土茯苓藥材HPLC指紋圖譜研究及主成分的含量測(cè)定

張永貴，趙 力，楊小英（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

土茯苓藥材HPLC指紋圖譜研究及主成分的含量測(cè)定

張永貴＊，趙 力，楊小英#（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

目的：建立土茯苓藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜及同時(shí)測(cè)定其中落新婦苷、白藜蘆醇含量的方法。方法：采用HPLC法。色譜柱為Zorbax SB-C18，流動(dòng)相為甲醇-0.2%乙酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為306 nm，柱溫為30Ⅱ，進(jìn)樣量為20 μl。以落新婦苷為參照物，對(duì)13批樣品HPLC圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：13批樣品HPLC圖譜有12個(gè)共有峰，相似度均＞0.90。落新婦苷、白藜蘆醇檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為6.65～425.6、1.72～110 μg/ml（r均為0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為97.30%～102.30%（RSD＝1.97%，n＝6）、98.12%～104.02%（RSD＝2.57%，n＝6）。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為土茯苓藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考；該測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可用于土茯苓藥材中落新婦苷和白藜蘆醇含量的同時(shí)測(cè)定。

土茯苓；落新婦苷；白藜蘆醇；指紋圖譜；含量測(cè)定

土茯苓系常用中藥，為百合科植物光葉菝葜Smilax rhizoma的干燥根莖，有除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)之功效[1]。菝葜屬約有300種，我國約有60種，主產(chǎn)于四川、貴州[2]。由于同屬植物品種繁多、形態(tài)相近，導(dǎo)致土茯苓藥材市場(chǎng)比較混亂，難以科學(xué)地評(píng)價(jià)其真?zhèn)蝺?yōu)劣。土茯苓中主要含有落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇等成分，2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定了土茯苓中落新婦苷的含量要求。本試驗(yàn)通過建立土茯苓藥材高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜并對(duì)其中有效成分落新婦苷和白藜蘆醇含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，旨在為該藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD二極管陣列檢測(cè)器（美國Agilent公司）；KQ2200DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；5804R型低溫離心機(jī)（美國Eppendorf公司）；VORTEX-2GENIE型渦旋儀（美國Scientific公司）；DV215CD型電子分析天平（美國Ohaus公司）；LD-100型粉碎機(jī)（長(zhǎng)沙市常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠）。

1.2 試劑

落新婦苷對(duì)照品（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號(hào)：20130608，純度：98%）；白藜蘆醇對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111535-200301，純度：98%）；甲醇為色譜純，冰乙酸為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

13批土茯苓藥材分別購自醫(yī)院、零售藥店及個(gè)體診所（見表1），經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院楊小英主任藥師鑒定為真品。

表1 土茯苓藥材來源Tab 1 Source of S.rhizoma

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%乙酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；柱溫：30Ⅱ；進(jìn)樣量：20 μl。

2.1.2 溶液的制備 （1）混合對(duì)照品溶液。精密稱取落新婦苷、白藜蘆醇對(duì)照品適量，加甲醇制成落新婦苷、白藜蘆醇質(zhì)量濃度分別為532、550 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液。取樣品粉末過80目篩，稱取約1 g，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加75%甲醇10 ml，精密稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出放冷至室溫，加75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，以半徑為12.5 cm、14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

2.1.3 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)。取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以落新婦苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜2.49%，相對(duì)峰面積的RSD＜4.71%（n＝6），表明儀器精密度良好。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S1）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，以落新婦苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜2.82%，相對(duì)峰面積的RSD＜4.96%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。（3）重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一批樣品（編號(hào)：S1）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以落新婦苷峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜3.52%，相對(duì)峰面積的RSD＜5.00%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.4 指紋圖譜的建立與對(duì)照?qǐng)D譜的生成 （1）指紋圖譜的建立。取13批樣品粉末適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得特征指紋圖譜，詳見圖1。

（2）對(duì)照?qǐng)D譜的生成。采用國家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)13批樣品HPLC圖譜進(jìn)行圖譜擬合，選取時(shí)間窗寬度為0.1 min，采用中位數(shù)法，經(jīng)過多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，詳見圖2。結(jié)果表明，13批樣品HPLC圖譜整體特征相似，具有12個(gè)共有峰，其中峰8為落新婦苷，含量高、分離度好，所以選擇峰8為參照峰。

圖1 13批樣品高效液相色譜指紋圖譜Fig 1 HPLC chromatograms fingerprint of 13 batches of samples

（3）相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分析。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A版）對(duì)13批樣品HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。13批樣品HPLC圖譜12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見表3、表4。

圖2 13批樣品高效液相色譜對(duì)照?qǐng)D譜Fig 2 HPLC chromatograms control of 13 batches of samples

（4）相似度評(píng)價(jià)。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004版）對(duì)13批樣品HPLC圖譜進(jìn)行比較分析并計(jì)算各樣品HPLC圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果均＞0.90，詳見表5。

2.2 落新婦苷、白藜蘆醇的含量測(cè)定

2.2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，分別按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖3。結(jié)果，理論板數(shù)以落新婦苷、白藜蘆醇峰計(jì)均＞3 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.5、1、5、10 ml，各置于10 ml量瓶中，加流動(dòng)相（15∶ 95，V/V）定容，制成系列混合對(duì)照品溶液，精密量取各20 μl，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以落新婦苷、白藜蘆醇質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得落新婦苷、白藜蘆醇回歸方程分別為y＝29.295x+40.586（r＝0.999 9）、y＝119.190x+0.385（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，落新婦苷、白藜蘆醇檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為6.65～425.6、1.72～110 μg/ml。

