牙齦卟啉單胞菌及其牙齦蛋白酶K對青少年牙齦健康的影響

韓志強(qiáng)柏?fù)P肖水清孫菲何萍.濟(jì)南市口腔醫(yī)院 濟(jì)南 5000；.濟(jì)南市第一人民醫(yī)院口腔科 濟(jì)南 50000；.濱州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院正畸教研室 濱州 5660

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牙齦卟啉單胞菌及其牙齦蛋白酶K對青少年牙齦健康的影響

韓志強(qiáng)1柏?fù)P2肖水清1孫菲3何萍1
1.濟(jì)南市口腔醫(yī)院 濟(jì)南 250001；2.濟(jì)南市第一人民醫(yī)院口腔科 濟(jì)南 250000；3.濱州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院正畸教研室 濱州 256603

［摘要］目的分析牙齦卟啉單胞菌（P.gingivalis）及牙齦蛋白酶K（Kgp）對青少年牙齦健康的影響。方法收集12～17歲青少年牙齦正常組（50例）、牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組（25例）和牙齦炎癥指數(shù)Ⅱ級組（32例）的3組齦溝液標(biāo)本，應(yīng)用16S rDNA PCR技術(shù)檢測各樣本中的P.gingivalis及Kgp。3組P.gingivalis和Kgp陽性檢出率的比較采用χ2檢驗(yàn)；P.gingivalis和Kgp的相對含量與牙齦炎癥指數(shù)之間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。結(jié)果P.gingivalis在牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組的檢出率大于牙齦正常組，牙齦炎癥指數(shù)Ⅱ級組的檢出率大于牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組和牙齦正常組，牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組、Ⅱ級組與牙齦正常組間有明顯差異（P＜0.01），牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組與Ⅱ級組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Kgp在牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組的檢出率大于牙齦正常組，牙齦炎癥指數(shù)Ⅱ級組的檢出率大于牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組和牙齦正常組，牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組與牙齦正常組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），牙齦炎癥指數(shù)Ⅱ級組與牙齦正常組間有明顯差異（P＜0.01）。P.gingivalis和Kgp的檢出率隨著牙齦炎癥指數(shù)的增加而升高。結(jié)論P(yáng).gingivalis和Kgp與青少年牙齦健康密切相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］青少年；牙齦卟啉單胞菌；牙齦蛋白酶K；牙齦炎

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）被認(rèn)為是慢性牙周炎最主要的致病菌，可產(chǎn)生多種毒力因子，其中牙齦素是牙齦卟啉單胞菌表面的一組蛋白酶，依據(jù)作用底物不同，可劃分為賴氨酸特異性牙齦蛋白酶（gingipain K，Kgp）和精氨酸特異性牙齦蛋白酶；其中，Kgp是最有潛能的纖維蛋白降解酶，在P.gingivalis致病性中起著重要作用［1］。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)具有高敏感性和特異性，被廣泛應(yīng)用于病原微生物的檢測。本研究采用16S rDNA PCR技術(shù)直接檢測青少年齦溝液的P.gingivalis，并對其相關(guān)毒力因子Kgp進(jìn)行檢測，結(jié)合牙齦炎癥指數(shù)進(jìn)行分析研究，以探討青少年齦溝液中P.gingivalis陽性個體中Kgp對牙齦健康的影響。

1　材料和方法

1.1主要試劑、儀器和實(shí)驗(yàn)菌株

2×EasyTaq PCR SuperMix PCR試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；引物（上海博尚生物技術(shù)有限公司合成）；梯度PCR儀（T-Gradient Thermoblock Biometra）、水平電泳槽、PAC-300型電泳儀制膠器和Gel-Doc2000凝膠成像和分析系統(tǒng)（Bio-Rad科技有限公司，美國）；P.gingivalis W83菌株（首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究中心）、P.gingivalis ATCC33277菌株、伴放線菌嗜血菌ATCC29522 菌株、具核梭桿菌ATCC25586菌株（口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川大學(xué)）。

1.2研究對象

從濟(jì)南市口腔醫(yī)院正畸科、口腔內(nèi)科隨機(jī)選擇年齡在12～17歲之間的青少年作為研究對象。其中牙齦正常組50例（男15例、女35例），牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組25例（男11例、女14例），牙齦炎癥指數(shù)Ⅱ級組32例（男15例、女17例）。所有受試者均無齲齒或齲齒已充填，無牙周或黏膜疾病，無家族遺傳病，3個月內(nèi)未服用抗生素或引起牙齦增生的藥物，并經(jīng)本人同意后加入本實(shí)驗(yàn)。

