人精子的蛋白質(zhì)組學研究進展

吳艷青，饒猛，夏偉

·綜述·

人精子的蛋白質(zhì)組學研究進展

吳艷青，饒猛，夏偉△

【摘要】隨著質(zhì)譜技術(shù)不斷發(fā)展，精子蛋白質(zhì)的檢測已實現(xiàn)高通量化，蛋白質(zhì)組學也成為研究精子的重要工具之一。概述人正常精子的蛋白質(zhì)組學、精子獲能相關(guān)的蛋白質(zhì)組學及臨床上少、弱、畸形等異常精子的蛋白質(zhì)組學三個方面的研究進展。蛋白質(zhì)組學對睪丸組織特異的三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase，testis specific, GAPDHS）、外致密纖維蛋白（outer dense fiber protein，ODF）、A激酶錨定蛋白（A kinase anchoring protein，AKAP）及熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP）等蛋白結(jié)構(gòu)、功能及豐度改變的深入研究，有助于增進對精子發(fā)生、精子功能及受精機制的理解；同時篩選出部分關(guān)鍵蛋白，如人可溶性半乳糖凝集素3結(jié)合蛋白（lectin galactoside-binding，soluble 3 binding protein，LGALS3BP）、組蛋白叢1 H2ba （histone cluster1，H2ba，HIST1H2BA）、蘋果酸脫氫酶2（mitochondrial malate dehydrogenase 2，MDH2）等可能成為男性不育病因分析及研究的靶標，對探索男性不育機制、探索男性避孕新靶點有潛在的意義。

【關(guān)鍵詞】精子；蛋白質(zhì)組學；蛋白質(zhì)陣列分析；質(zhì)譜分析法

△審校者

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：42-46）

自2003年以來，蛋白質(zhì)組學技術(shù)應用于人精子的研究。在此之前，人精子細胞中僅發(fā)現(xiàn)不足100種蛋白，許多研究也都側(cè)重一個或僅幾個蛋白[1]。近十多年，蛋白質(zhì)組學技術(shù)從傳統(tǒng)的一維凝膠電泳（1DE）到二維凝膠電泳（2DE），再到現(xiàn)在的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS），蛋白質(zhì)鑒定的準確性與可信度大幅度提升。已在人正常精子細胞中發(fā)現(xiàn)了上千種蛋白質(zhì)，這個數(shù)字還在繼續(xù)增加，無限接近人精子蛋白質(zhì)總數(shù)，不斷完善人精子蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)，從蛋白質(zhì)代謝、傳導通路及差異蛋白網(wǎng)絡關(guān)系來探究精子功能、受精機制，為探索男性不育機制、男性避孕新靶點提供新的思路。綜述人正常精子的蛋白質(zhì)組學，精子獲能相關(guān)的蛋白質(zhì)組學，臨床上少、弱、畸形精子的蛋白質(zhì)組學3個方面的研究進展。

