣成分牙髓樣組織充滿根管全長。Torabinejad等［17］在再植的年輕前磨牙中注入富血小板血漿（plateletrich plasma，PRP），利用其所含的多種信號分子及其支架作用引導干細胞歸巢，從而實現(xiàn)牙髓再生，效果良好。

細胞歸巢避免了細胞移植所需要的細胞處理步驟，充分利用了患者自身干細胞，這在一定程度上減小了操作的難度和風險［18］。

1.3誘導出血

對于未發(fā)育成熟的死髓牙，誘發(fā)出血這一步可使大量未分化的間質(zhì)干細胞涌入根管，而且引入血液中干細胞的數(shù)量明顯較系統(tǒng)血液要高［19］。此方法長入根管內(nèi)的新生組織是牙周膜樣、牙骨質(zhì)樣或者骨樣的組織，這可能與干細胞來源于殘留活髓和根尖乳頭有關［20］。對于發(fā)育成熟的恒牙，誘導根尖出血理論上也可引入干細胞，具體效果仍需進一步研究證實。也有學者［21］認為，僅誘導出血不足以引導干細胞增殖分化成牙髓-牙本質(zhì)復合體，還應輔以生長因子。Galler等［22］認為，此種通過損傷來刺激機體自身愈合機制的方式，可募集已存在于患者體內(nèi)的細胞群落，解鎖機體與生俱來的再生能力。其可行性為最近的概念驗證研究所證明，前景廣闊［23］。與基于細胞的方法相對應，將這種方法稱為不依賴于細胞的方法。

近年來，臨床上運用該方法實現(xiàn)牙髓再生的病例多有報道［24-26］，且以年輕恒牙居多。部分病例中患牙牙根生長、根尖孔封閉和根管壁增厚且牙髓活力與對照牙相似。成熟恒牙相關的成功病例寥寥可數(shù)。Paryani等［27］報道了兩例牙根已發(fā)育完全的恒切牙的牙髓再生，根尖暗影減小直至消失，臨床癥狀消失，其中一例牙髓測試有反應。Saoud等［28］也報道了一例帶大面積根尖暗影的成熟死髓牙的牙髓再生，牙髓再生良好，除了牙髓測試無反應。這些病例給成熟恒牙的牙髓再生帶來了希望，但仍有待遠期臨床觀察和進一步的大樣本研究。

2　支架

支架是細胞在合成組織時的支撐結(jié)構(gòu)，可以促進細胞黏附，為牙髓再生提供有利的環(huán)境［29］。在組織再生中，細胞的活力及其增殖和分化，會受到支架的空隙大小、互聯(lián)性和降解率的影響［30］。

在牙髓再生研究中，常用的支架材料有天然聚合物、透明質(zhì)酸、脫乙酰殼多糖（舊稱殼聚糖）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）等。Zhang等［31］分別用膠原海綿、多孔陶瓷和纖維狀鈦網(wǎng)作為DPSC培養(yǎng)的三維支架，4周后都有礦化沉積和牙本質(zhì)涎蛋白表達；將其移植到小鼠皮下6～12周，均有牙本質(zhì)涎磷蛋白表達；但所形成的組織更類似結(jié)締組織而非牙本質(zhì)樣組織，而且只有陶瓷支架組有少量的細胞外基質(zhì)礦化物形成。李紅玖等［32］用牙髓中的DPSC和TGFB，以可吸收明膠海綿為支架加三氧化物聚合體（mineral trioxide aggregate，MTA）誘導冠髓再生。PLA、聚左旋乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-羥基乙酸共聚物和聚己內(nèi)酯這些合成聚合物無毒、可生物降解，其理化性質(zhì)（如機械強度、降解速率、孔隙率和微觀結(jié)構(gòu)）能精確控制，可用作牙髓再生的支架材料。

