炎性體NLRP3及其在肝損傷中的作用

100853　北京　解放軍醫(yī)學院(臧紅)；解放軍第三○二醫(yī)院(臧紅，沈宏輝，辛紹杰)

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炎性體NLRP3及其在肝損傷中的作用

臧紅沈宏輝辛紹杰

100853北京解放軍醫(yī)學院(臧紅)；解放軍第三○二醫(yī)院(臧紅，沈宏輝，辛紹杰)

炎性體(inflammasome)是新近發(fā)現(xiàn)的一類位于胞內的多蛋白復合體，參與人體的炎癥和免疫反應，和遺傳代謝病、糖尿病、動脈粥樣硬化、腸道炎癥、腫瘤以及肝病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關，炎性體相關疾病的分子機制等研究逐漸成為國際熱點[1-4]。

炎性體的核心成分為核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like receptors，NLRs)家族蛋白或PYHIN家族蛋白，主要包括NLRs家族的NLRC4、NLRP1、NLRP3、NLRP6、NLRP12和PYHIN家族的AIM2、IFI16。炎性體激活炎癥反應，調節(jié)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 (cysteiny aspartate-specific protease，Caspase-1)和白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的解離和活化，進而導致復雜的細胞反應網絡，啟動局部和全身炎癥反應[5]。NLRP3炎性體是目前研究最為充分的炎性體，與多種疾病有關。NLRP3炎性體由NOD樣受體NLRP3，接頭分子ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)及效應分子procaspase-1組成。NLRP3是這一大分子復合體中的關鍵組成部分，并激發(fā)caspase-1依賴性細胞因子IL-1β、IL-18前體細胞成熟[6]。

一、NLRP3炎性體的激活

NLRP3主要表達于樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞等免疫細胞[7]。在原代培養(yǎng)的肝細胞幾乎不表達NLRP3，體外應用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激肝細胞可引起NLRP3強表達[8]。正常情況下NLRP3與熱休克蛋白90等分子伴侶結合在一起，處于自我抑制狀態(tài)。NLRP3炎性體通過細胞內的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和危險相關分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)在炎癥和天然免疫反應過程中發(fā)揮作用，當受到PAMPs或DAMPs刺激后NLRP3募集ASC，通過ASC與procaspase-1結合組裝成炎性體。炎性體可以將無活性的procaspase-1轉化為有活性的caspase-1，活性caspase-1分子不僅可以將IL-1β前體(pro-IL-1β)和IL-18前體(pro-IL-18)轉化為有活性的IL-1β和IL-18分子發(fā)揮生物學作用，而且可以介導炎癥型細胞死亡(pyroptosis)[9]。NLRP3炎性體激活分2步：首先是位于細胞膜的Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)激活后通過核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)促進胞內NLRP3炎性體各分子轉錄和翻譯，然后在炎性體激活劑的作用下激活NLRP3炎性體[7]。

NLRP3炎性體激活的具體分子機制尚未完全明確，NLRP3炎性體可被多種刺激物激活的特點，使NLRP3成為功能最為復雜也是最為重要的炎性體，但目前我們對NLRP3的活化仍知之甚少[10]。目前認為與細胞內鉀離子外流、胞漿內cAMP減少和鈣離子濃度升高、溶酶體損傷、產生活性氧(ROS)等有關[11,12]。NLRP3炎性體能夠被多種物理和化學因子激活。其中有外源性微生物刺激物，包括LPS，脂寡糖，核酸，胞壁酰二肽(MDP)，某些穿孔毒素如肺炎球菌溶血素，刺尾魚毒素等；環(huán)境大分子無機晶體結構，如石棉、二氧化硅等；內源性信號如細胞內ATP、尿酸晶體、透明質酸和硫酸肝素、可溶性β原纖維等[7]。NLRP3炎性體也可被壞死細胞但非凋亡細胞激活，釋放IL-1β和IL-18，引起所謂的無菌性炎癥反應[13]。NLRP3炎性體激活后促進免疫細胞產生效應分子IL-1β和IL-18，IL-1β、IL-18和受體結合后觸發(fā)一系列信號通路，激活單核細胞、巨噬細胞和嗜中性粒細胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α等多種促炎細胞因子、黏附分子和趨化因子，募集炎癥細胞，在炎癥和天然免疫反應中發(fā)揮作用[14]。

上述大量不同的NLRP3活化因子，并非每一個因子都能直接與炎性體結合，所以有人提出，炎性體的激活可能存在共同的分子或通路。研究表明有三條可能的通路：第一個假設的通路是ROS，認為ROS是NLRP3炎性體激活的近端信號。ROS是古老且高度保守的危險信號，在許多經過檢測的NLRP3活化因子處理后觀察到ROS產物升高[15]。第二條通路是細胞內鉀離子濃度下降，通過內源性離子通道或細菌穿孔毒素，造成炎性體激活。根據(jù)這兩個假設，隔離NLRP3活化因子引起的ROS或阻滯NLRP3活化因子引起的K+流出，可抑制NLRP3激活，減少caspase-1的活化和IL-1β的形成[16]。第三個假設是由于吞噬微?；蚧畹牟≡瓕е氯苊阁w膜破壞，造成NLRP3活化分子進入細胞溶質，很可能是組織蛋白酶B或組織蛋白酶修飾的蛋白[17]。Shimada等[18]提出了一個將三種NLRP活化可能機制統(tǒng)一的理論：細胞內K+離子外流、溶酶體膜破壞和ROS信號共同導致氧化線粒體DNA而后激活NLRP3炎性體。