1　人正常精子的蛋白質(zhì)組學研究

最初學者們運用2DE等輔助技術(shù)進行人精子蛋白質(zhì)組學研究，發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)不到100種。最早Johnston等[2]2005年對1名健康生殖能力正常男性的精子進行研究，利用聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）及LC-MS/MS技術(shù)綜合描述人精子的蛋白質(zhì)，但未能闡明這些蛋白的本質(zhì)；隨后Martínez-Heredia等[3]在2006年運用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）結(jié)合2DE研究人精子蛋白質(zhì)，于11個正常精子樣本中鑒定出98種可信蛋白，功能涉及細胞代謝、能量供應、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成與組裝、信號傳導、凋亡等生物過程。這是第1次對人精子的蛋白質(zhì)系統(tǒng)性鑒定及功能分析。之后越來越多的學者對人正常精子內(nèi)的蛋白質(zhì)進行探索。Li等[4]用MALDI-TOF-MS鑒定出16種蛋白質(zhì)，推測部分蛋白在受精中起重要作用。de Mateo等[5]鑒定出131種蛋白，其中33種為新發(fā)現(xiàn)蛋白，這些蛋白主要在能量代謝、蛋白質(zhì)合成與加工、細胞骨架構(gòu)成與鞭毛運動、凋亡、氧化應激及精卵識別等過程中發(fā)揮重要作用；并首次對精子核內(nèi)蛋白構(gòu)成進行分析，發(fā)現(xiàn)部分蛋白表達與細胞凋亡、魚精蛋白1/魚精蛋白2（Protamine 1/Protamine 2，P1/P2）比值相關(guān)，進而證明這些蛋白與DNA完整性及染色質(zhì)中的魚精蛋白表達具有相關(guān)性，特別是抗增殖蛋白（Prohibitin，PHD），能抑制DNA合成，調(diào)節(jié)細胞增殖，從而影響生殖細胞的減數(shù)分裂。Baker等[6]首次使用LC-MS/MS以Triton X-100為蛋白分離液對8名健康男性精子中的蛋白進行研究，共提取出1 053種蛋白，蛋白功能分析揭示睪丸組織特異的三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde -3 phosphate dehydrogenase, testis specific, GAPDHS）及環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）兩種蛋白主要以參與能量代謝途徑（如糖代謝、蛋白激酶K激活等）調(diào)節(jié)精子運動，過氧化酶2（dual uxidase 2，DUOX2）可能參與精子發(fā)生過程中磷酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴的氧化應激。Wang等[7]對32名健康男性精液進行研究，鑒定并分離出4 675種精子蛋白，涉及與精子發(fā)生相關(guān)的能量代謝、信號轉(zhuǎn)導及細胞骨架構(gòu)成3大生物過程，如白細胞介素6（IL-6）信號通路中IL-2、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）及胰島素等蛋白調(diào)節(jié)一氧化氮（NO）或蛋白代謝，在頂體反應中起重要作用，部分蛋白有望成為治療男性不育及男性避孕特異的藥物靶點，如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）對生育能力極其重要，這已在小鼠體內(nèi)得到驗證，該酶的靶向抑制劑（依那普利等）有望成為新的男性避孕藥物。

由于精子形態(tài)與普通細胞不同，研究者對精子亞細胞結(jié)構(gòu)，如細胞核、頭部、尾部、細胞膜等蛋白質(zhì)組學進行了深入探索。de Mateo等[8]在2011年運用串聯(lián)質(zhì)譜方法對4名健康男性精液進行研究，第一次在精子細胞核內(nèi)鑒定并分離出403種蛋白質(zhì)，這些蛋白主要參與組蛋白、核糖體蛋白、蛋白酶體等構(gòu)成，其中睪丸特異組蛋白H2B亞單位（testis specific histone H2B，TSH2B）協(xié)助受精后染色質(zhì)中魚精蛋白向組蛋白轉(zhuǎn)變，保證胚胎正常發(fā)育；核糖體蛋白的大量發(fā)現(xiàn)證明核糖體蛋白不局限于細胞質(zhì)，也提示核糖體蛋白在受精后可能起重要作用。Amaral等[9]對4名正常男性精子尾部蛋白進行研究，發(fā)現(xiàn)1 049種蛋白質(zhì)，其中26%參與細胞內(nèi)能量代謝，11%屬于精子尾部結(jié)構(gòu)蛋白，近50%蛋白以前未檢測到；進一步研究發(fā)現(xiàn)參與能量代謝的蛋白主要是一些調(diào)節(jié)脂類代謝的酶，同時脂肪酸代謝酶抑制劑能降低精子的活力，推測脂類代謝在精子發(fā)生過程中發(fā)揮非常重要的作用。Baker等[10]比較了健康男性精子頭部和尾部蛋白，發(fā)現(xiàn)721種蛋白僅存在于頭部，主要構(gòu)成蛋白酶體及部分信號通路蛋白，如睪酮激素受體、代謝性谷氨酸受體等，主要調(diào)控精子頂體反應；精子頭部同時存在調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的酶，體內(nèi)合成的膽固醇可能作為去獲能因子參與精子的正常獲能；521種蛋白僅存在于尾部，主要參與細胞能量代謝，為精子運動提供能量。Nixon等[11]在健康男性精子的蛋白質(zhì)組學研究中鑒定出124種精子膜相關(guān)蛋白，部分膜蛋白在膜流動性基礎上重新分配調(diào)控精子頂體蛋白微變化，確保精子與卵子的正常結(jié)合。Gu等[12]研究健康男性精子質(zhì)膜蛋白鑒定出1 019種蛋白質(zhì)，對比精子與胚胎干細胞膜蛋白，發(fā)現(xiàn)兩種細胞膜蛋白種類雖有所不同，但具體功能相似，推測精細胞與胚胎干細胞的膜蛋白可能具有相同的表達模式。