1.3牙齦炎癥指數(shù)測定

使用鈍頭牙周探針，牙齦檢查由同一位臨床醫(yī)師完成。檢查所有受試者同一牙的牙齦炎癥指數(shù)（gingivitis index，GI）為該受檢者的牙齦炎癥指數(shù)，其分級標(biāo)準(zhǔn)如下：（GI 0）0級為牙齦正

常，無炎癥或出血；（GI Ⅰ）Ⅰ級為輕度炎癥，牙齦有輕度顏色改變并輕度水腫、探診不出血；（GI Ⅱ）Ⅱ級為中度炎癥，牙齦顏色發(fā)紅，水腫光亮、探診出血。

1.4細(xì)菌檢測

1.4.1標(biāo)本采集無菌紙尖法采集所有受試者的齦溝液標(biāo)本，受試者常規(guī)清水漱口后，生理鹽水沖洗去除食物殘渣，棉卷隔離取樣牙，選取同一牙位，吹干牙面，將無菌紙尖插入齦溝內(nèi)，停留10～30 s取出，置入裝有1.5 mL生理鹽水的無菌EP管中，-20 ℃保存待測，所有檢查和操作均由同一檢查者完成。

1.4.2標(biāo)本DNA提取標(biāo)本溶解，離心（2 min，12 000 r·min-1，最大離心半徑為6 cm），棄上清，于沉淀中加200 μL裂解緩沖液，震蕩混勻，100 ℃水浴10 min，再離心（12 000 r·min-1，2 min），取上清150 μL作為模板，于-20 ℃保存。

1.4.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 分別設(shè)計P.gingivalis 16S rDNA、Kgp的特異性引物［2］。P.gingivalis引物序列中，F(xiàn)：5’-AGGCAGCTTGCCATACTGCG-3’，R：5’-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3’，片段大小404 bp，退火溫度57 ℃。Kgp引物序列中，F(xiàn)：5’-GAACTGACGAACATCATTG-3’，R：5’-GCTGGCATTAGCAACACCTG-3’，片段大小870 bp，退火溫度58 ℃。10×TransStart Taq Buffer 2.5 μL，引物各1.0 μL，TransStart Taq DNA Polymerase 0.5 μL，dNTPs 2 μL，模板DNA 10 μL，用無菌雙蒸水補(bǔ)充至總體積25 μL。循環(huán)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（33個循環(huán)），最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。Kgp循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min（33個循環(huán)），最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4.4PCR檢測首先以16S rDNA為引物，標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，P.gingivalis ATCC33277和P.gingivalis W83菌株做陽性對照；伴放線嗜血桿菌ATCC29522和具核梭桿菌ATCC25586做陰性對照；無菌雙蒸水做空白對照，檢測引物的特異性和反應(yīng)體系的敏感性。然后以16S rDNA為引物，臨床標(biāo)本DNA為模板，用于臨床標(biāo)本檢測，確定P.gingivalis陽性的患者；檢測結(jié)果P.gingivalis陽性患者進(jìn)一步檢測Kgp。

1.4.5 凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、染液進(jìn)行避光染色作為檢測樣本，將樣本分別加入瓊脂糖凝膠的樣品小槽內(nèi)；用1.5%瓊脂糖凝膠水平電泳，電壓100 V、時間20 min后，當(dāng)溴酚藍(lán)帶在凝膠中遷移約2/3時，停止電泳。用Ladder DNA Marker確定產(chǎn)物相對分子質(zhì)量，電泳凝膠在溴化乙錠中染色后，自動凝膠成像分析儀拍照存圖。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P.gingivalis和Kgp各組間檢出率比較用χ2檢驗(yàn)；P.gingivalis和Kgp的檢出率與牙齦炎癥之間的關(guān)系用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA PCR技術(shù)的特異性和敏感性結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示P.gingivalis的兩種參考菌株ATCC33277、W83的DNA擴(kuò)增后均得到清晰的404 bp特異性擴(kuò)增帶，而陰性對照伴放線菌嗜血菌ATCC29522、具核梭桿菌ATCC25586和空白對照未見擴(kuò)增帶（圖1），說明該引物具有擴(kuò)增P.gingivalis的特異性，這種PCR反應(yīng)體系具有檢測P.gingivalis的敏感性。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，P.gingivalis的兩種參考菌株ATCC33277、W83的DNA擴(kuò)增后均得到清晰的870 bp特異性擴(kuò)增帶，而陰性對照具核梭桿菌ATCC25586和空白對照未見擴(kuò)增帶（圖2）。

圖1　16S rDNA PCR對P.gingivalis的特異性檢測Fig1　 16S rDNA PCR specificity of detection of　P.gingivalis

圖2　16S rDNA PCR 對Kgp的特異性檢測Fig2　 The specificity of 16S rDNA PCR for Kgp detection