有研究用納米纖維作重建牙髓-牙本質(zhì)復合體的支架發(fā)現(xiàn)，納米纖維可促進細胞黏附、增殖和成牙本質(zhì)向分化。有學者認為，自組裝多肽水凝膠利用天然氨基酸模擬細胞外基質(zhì)，生物相容性和降解性能俱佳，其納米纖維狀結(jié)構(gòu)利于細胞間相互作用，且含肝素的結(jié)構(gòu)可結(jié)合保護并緩慢釋放生長因子（例如TGFB1、FGF2、VEGF等），這些在牙髓再生的臨床應用中都是至關重要的。對于根管這種狹窄的空間，可注射性支架或許更為適用。

近年來PRP、富血小板纖維蛋白和血凝塊也在牙髓再生中充當著支架角色。有研究在探討不同濃度的PRP支架在小型豬體內(nèi)趨化內(nèi)源性干細胞、誘導牙髓組織再生的能力時發(fā)現(xiàn)，合適質(zhì)量分數(shù)的PRP（例如50%PRP）釋放的生長因子可發(fā)揮最佳的效應，有利于干細胞歸巢并促進血管生成，其作為生物支架在體內(nèi)再生牙髓樣的組織是可行的，但需要對其理化性質(zhì)進行進一步修飾；如需從患者血液中提取PRP，技術敏感性和有創(chuàng)性可能限制其推廣。有報道稱誘導出血中根管內(nèi)無菌的血凝塊含干細胞和生長因子，血凝塊自身就可以作為三維支架介導組織再生。

此外，非血管化的支架尺寸通常較小，如果尺寸太大，物質(zhì)不能充分擴散，可能導致局部營養(yǎng)不足或代謝產(chǎn)物堆積。在體外試驗中，為了克服擴散限制，依靠灌注或流式的生物反應器，可促進支架內(nèi)分子更深層的交換。也有研究利用光蝕刻等精密加工技術制造組織工程支架，形成利于物質(zhì)交通的微通道和血管網(wǎng)。

3　牙髓再生的血運重建

在牙髓學文獻［4］中，牙髓血運重建通常定義為根管系統(tǒng)內(nèi)血管的再引入。近年關于牙髓血運重建的報道［24］較多，但大部分對象是年輕恒牙。有學者認為，血管重建和傳統(tǒng)根尖誘導及根尖屏障的區(qū)別在于同時有根管長度和管壁厚度的增加。牙髓再生離不開血運重建或者血管再生。無論是擴大根尖孔、利用脫位回植牙和壞死牙自身血流，還是促進其局部的血管再生，都值得研究；但若沒有疼痛反應或者神經(jīng)纖維、成牙本質(zhì)細胞層、間質(zhì)成纖維細胞以及干細胞，或許都不能被認為是完整的牙髓再生［11］。過度嚴格地區(qū)分，可能限制了新藥品、新設備、新治療方法的發(fā)展和研究，現(xiàn)在不去過度討論牙髓再生和牙髓血運重建的區(qū)別可能對其發(fā)展更為有利。在臨床中，感染控制、根管預處理、冠方封閉等操作，可為牙髓再生包括其血運重建提供適宜的環(huán)境。

3.1感染控制

牙髓治療的核心是控制感染，再生性治療更是如此。次氯酸鈉具有溶解壞死組織和涂層中有機成分，抑制或殺滅生物膜和牙本質(zhì)小管中的病原微生物的作用。乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）能螯合金屬離子和鈣離子，既能去除根管涂層，又能切斷細菌的營養(yǎng)而抑制細菌生長。臨床上二者常聯(lián)合應用。牙髓再生研究中常使用質(zhì)量濃度較高的根管沖洗劑。另有學者［24，32］提倡在髓腔、根管中封抗生素。也有研究認為使用三聯(lián)抗生素易致牙冠變色、細菌耐藥或機體變態(tài)反應。