據(jù)Amaral等[1]統(tǒng)計，通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)已發(fā)現(xiàn)精子的6 198種蛋白質(zhì)，在一些重要的細胞信號通路中發(fā)揮作用，推測正常人精子中包含7 500余種蛋白質(zhì)。絕大多數(shù)蛋白的功能較明確，主要參與細胞能量代謝、信號轉(zhuǎn)導及骨架蛋白構(gòu)成等生物過程，如睪丸組織特異蛋白GAPDHS、外致密纖維蛋白（outer dense fiber protein，ODF）等參與精細胞的能量代謝及鞭毛構(gòu)成保證精子正常運動與受精；組蛋白、核糖體蛋白、蛋白酶體等蛋白調(diào)控精子細胞核內(nèi)染色體組裝調(diào)控受精與胚胎發(fā)育。大量精子蛋白的發(fā)現(xiàn)及功能研究能更好地理解精子發(fā)生、分化的生理機制，也為后續(xù)的精子功能蛋白質(zhì)組學、差異蛋白質(zhì)組學研究提供重要的參考依據(jù)。

2　與獲能相關(guān)的精子蛋白質(zhì)組學研究

精子與卵子結(jié)合完成受精前，需要經(jīng)歷獲能過程。在精子獲能、精卵融合等過程中，一系列蛋白表達發(fā)生變化。Ficarro等[13]以正常精子為研究對象，運用2DE結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)比較獲能前后變化的蛋白質(zhì)，鑒定出16種獲能前后發(fā)生磷酸化修飾的蛋白質(zhì)，并用免疫熒光技術(shù)進行細胞內(nèi)定位，發(fā)現(xiàn)纈酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）在精子獲能后發(fā)生酪氨酸磷酸化，位置由精子頸部轉(zhuǎn)移到頭部，這一結(jié)果也間接證明了Nixon的膜蛋白重新分配理論[11，14-15]；A激酶錨定蛋白3（A-kinase anchoring protein 3，AKAP3）及AKAP4磷酸化修飾，為后續(xù)的精子獲能機制研究奠定基礎。Secciani等[14]在體外模擬精子獲能過程，發(fā)現(xiàn)獲能前后有58種蛋白發(fā)生變化，下調(diào)的蛋白主要參與能量代謝及鞭毛組裝過程，而上調(diào)的蛋白主要在細胞應激中發(fā)揮作用，推測獲能過程中精子運動可能被細胞凋亡程序調(diào)控而減弱，應激蛋白增加進而導致鞭毛微管蛋白等蛋白質(zhì)的降解。Lefièvre等[15]體外模擬一氧化氮（NO）對人精子的影響，發(fā)現(xiàn)240種蛋白發(fā)生S亞硝基化，如AKAP、熱休克蛋白（heat shock proteins，HSP）、雷諾受體（Ryanodine receptor，RYR）及糖酵解酶，推測這些蛋白在精子獲能過程中受NO刺激產(chǎn)生S亞硝基化修飾，調(diào)控精子運動。Vigodner等[16]鑒定出人精子在獲能前后有55種蛋白發(fā)生泛素化或類泛素化修飾，特別是HSP70、ODF3、AKAP3及AKAP4等蛋白，同時發(fā)現(xiàn)斷尾、小頭等有缺陷精子細胞內(nèi)過多的蛋白泛素化修飾，說明精子需要一定的泛素化或類泛素化修飾保證正常的獲能，但過多的修飾將導致精子結(jié)構(gòu)或功能受損。Redgrove等[17]模擬體外受精研究精卵結(jié)合的機制中發(fā)現(xiàn)22種特異表達蛋白，構(gòu)成的分子伴侶蛋白TCP1（chaperonin containing TCP -1 complex，CCT）、20S蛋白酶體等多聚體復合物，以磷酸化、泛素化等亞基修飾形式調(diào)控精子與卵子特異性識別與結(jié)合。