二、NLRP3炎性體的負調控

炎性體信號通路與其他信號通路之間存在密切聯(lián)系，炎性體的激活受到嚴密、精確的調控。目前宿主對炎性體負調控機制主要包括：含有PYCARD結合域的蛋白分子能夠在一定程度上競爭炎性體中心PYCARD區(qū)，從而抑制信號傳遞[19]； TRIM 30(tripartitemotif protein)通過降解TLR信號通路中的TAB2/TAB3來負性調控NF-κB的活化[20]；也有研究表明細胞內cAMP水平升高可導致NLRP3抑制[21]，微小RNA miR-223能夠特異靶向于NLRP3 mRNA的3’UTR區(qū)，從而抑制NLRP3 mRNA的表達[22]。此外I型干擾素可以調控NLRP3炎性體活性，IFN-β可誘導內源性一氧化氮(NO)，NO能夠對NLRP3分子進行硫醇亞硝基化修飾抑制其募集ASC，從而抑制NLRP3炎性體的激活[23]。下調NLRP3炎性體激活的另一機制是通過特異性免疫系統(tǒng)的作用，2009年Guarda等[24]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠CD4+效應性和記憶性T細胞能夠以細胞-細胞接觸的方式抑制NLRP1、NLRP3炎性體介導的caspase-1活化和IL-1β成熟，而受體-配體結合的方式可以取代這種細胞-細胞相接觸的抑制方式，活化的T細胞表面表達的腫瘤壞死因子家族配體如CD40配體(CD40 ligand，CD40L/CD154)與受體CD40結合時，可抑制巨噬細胞NLRP3炎性體的激活，減少IL-1β和IL-18分泌，這種抑制由P2X7R介導，但CD4+T細胞對非P2X7R介導的NLRP3炎性體的激活并未表現(xiàn)出明顯的抑制作用。單獨的CD40L也能抑制明礬等激活劑導致的巨噬細胞NLRP3炎性體激活、caspase-1活化和IL-1β分泌。總之，NLRP3炎性體的調控極其復雜。

三、NLRP3炎性體與肝損傷

越來越多的研究顯示，NLRP3炎性體與肝損傷有密切關系。正常肝組織低表達NLRP3，四氯化碳等藥物注射導致肝組織損傷后肝內嗜中性細胞、單核細胞等免疫細胞增加，NLRP3表達升高，且主要表達于庫普弗細胞等非實質細胞，肝細胞表達很弱。體外培養(yǎng)證實Kupffer細胞和肝竇內皮細胞高表達NLRP3、肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)低表達NLRP3、肝細胞基本不表達NLRP3，但是HSC和肝細胞體外受到LPS刺激后其NLRP3表達水平明顯升高，并伴隨IL-1β和TNF-α的升高[25]。急性肝衰竭發(fā)生時IL-1β、IL-18和caspase-1顯著升高[26]，慢加急性肝衰竭早期患者單核細胞被LPS刺激后IL-1β水平顯著高于健康人，而晚期患者其IL-1β水平降低[27]，IL-1受體拮抗劑治療有助于緩解小鼠肝衰竭病情[28]。

NLRP3炎性體不僅是一個危險信號傳感器，也是一個氧化應激和炎癥性疾病的調節(jié)位點[10]。D-氨基半乳糖(D-Galactosamine，GalN)和LPS常被用于研究肝臟炎癥反應及其引起的暴發(fā)性肝衰竭導致肝臟功能障礙的發(fā)生機制。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是細胞保護酶，具有抗炎和對細胞氧化應激的抗氧化作用。HO-1可通過抑制NLRP3信號通路保護肝臟對抗GalN/LPS引起的炎癥。Kim等[29]研究了GalN/LPS引起肝損傷的過程中NLRP3炎性體的激活以及HO-1在炎性體信號通路中的作用。C57BL/6小鼠在GalN/LPS處理前12 h、2 h分別先給予HO-1誘導劑氯高鐵血紅素和抑制劑鋅原卟啉(ZnPP)。氯高鐵血紅素誘導HO-1逆轉GalN/LPS引起的致死性損傷，而預先ZnPP處理能阻斷這種改變。在GalN/LPS處理組，GalN/LPS處理后脂質過氧化作用顯著增加而谷胱甘肽含量減少，血清IL-1β和TNF-α水平增加，肝臟IL-1β、TNF-α和NLRP3 mRNA增加，肝組織NLRP3、ASC 和caspase-1蛋白表達增加。氯高鐵血紅素能夠減弱NLRP3與ASC和caspase-1的相互作用，而ZnPP又能消除氯高鐵血紅素的這種作用。GalN/LPS可誘導硫氧化還原蛋白(Thioredoxin-interacting protein，TXNIP)基因的表達并增強TXNIP與NLRP3的相互作用。研究結果提示，GalN/LPS誘導的炎癥反應可能是通過TXNIP-NLRP3的相互作用引起NLRP3炎性體活化，HO-1可通過抑制NLRP3信號通路減輕GalN/LPS誘導的肝臟炎癥。

