大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中污染的類型及控制策略探討

安芳蘭，張 榮，武發(fā)菊，董文教，楊惠清，劉學榮，萬玉林，楊進才，殷 宏

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046）

大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中污染的類型及控制策略探討

安芳蘭1，張 榮1，武發(fā)菊1，董文教1，楊惠清1，劉學榮1，萬玉林1，楊進才1，殷 宏2*

（1.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅 蘭州 730046）

細胞污染是動物細胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的主要問題。本文從細胞培養(yǎng)過程中污染產(chǎn)生的來源、種類及控制策略等方面對規(guī)模化培養(yǎng)過程中常見的污染類型及防控手段進行綜述，為提高細胞培養(yǎng)水平、防治細胞培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的污染狀況及研究新的去除污染的手段提供新的思路，為有效減少和控制污染、降低損失，提高生物制品的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

細胞培養(yǎng)；細胞污染；污染控制

污染是動物規(guī)?；毎囵B(yǎng)過程中長期面臨的問題，培養(yǎng)環(huán)境中諸多因素都可能造成污染而影響生物制品的產(chǎn)量，例如物理、化學及生物因素等。自1962年Capskti等首創(chuàng)了有關(guān)倉鼠腎細胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)之后，動物細胞培養(yǎng)規(guī)模開始擴大，廣泛應(yīng)用于口蹄疫等病毒疫苗的生產(chǎn)，為疫苗、干擾素和單克隆抗體等生物制品的生產(chǎn)提供了有效的技術(shù)途徑。大規(guī)模細胞培養(yǎng)是一個無菌操作過程，對培養(yǎng)條件要求比較苛刻。目前，國內(nèi)外大多數(shù)生物制品企業(yè)為了避免微生物及其他有害因素的影響而建有標準化的無菌環(huán)境，以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的要求，但是，污染問題還是不能得到及時解決，給研究及操作人員帶來極大的困擾。因此，了解規(guī)?；毎囵B(yǎng)過程中污染的來源、種類及其危害性，建立規(guī)范的操作方法及規(guī)章制度，可有效防止污染，盡可能地保證規(guī)模化生產(chǎn)體系的穩(wěn)定性和可靠性。

1 污染的來源

1.1 外源性污染

1.1.1 原輔材料 水是生物制品原料的主要溶劑，一切營養(yǎng)物質(zhì)只有溶于水才易被細胞吸收，代謝產(chǎn)物也需溶于水才能排泄，所有的生化反應(yīng)必須在溶液狀態(tài)下才能很好的作用。細胞培養(yǎng)過程中水是不可缺少的原材料，因此也就成了細胞培養(yǎng)中的污染源之一。培養(yǎng)用水中如果含有一些雜質(zhì)，即使含量極微，有時也會影響細胞的存活和生長，甚至導致細胞死亡。配制培養(yǎng)液應(yīng)使用經(jīng)石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈化裝置制備的超純水，存放時間一般不應(yīng)超過2周，依據(jù)國家藥典，其pH范圍應(yīng)為5～7，電導率＜10 us/cm。

培養(yǎng)液是細胞賴以生存的體外環(huán)境，也為細胞生長提供主要的營養(yǎng)物質(zhì)。如果配制培養(yǎng)液的化學試劑及添加物不純，配液罐、閥門、管道及濾器等驗證不合格或滅菌不徹底都會造成培養(yǎng)液的污染。

動物血清作為原輔材料是細胞培養(yǎng)中常用的一種重要的天然培養(yǎng)基，同時存在潛在的生物及化學污染來源。由于血清都是批量生產(chǎn)，各批量之間差異很大，不同廠商的生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)質(zhì)量也各不相同，使得血清中許多蛋白及生長因子的濃度也存在很大的差異，取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產(chǎn)生潛在影響。因此，不同的處理方式和工藝等都是影響血清質(zhì)量的關(guān)鍵因素。

在大規(guī)模細胞培養(yǎng)的過程中所用到的培養(yǎng)器皿及容器多種多樣，如各種玻璃制品和不銹鋼生物反應(yīng)器等。培養(yǎng)器皿及容器在清洗過程中殘留的變性劑或洗衣粉等是最常見的化學性污染來源。

1.1.2 操作環(huán)境 大規(guī)模細胞培養(yǎng)一般在潔凈度為萬級以上的潔凈室或者是超凈工作臺內(nèi)操作。生產(chǎn)中萬級以上潔凈室內(nèi)部氣流一般為亂流，內(nèi)含局部百級潔凈度的層流罩。層流罩的氣流為雙向垂直流，常規(guī)操作均在層流罩下進行。超凈工作臺作為級別較高的操作環(huán)境，能較好地保持臺面無菌及環(huán)境的安全性，但其使用過久易造成塵埃堵塞，例如過濾網(wǎng)罩若未定期更換或長久不更換，污染空氣易進入操作區(qū)等，都會造成培養(yǎng)室內(nèi)空氣污染。

1.1.3 操作人員 人員是生物制品生產(chǎn)操作中最不確定的因素，每天都會攜帶大量的灰塵，而細菌和病毒則附著在灰塵中，如果不按標準操作規(guī)程進行，例如進出無菌室沒有必要的滅菌措施、操作前不檢查設(shè)備和環(huán)境是否達標等，則會使無菌區(qū)域的環(huán)境平衡遭到破壞，從而導致細胞培養(yǎng)過程中的污染。細胞培養(yǎng)過程中試驗人員是否操作規(guī)范，是否嚴格遵守無菌工作流程，是細胞污染的一個主要因素。

1.2 內(nèi)源性污染

內(nèi)源性污染雖然不似外源性污染廣泛，但內(nèi)源性污染的檢測和清除更為困難。主要表現(xiàn)為細胞株建庫時存在的潛在污染，如制備細胞的組織或器官本身攜帶有病毒或支原體等。