綜上，精子獲能、與卵子結(jié)合過程中精子蛋白主要側(cè)重于亞基修飾，如AKAP4、HSP蛋白在模擬體外精子獲能過程中發(fā)生磷酸化修飾、S亞硝基化、泛素化或類泛素化等修飾。對獲能相關(guān)的精子蛋白進行研究，可發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵蛋白，如AKAP、HSP家族蛋白，為實現(xiàn)精子獲能異常所致的男性不育等臨床疾病靶向治療以及避孕節(jié)育靶向調(diào)控提供新的思路。

3　少、弱、畸形精子的蛋白質(zhì)組學研究

Pixton等[18]首次采用差異蛋白質(zhì)組學方法比較正常與體外受精失敗的精子標本，由于技術(shù)等局限性，僅鑒定出4種差異表達蛋白。其中有2種蛋白表達上調(diào)：即分泌性肌動蛋白結(jié)合蛋白（secretory actinbinding protein，SABP）和ODF2/2。Xu等[19]通過差異蛋白質(zhì)組學方法對比精液參數(shù)正常但不能生育者的精子與參數(shù)正常且有生育力者的精子，發(fā)現(xiàn)精囊蛋白1（semenogelin 1，SEMG1）、前列腺特異抗原（prostate-specific antigen，PSA）及ODF等24種差異表達的蛋白；這些蛋白主要參與細胞信號通路傳導、增殖與分化生物過程，影響有性生殖、損傷修復、代謝過程、細胞生長等生理過程，為臨床研究某些精液參數(shù)正常但受精能力差的潛在機制奠定了基礎。

差異蛋白質(zhì)組學在弱精子癥的研究中也具有特有的優(yōu)勢。Zhao等[20]在研究弱精子癥不育機制時，發(fā)現(xiàn)異檸檬酸脫氫酶α亞單位（isocitrate dehydrogenase subunit α，IDH-α）、ODF等10余種表達差異的蛋白質(zhì)，這些蛋白主要參與能量代謝及鞭毛微管構(gòu)成，進而影響精子的運動，有望成為弱精子癥男性不育的篩選指標。Siva等[21]發(fā)現(xiàn)弱精子癥的磷酸丙糖異構(gòu)酶、甘油激酶及HSP等8種差異蛋白，HSP主要參與精子的運動、能量代謝、蛋白加工及氧化應激等生物過程，該結(jié)果與Zhao等[20]和Martínez-Heredia等[22]的研究結(jié)果部分吻合。Parte等[23]鑒定出弱精子癥的66種差異蛋白，變化最顯著的蛋白質(zhì)主要參與細胞骨架組成、能量代謝及纖維鞘構(gòu)成，其中AKAP3、AKAP4、HSP70-2、GAPDHS等蛋白的表達水平和磷酸化修飾水平均發(fā)生變化，涉及的PKA信號通路、Rho依賴的信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （PI3K/AKT）信號通路及cAMP信號通路也發(fā)生顯著改變。有研究提出，AKAP、HSP、GAPDHS等關(guān)鍵蛋白的表達水平和磷酸化水平的變化導致精子運動異常，臨床表現(xiàn)為弱精子癥[10,13,23-25]。