表3 13批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 3 Relative retention time of the HPLC chromatograms of 13 batches of samples

表4 13批樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積Tab 4 Relative peak area of the HPLC chromatograms of 13 batches of samples

表5 13批樣品HPLC圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 5 Similarity evaluation results of the HPLC chromatograms of 13 batches of samples

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，落新婦苷、白藜蘆醇峰面積的RSD分別為2.28%、1.88%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，分別于室溫下放置0、3、6、9、12 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，落新婦苷、白藜蘆醇峰面積的RSD分別為1.72%、1.88%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（編號(hào)：S2）適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，落新婦苷、白藜蘆醇峰面積的RSD分別為2.58%、2.77%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（編號(hào)：S2）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的落新婦苷、白藜蘆醇對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表6。

2.2.7 樣品含量測(cè)定 取3批樣品各適量，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表7。

圖3 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；1.落新婦苷；2.白藜蘆醇Fig 3 HPLC chromatogramsA.mix reference substance；B.test sample；1.astilbin；2.resveratrol

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 6 Results of recovery test（n＝6）

3 討論

筆者分別考察了100%甲醇、75%甲醇、75%乙醇對(duì)提取效果的影響，結(jié)果表明，以75%甲醇提取的樣品出峰數(shù)較多，基線平整，故提取溶劑選擇75%甲醇。筆者選擇流動(dòng)相甲醇-0.2%乙酸溶液梯度洗脫時(shí)[3]，樣品出峰數(shù)最多，分離度佳，時(shí)間適中。落新婦苷在290 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，白藜蘆醇在306 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因藥材中白藜蘆醇含量較低，為使二者均有較好的靈敏度，選擇306 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)[4]。

通過對(duì)13批樣品HPLC圖譜分析，發(fā)現(xiàn)批間色譜峰數(shù)和峰面積雖然存在一定差異，但整體特征相似，具有12個(gè)共有色譜峰，相似度均＞0.90。

表7 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 7 Determination of Results of contents determination of samples（n＝3，%）

對(duì)13批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明其中落新婦苷與白藜蘆醇含量有明顯差異。2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定土茯苓中落新婦苷含量不得低于0.45%，13批樣品中7批含量符合規(guī)定，6批含量低于規(guī)定。這種差異可能與藥材的產(chǎn)地[5-6]密切相關(guān)。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜可為土茯苓藥材的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考；本測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可用于土茯苓藥材中落新婦苷和白藜蘆醇含量的同時(shí)測(cè)定。

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：18.

[2] 王永齊，王寶昌，付效雪，等.菝葜和肖菝葜屬藥材中落新婦苷藥源植物的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2014，25（15）：1 430.

[3] 溫慶偉，鄒錄惠，藍(lán)曉慶，等.土茯苓配方顆粒HPLC指紋圖譜研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（6）：99.

[4] 李磊，張宏桂，喬延江.HPLC法測(cè)定土茯苓藥材中落新婦苷和白藜蘆醇的含量[J].藥物分析雜志，2007，27（5）：654.

[5] 白梅，劉為萍，李素珍.HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地土茯苓中落新婦苷和黃杞苷含量[J].藥物分析雜志，2013，33（8）：1 352.

[6] 陳章源，李戰(zhàn)，董青松，等.廣西境內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)土茯苓中落新婦苷的含量測(cè)定[J].中國藥業(yè)，2011，20（17）：8.

（編輯：張 靜）

Study on the Quality of Commercially Available HPLC Fingerprint and Content Determination of Principal Component of Smilacis rhizoma

ZHANG Yonggui，ZHAO Li，YANG Xiaoying（General Hospital of Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC fingerprint and determine the contents of astilbin and resveratrol in Amilacis rhizoma.METHODS：HPLC was performed on the column of Zorbax SB-C18with the mobile phase of methanol-0.2%acetic acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，the detection wavelength was 306 nm，column temperature was 30Ⅱ，and injection volume was 20 μl.With reference of astilbin，the similarity analysis was conducted for the HPLC chromatograms of 13 batches of samples by using TCM Fingerprint Similarity Evaluation System（2004 A edition）.RESULTS：There were totally 12 common peaks in the HPLC chromatograms of 13 batches of samples，similarities were all higher than 0.90.The linear range was 6.65-425.6 μg/ml for astilbin（r＝0.999 9）and 1.72-110 μg/ml for resveratrol（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 3.0%；recoveries were 97.30%-102.30%（RSD＝1.97%，n＝6）and 98.12%-104.02%（RSD＝2.57%，n＝6）.CONCLUSIONS：The established fingerprint can provide reference for the identification and quality evaluation of S.rhizoma，the method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the identification of S.rhizoma simultaneous determination of astilbin and resveratrol in S.rhizoma.

Smilacis rhizoma；Astilbin；Resveratrol；Fingerprint；Content determination

R927

A

1001-0408（2016）36-5143-04

2016-08-24

2016-10-27）

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0951-5601267

#通信作者：主任藥師。研究方向：臨床藥學(xué)及臨床藥理學(xué)。電話：0951-6743031。E-mail：yxy-1970@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.33