2.2 16S rDNA PCR 檢測結(jié)果

2.2.1 P.gingivalis的檢測結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果見圖3，其中陽性對照1和臨床標(biāo)本2、6、8、10均擴(kuò)增出404 bp特異性擴(kuò)增帶，空白對照9和臨床標(biāo)本3、4、5、7、9以及陰性對照11、12均未見目的條帶。

圖3　PCR檢測臨床標(biāo)本中P.gingivalis的結(jié)果Fig3　 The result of PCR in the detection of　P.gingivalis

2.2.2 Kgp的檢測結(jié)果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果見圖4，其中陽性對照1和臨床標(biāo)本3、5、6、8、9、10、12、13、14均擴(kuò)增出870 bp特異性擴(kuò)增帶，空白對照4和臨床標(biāo)本4、7、11以及陰性對照2均未見目的條帶。

圖4　PCR檢測臨床標(biāo)本P.gingivalis陽性中Kgp的結(jié)果Fig4　The result of　PCR detection of clinical specimens Kgp

2.2.3P.gingivalis和Kgp檢出率與牙齦炎癥指數(shù)之間的關(guān)系 經(jīng)統(tǒng)計，GI 0級、GIⅠ級和GIⅡ級的P.gingivalis的檢出率分別為30.00%、64.00%和87.50%，級間差異明顯（P＜0.01）。GI 0級、GIⅠ級和GIⅡ級的Kgp的檢出率分別為40.00%、75.00%和85.71%。GIⅠ級與GI 0級間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），GIⅡ級與GI 0級間差異明顯（P＜0.01），GIⅡ級和GIⅠ級間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

P.gingivalis在GI 0級（50例）檢出15例，檢出率30.00%，其中Kgp檢出6例，檢出率40.00%；P.gingivalis在GIⅠ級（25例）檢出16例，檢出率64.00%，其中Kgp檢出12例，檢出率75.00%；P.gingivalis在GIⅡ級（32例）檢出28例，檢出率87.50%，其中Kgp檢出24例，檢出率85.71%。

由此可以看出，P.gingivalis與Kgp檢出率隨著牙齦炎癥指數(shù)的升高而升高，Kgp的檢出率隨著P.gingivalis檢出率的增大而增大。P.gingivalis和Kgp檢出率與牙齦炎癥指數(shù)呈正相關(guān)。

3　討論

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)青春期兒童齦下菌斑與成人在細(xì)菌種類上無明顯差異。青少年齦炎的發(fā)生率日益增高，Alexander［3］認(rèn)為菌斑在牙齦炎的發(fā)生過程起著重要作用。研究［4］報道，美國14～17歲人群中有22%可檢測到牙周附著水平的喪失，表明牙周破壞發(fā)生很早。P.gingivalis是目前公認(rèn)的重要牙周致病菌并具有顯著的毒力或致病性［5-6］。國內(nèi)外已有報道P.gingivalis在青春期齦炎中有較高的檢出率，且其檢出率有隨檢測方法改進(jìn)和技術(shù)水平提高逐漸增大的趨勢。有學(xué)者利用多重PCR方法檢測齦溝液內(nèi)P.gingivalis與牙齦狀況的研究指出，P.gingivalis作為牙齦炎的優(yōu)勢致病菌，其檢出率隨牙齦病變程度的增加而升高。本實(shí)驗(yàn)選取12～17歲青少年作為研究對象，結(jié)果表明，P.gingivalis在牙齦正常者、牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組與牙齦炎癥指數(shù)Ⅱ級組間有顯著性差異，P.gingivalis的檢出率隨著牙齦炎癥指數(shù)的增加而升高。

研究［7］表明，在任一年齡組的兒童中均有P.gingivalis的一過性定植，而進(jìn)入青春期后P.gingivalis的定植趨于穩(wěn)定。P.gingivalis在兒童中的總體檢出率與成人相似，牙周正常者中也可檢測到P.gingivalis。研究［1］表明，P.gingivalis的多種毒力因子參與疾病的發(fā)生發(fā)展；其中，Kgp是最有潛能的纖維蛋白降解酶，參與病變牙齦的出血及與P.gingivalis有關(guān)的持續(xù)炎癥，在牙周疾病的致病性中起重要作用。Ozmeri?等［8］指出，人的血紅素包括l1個Lys殘基存在于a、b鏈，有3個Arg殘基存在于a、b鏈，所以是Kgp蛋白酶的首選底物，表明Kgp蛋白酶在P.gingivalis血色素的黏結(jié)和亞鐵血紅素聚集上起重要作用，因此Kgp也可在牙齦正常個體中表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中牙齦正常者中Kgp的檢出率為40.00%，亦證明此觀點(diǎn)。