Liao等[26]利用差異蛋白質(zhì)組學方法比較人圓頭精子癥與正常精子的蛋白質(zhì)表達譜，發(fā)現(xiàn)精子頂體膜蛋白（sperm acrosome membrane-associated protein 1 precursor，SAMP1）、X染色體上基因編碼的精子蛋白a/d亞基（permatozoa protein associated with the nucleus on the X chromosome，SPANXa/d）及ODF等35種有表達差異的蛋白質(zhì)，并預測其可能涉及精子發(fā)生、細胞結(jié)構(gòu)、代謝和精子運動等過程。推測SAMP1、SPANXa/d及ODF等關(guān)鍵蛋白的表達差異影響精子發(fā)生過程的自我修復，造成頂體結(jié)構(gòu)改變進而導致精子的形態(tài)與運動異常。Hosseinifar等[27]對比精索靜脈曲張的成年男性患者精液與正常男子的精液，發(fā)現(xiàn)表達差異的蛋白質(zhì)主要是前列腺酸性磷酸酶（prostatic acid phosphatase，ACPP）、HSP A5、帕金森蛋白7（Parkinson protein 7，PAPK7）等線粒體蛋白或細胞骨架蛋白，推測這些蛋白影響精子的成熟與凋亡造成精索靜脈曲張患者精子功能的異常。Freour等[28]研究非梗阻性無精子癥患者，在精漿中篩選出差異蛋白人可溶性半乳糖凝集素3結(jié)合蛋白（lectin galactoside-binding，soluble 3 binding protein，LGALS3BP），該蛋白在睪丸穿刺成功獲取精子的患者精漿中顯著高表達，提示LGALS3BP可作為鑒別非梗阻性無精子癥患者能否行睪丸穿刺獲取精子的一種潛在的臨床標記物。氧化應激反應在精子發(fā)生中扮演者十分重要的角色。精液中的氧化能力與抗氧化能力的平衡對于維持正常的精子功能非常重要。Sharma等[29]在研究精子氧化應激損傷中篩選出組蛋白叢1 H2ba（histone cluster1，H2ba，HIST1H2BA）、蘋果酸脫氫酶2（mitochondrial malate dehydrogenase 2，MDH2）、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶4（transglutaminase 4，TGM4）等蛋白，均具有潛在的臨床應用和研究價值。

差異蛋白質(zhì)組學在輔助生殖技術(shù)治療不育癥的研究中也有應用。Azpiazu等[30]對體外受精受孕成功與失敗的兩組精子標本進行蛋白質(zhì)組學研究，鑒定出1 717種蛋白，其中有137種蛋白是新發(fā)現(xiàn)蛋白，66種差異表達蛋白主要在染色體組裝及脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用。推斷這些差異蛋白的細微變化雖不足以影響精子功能，但可能造成成功受精后胚胎發(fā)育的異常，導致輔助生殖結(jié)局不同。Frapsauce等[31]及McReynolds等[32]研究精液參數(shù)正常但輔助生殖結(jié)局不同的精子標本，發(fā)現(xiàn)表達有明顯差異的蛋白主要參與能量代謝及細胞的氧化應激反應過程，并推測HSP家族蛋白及相關(guān)蛋白在其中發(fā)揮重要作用。

以上研究可發(fā)現(xiàn)，參與精子發(fā)生過程的蛋白質(zhì)，如參與氧化應激過程的HSP家族、能量代謝的AKAP家族、核染色體構(gòu)成的組蛋白家族及魚精蛋白，其種類、表達水平、結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生改變，都將影響精子正常功能或受精后胚胎的發(fā)育，導致精液異常、精子功能異常、男性不育，也可能影響輔助生殖治療的結(jié)局。深入研究一些關(guān)鍵蛋白在精子發(fā)生過程中參與的能量代謝、信號傳導通路及細胞骨架構(gòu)成等生物過程，有助于發(fā)現(xiàn)潛在的男性不育癥診斷與治療新的靶標。