在肝臟缺血/再灌注損傷后ROS介導的NLRP3和AIM2炎性體激活而引起的炎性反應中，庫普弗細胞發(fā)揮重要作用。在產生氧化應激過程中信號激發(fā)炎性體的形成與激活。Leemans等[30]的研究顯示在肝移植或肝臟外科切除術后，肝臟非實質細胞的NLRP3表達水平升高，伴隨血漿IL-1β、IL-18水平升高，干擾NLRP3表達可以導致caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6等表達下降并顯著減輕缺血再灌注損傷引起的肝臟炎癥，抑制IL-1β、IL-18的表達同樣有助于保護肝臟缺血再灌注損傷。Kim等[31]檢測肝臟缺血/再灌注損傷中炎性體活化的分子機制以及ROS種類。發(fā)現(xiàn)肝臟缺血/再灌注損傷引起NLRP3和AIM2炎性體形成，血清釋放IL-1β水平增加，泛連接蛋白-1(Pannexin-1)抑制劑和抗組織蛋白酶B抗體可減弱缺血/再灌注損傷引起的炎性體激活和肝損傷。肝臟缺血/再灌注損傷可增加TXNIP基因的表達，增強NLRP3與TXNIP的相互作用。應用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸處理能顯著減弱肝臟缺血/再灌注損傷后IL-1β蛋白轉化；應用氯化釓耗竭庫普弗細胞可顯著減少NLRP3和AIM2炎性體表達和信號通路的活化，也能減少F4/80陽性細胞中caspase-1蛋白表達水平。提示在肝臟缺血/再灌注損傷后ROS介導的NLRP3和AIM2炎性體激活的炎性反應中，庫普弗細胞發(fā)揮重要作用。

內質網應激和非折疊蛋白反應與燒傷時增強肝臟NLRP3炎性體激活有關。大面積燒傷患者常常發(fā)生膿毒血癥，特別是銅綠假單胞菌，延長代謝紊亂，促進多器官衰竭，增加病死率。然而感染相關代謝紊亂和器官功能不全的分子和細胞機制仍不清楚。既往研究結果顯示，嚴重燒傷病人出現(xiàn)嚴重、持續(xù)的內質網應激，推測內質網應激和非折疊蛋白反應與燒傷時NLRP3炎性體激活有關，并可能激發(fā)肝臟明顯的代謝改變，形成燒傷后肝臟損傷和肝功能不全的病理基礎。研究在建立了體表燒傷面積60%和燒傷后3 d腹腔內注射銅綠假單胞菌LPS的大鼠二次打擊模型1 d后，處死動物留取肝組織標本進行基因表達檢測和NLRP3炎性體活化、內質網應激以及糖、脂質代謝分析，進行血漿ALT、AST等標志和肝臟組織化學檢測了解肝臟損傷情況。結果顯示，燒傷和注射LPS可誘導肝臟NLRP3炎性體激活，增強肝臟內質網氧化應激和肝損傷，進而加重燒傷后代謝紊亂[32]。

既往研究顯示，對甲硫氨酸-膽堿缺乏飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)小鼠應用泛Caspase抑制劑VX-166，可阻斷IL-18的成熟分泌，從而減輕脂肪變性和肝纖維化[33]。在NLRP3敲除的小鼠，長期高脂飲食引起的肝脂肪變性情況減輕，提示NLRP3炎性體參與了NASH的發(fā)病機制[34]。炎性體激活在酒精性肝炎發(fā)病機制中亦有重要意義，近期研究表明NLRP3炎性體與酒精性肝炎Mallory-Denk小體(Mallory-Denk body，MDB)形成有關。Peng等[35]應用泛素雙染色觀察酒精性肝炎患者肝臟活檢標本炎性體激活及其與MDB形成的關系，結果顯示酒精性肝炎患者存在NLRP3炎性體激活，并提示MDB可能是炎性體激活程度的一個標志。

近年國內外在炎性體的構成、調控方面的研究已取得較大進展，NLRP3炎性體的激活參與了多種肝病的發(fā)生、發(fā)展，但對該領域的研究目前仍處于早期階段，今后若能系統(tǒng)闡明炎性體激活及調控機制，則有助于尋找新的靶向藥物，供臨床診療。

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(本文編輯：馮珉)

(收稿日期：2015-08-27)

通信作者：辛紹杰，Email:xinshaojie302@163.com

基金項目：國家“十二五”科技重大專項(2012ZX10002004-005)；軍隊“十二五”重點課題(BWS11J075)