3.2根管預處理

根管沖洗等操作除了有消毒滅菌的作用外，還可能影響細胞的行為。有學者報道，經(jīng)次氯酸鈉和EDTA處理過的牙本質(zhì)壁有利于細胞的黏附。有學者發(fā)現(xiàn)，用5.25%次氯酸鈉灌洗后的牙本質(zhì)表面會促進移植的干細胞分化成有吸收表層牙本質(zhì)功能的多核細胞；單獨或在次氯酸鈉后使用質(zhì)量分數(shù)17%的EDTA，干細胞可分化為成牙本質(zhì)樣細胞并有牙本質(zhì)涎蛋白表達。他們認為，EDTA使牙本質(zhì)表面脫礦，暴露并釋放生長因子；沖洗液的選擇和使用的次序等可能影響牙本質(zhì)的表面性能，從而影響細胞分化。

3.3冠方封閉

長期的冠部滲漏是牙髓治療失敗的主要原因之一。MTA可以有效減少冠方滲漏，為牙髓再生提供一個無菌的環(huán)境?？傊珼PSC移植從試驗室研究應用到臨床還有很多問題亟待解決。在細胞歸巢中，支架和信號分子的掌控有待進一步研究。將牙髓再生各要素最優(yōu)化，融為牙髓-牙本質(zhì)復合體仍面臨極大的挑戰(zhàn)。就目前的牙髓再生來說，不依賴于細胞的方法較之組織工程技術，從生物安全性、可實踐性、費用等方面考慮，可能更為適合；但是，現(xiàn)在仍缺乏隨機對照試驗或大樣本病例分析及長期的隨訪資料，治療成功的標準也還沒有統(tǒng)一的明確的界定，這些都限制著牙髓再生技術的應用；而且，臨床上的牙髓再生較多關注的是未發(fā)育成熟的牙體，如何擴大適應證、向成熟恒牙拓展成為一個普遍可行的臨床治療策略，仍需不斷地研究探索。

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（本文采編王晴）

Stem cells and scaffolds in dental pulp regeneration and revascularization

Li Zhou，Xu Qing’an.（1.The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology （Hubei-MOST） & Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education，School and Hospital of Stomatology，Wuhan University，Wuhan 430079，China；2.Dept.of Conservative Dentistry and Endodontics，Hospital of Stomatology，Wuhan University，Wuhan 430079，China）

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China（81000435） and the Natural Science Foundation of Hubei Province（2014CFB722）.

［Abstract］Regenerative endodontics is defined as biologically based procedures designed to replace damaged structures，including dentin and root structures，as well as cells of the pulp-dentin complex.The methods of acquiring stem cells include stem-cell transplantation，cell homing，and induced bleeding.Stem-cell transplantation can yield ectopic dental pulp-like tissues，with the advantages of easily controlling the number of cells transplanted and selecting the optimal subpopulation of stem/progenitor cells.Meanwhile，cell homing is defined as the migration of endogenous host stem cells to the root canal of the offending teeth using signaling molecules.The process is also characterized by the subsequent proliferation and differentiation of the endogenous host stem cells into pulp-dentin-like tissues.Inducing pulp bleeding into the root canals of immature permanent teeth is an important step in regenerative endodontics.Scaffold refers to the structural support for the cells that synthesize tissues.This component promotes cell attachment and provides a specific environment conducive to pulp or dentin regeneration.Pulp regeneration cannot take place without revascularization or angiogenesis.Procedures such as infection control，pretreatment of root canals，and coronal sealing，provide a favorable environment for pulp regeneration，including pulp revascularization.The application and development of tissue engineering technology in endodontics bring new hope for dental pulp regeneration，despite the occurrence of numerous problems.

［Key words］dental pulp regeneration；tissue en-gineering；stem cell；scaffold；growth factor

［收稿日期］2015-06-06；［修回日期］2016-02-29

［基金項目］國家自然科學基金（81000435）；湖北省自然科學基金（2014CFB722）

［作者簡介］李州，碩士，Email：xlizhou@163.com

［通信作者］許慶安，主任醫(yī)師，博士，Email：xuqingan@whu.edu.cn

［中圖分類號］Q 81

［文獻標志碼］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.011