4　結(jié)語和展望

精子蛋白質(zhì)組學研究有助于發(fā)現(xiàn)精子蛋白構(gòu)成、理解精子正常生理功能及異常精子的病理機制。據(jù)推測已有80%以上的精子蛋白質(zhì)在精子蛋白質(zhì)組學研究中被發(fā)現(xiàn)，其中部分關(guān)鍵蛋白表達上調(diào)、下調(diào)或轉(zhuǎn)錄后修飾加工等精確調(diào)控精子發(fā)生過程中能量代謝、信號傳導和氧化應激損傷修復等生物過程，確保精子的正常運動、獲能、受精及胚胎的發(fā)育；并在眾多差異蛋白中篩選出有意義的蛋白作為臨床生物標記物或疾病治療的藥物靶點，這將為臨床疾病的診斷和治療建立良好的平臺。由于精子功能分析需要特殊環(huán)境，這使當前對精子功能蛋白質(zhì)組學研究有一定的困難，雖然可以模擬體外獲能、體外受精，使得精子在行為上與正常生理行為表現(xiàn)一致，但具體蛋白表達的真實性仍待進一步驗證。精子的獲能及受精是男性生殖的研究重點，所以在精子功能方面的蛋白質(zhì)組學研究應該繼續(xù)加大力度；另外，蛋白質(zhì)的表達具有時間及空間特異性，蛋白質(zhì)組成復雜、性質(zhì)不穩(wěn)定，蛋白豐度高低及研究標本的個體差異都給蛋白質(zhì)檢測帶來一定的困難，而且由于蛋白質(zhì)的鑒定是與相應的肽段片段對應，常常會忽略蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后磷酸化、糖基化等修飾過程，所以在研究方法上還需有所突破。相信隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)及方法的不斷創(chuàng)新與發(fā)展，生物信息學工具的完善，蛋白質(zhì)組學研究數(shù)據(jù)的不斷積累，精子的蛋白質(zhì)組學研究將成為揭示男性不育機制及提供男性不育的診斷及治療新方法的有力保證。

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[本文編輯王昕]

Research Progress on Proteomics of Human Sperm

WU Yan-qing，RAO Meng，XIA Wei.
Family Planning

Research Institute，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China Corresponding author：XIA Wei，E-mail：Tjxiawei@126.com

【Abstract】With the development of mass spectrometry, the detection of human sperm proteins has been realized high throughput, and the proteomics has become an important tool to study sperm. We reviewed the advances in the proteomics of normal human sperm, the proteomics of sperm capacitation, and the proteomics of oligo-, astheno-, and terato spermia. The proteomic study on the structure, function and abundance change of many proteins, such as glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase, testis specific (GAPDHS), outer dense fiber protein (ODF), the A kinase anchoring protein (AKAP) and heat shock proteins (HSP), will be helpful for understanding spermatogenesis, sperm function and fertilization mechanism. And some of the key proteins selected, such as lectin galactoside-binding, soluble 3 binding protein (LGALS3BP), histone cluster1, H2ba (HIST1H2BA) and mitochondrial malate dehydrogenase 2 (MDH2), can be developed as possible clinical targets for the diagnosis of male infertility. These proteins also have potential significance for exploring the mechanism of male infertility and male new contraceptive.

【Keywords】Spermatozoa；Proteomics；Protein array analysis；Mass spectrometry

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃（2012BAI31B00）；國家自然科學基金（31171380）；華中科技大學自主創(chuàng)新研究基金（2015TS108）

作者單位：430030武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院計劃生育研究所

通信作者：夏偉，E-mail：Tjxiawei@126.com

收稿日期：（2015-09-06）