Kgp能夠影響細(xì)菌的定植和生存、侵襲，破壞組織并且破壞宿主的免疫防御機(jī)制。牙齦炎癥組的Kgp比正常組明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義；牙齦炎癥指數(shù)Ⅱ級組Kgp檢出率比牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組高，但沒有明顯的差異。Kgp的檢出率依照炎癥程度的增大而增加，檢測值最高的也是炎癥嚴(yán)重的組。本研究發(fā)現(xiàn)Kgp的檢出數(shù)與青春期齦炎牙齦炎癥指數(shù)有顯著正相關(guān)關(guān)系，證明了Kgp與青春期齦炎的嚴(yán)重程度有密切關(guān)系。文獻(xiàn)報道有兩種Kgp基因分型方法，Beikler等［2］首次用限制性內(nèi)切酶方法研究了牙周炎患者中不同Kgp基因型的發(fā)生率，結(jié)果顯示兩種Kgp基因型的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。特異性的Kgp基因型在患病個體中的檢出率遠(yuǎn)高于健康個體。本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)青春期齦炎的Kgp在牙齦炎癥指數(shù)Ⅰ級組與牙齦炎癥指數(shù)Ⅱ級組之間有顯著性差異，可能與Kgp不同分型的表達(dá)有關(guān)，也可能與實(shí)驗(yàn)中被檢人群的身體狀況、所檢部位、取樣方法、樣本量較小以及采用的檢測方法等不一有關(guān)。

綜上所述，有必要檢測青少年齦溝液內(nèi)Kgp不同基因型的變化和致病性，早期預(yù)防牙齦炎癥反應(yīng)，防止發(fā)生不可逆性牙周損害。

4　參考文獻(xiàn)

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［8］Ozmeri? N，Preus NR，Olsen I.Genetic diversity of Porphyromonas gingivalis and its possible importance to pathogenicity［J］.Acta Odontol Scand，2000，58（4）：183-187.

（本文編輯駱筱秋）

Influence of Porphyromonas gingivalis and its gingipain K in healthy gingiva of teenagers

Han Zhiqiang1，Bai Yang2，Xiao Shuiqing1，Sun Fei3，He Ping1.（1.Jinan Stomatological Hospital，Jinan 250001，China；2.Dept.of Stomatology，The First People’s Hospital of Jinan，Jinan 250000，China；3.Dept.of Orthodontics，Hospital of Stomatology，Binzhou Medical University，Binzhou 256603，China）

［Abstract］ObjectiveTo explore the relationship of Porphyromonas gingivalis（P.gingivalis），gingipain K（Kgp） and puberty gingivitis in the subgingival.MethodsSubjects（12- to 17-year-old children） included 50，25，and 32 periodontally healthy，puberty gingivitis indexⅠ，and puberty gingivitis index Ⅱ children，respectively.16S rDNA PCR was conducted to detect P.gingivalis and Kgp from the samples.Chi-square test was performed to compare the prevalence of Kgp and P.gingivalis in the three groups.Spearman correlation analysis was also employed to evaluate the relationship between the relative quantity of Kgp and periodontal parameters.ResultsP.gingivalis in the puberty gingivitis index Ⅱ group was higher than that in the periodontally healthy group.Puberty gingivitis index Ⅱ was higher than puberty gingivitis index Ⅰ and periodontally healthy groups.Puberty gingivitis index Ⅱ，puberty gingivitis index Ⅱ，and periodontally healthy groups were significantly different from one another（P＜0.01）.Puberty gingivitis index Ⅰ was also significantly different from puberty gingivitis index Ⅱ（P＜0.05）.Kgp in the puberty gingivitis index Ⅰ group is higher than that in the periodontally healthy group（P＜0.01）.Puberty gingivitis index Ⅱ is higher than puberty gingivitis index Ⅰ and periodontally healthy groups.Puberty gingivitis index Ⅰ（P＜0.05） and puberty gingivitis index Ⅱ（P＜0.01） are significantly different from the periodontally healthy group.P.gingivalis and Kgp detection rates increased in the gingivitis index.ConclusionKgp and P.gingivalis are closely related to puberty gingivitis in the subgingival.

［Key words］teenagers；Porphyromonas gingivalis；gingipain K；gingivitis

［收稿日期］2016-01-02；［修回日期］2016-02-22

［作者簡介］韓志強(qiáng)，碩士，Email：826964972@qq.com

［通信作者］何萍，主治醫(yī)師，學(xué)士，Email：shqxiao@126.com

［中圖分類號］R 788

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［doi］ 10.7518/gjkq.2016.03.007