2 污染的種類

2.1 細菌污染

細菌類的污染最為常見和廣泛，大多屬于外源性的污染。一般比較容易檢測和鑒定，通常通過肉眼觀察或光鏡下檢查就可做出初步鑒定，最后采用細菌培養(yǎng)和染色等方法做出進一步鑒定。常見的細菌污染有革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌等）和革蘭氏陽性菌（如葡萄球菌等）[1]，細菌污染細胞后，多數(shù)情況下細胞培養(yǎng)液短時間內(nèi)變黃，出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，pH值降低，倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在，細胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。

2.2 真菌污染

真菌類的污染也是常見的污染類型，大多也屬于外源性的污染，比較容易檢測和鑒定。最常見的真菌有曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。真菌污染細胞后多在培養(yǎng)液中形成黃色或白色漂浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液不變渾濁，4 d左右才可在顯微鏡下觀察到絲狀或者是鏈狀的菌絲，周期較長。

2.3 支原體污染

支原體是一類無細胞壁、大小介于細菌和病毒之間（直徑在0.13～0.18 μm）并獨立生活的微生物，可穿過0.22 μm的孔徑濾膜[2]。支原體分布廣泛，主要存在于污水、土壤、植物、動物和人體中，以腐生、共生或寄生的方式在規(guī)?；毎囵B(yǎng)和生物制品生產(chǎn)過程中造成污染。

支原體污染多屬于外源性污染，也有內(nèi)源性的，感染力高且不易被檢測，在大規(guī)模細胞培養(yǎng)中極為常見。支原體污染細胞后，生長緩慢，早期很難發(fā)現(xiàn)，顯微鏡下?？梢姷郊毎思鞍麧{內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆粒或空泡，短期內(nèi)培養(yǎng)液不變渾濁。支原體污染對細胞的生長繁殖、形態(tài)、細胞代謝、遺傳學以及細胞對病毒的敏感性都將產(chǎn)生不同程度的影響，是大規(guī)模細胞培養(yǎng)工作中亟待解決的重要問題之一。其種類不同，對細胞的影響也不同，一般支原體的污染可使細胞生長速度減慢或完全終止，最終細胞發(fā)生病變，但有些經(jīng)支原體污染的細胞在經(jīng)過多次連續(xù)傳代或長期培養(yǎng)后，仍然表現(xiàn)出基本正常的生長，這樣給檢測和清除工作帶來了很多困難。

2.4 病毒污染

大規(guī)模細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)的病毒污染一般來自動物血清或者是管理不嚴的動物細胞庫，多為外源性污染，也有內(nèi)源性的（如建立細胞株時產(chǎn)生的污染）。外源性的污染大部分主要來源于牛腹瀉病毒(BVDV)中的非細胞病變株，預(yù)計有70%以上的胎牛血清中均存在這種病毒。大部分外源和內(nèi)源的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞后，被感染細胞不會產(chǎn)生形態(tài)和細胞病理現(xiàn)象，可用血細胞吸附試驗、免疫熒光抗體及電子顯微鏡等方法有效地檢測上述病毒。

2.5 交叉污染

交叉污染一般來自細胞建株和細胞傳代過程中兩種或兩種以上細胞之間的混合污染。在細胞培養(yǎng)的過程中，細胞種類不同，其理化特性、培養(yǎng)操作模式也不盡相同，若在同一無菌環(huán)境區(qū)域操作，所用試驗材料極易導致不同種細胞間交叉污染，使細胞形態(tài)和生物學活性發(fā)生改變，從而導致細胞特性的改變。

3 污染的控制

3.1 外源性污染

3.1.1 原輔材料污染的控制 大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中要特別注意防止培養(yǎng)液的污染，要做到這一點采取標準的操作步驟是前提，配制好的培養(yǎng)液采用過濾除菌法進行除菌，確保所用的濾器、儲存培養(yǎng)液的容器以及操作過程等均嚴格無菌。此外，為了避免培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分或添加的各種試劑等引起的化學性污染，培養(yǎng)過程中所使用的所有化學物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并且要經(jīng)過權(quán)威機構(gòu)的鑒定，操作人員最好對上述成分做進一步的純度鑒定。

動物血清為細胞生長提供必需的生長因子，同時又是大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中潛在的生物及化學污染的來源[3]。培養(yǎng)細胞所用的血清必須儲存于-20℃或者是-70℃的環(huán)境。為了保證試驗及生產(chǎn)工藝的重復(fù)性，最好選用同一批次的血清，并且在添加血清之前一定要對血清進行過濾和輻照等處理，以便除去血清自身攜帶的內(nèi)源性微生物。因此，研究和開發(fā)無血清培養(yǎng)基已成為各生物制品公司研究的趨勢。

大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中會使用到各種不同類型及規(guī)模的培養(yǎng)器材，其規(guī)模和構(gòu)形設(shè)計會影響細胞培養(yǎng)中氣體的交換、濕度、培養(yǎng)液的pH值甚至細胞生長密度[4]。培養(yǎng)細胞所用的器材首先需經(jīng)過注射用水清洗，再經(jīng)嚴密的包裝和滅菌，最好采用內(nèi)外兩層包裝，滅菌要徹底，一般采用干烤或蒸汽滅菌：如高溫干烤滅菌時要注意溫度的設(shè)定和維持的時間；高壓蒸汽滅菌時應(yīng)注意壓力、溫度和時間，壓力應(yīng)保持在0.103 MPa以上，溫度121℃，時間大于30 min，并且已滅菌的培養(yǎng)器材要嚴格控制使用期限，在妥善保管的條件下，天氣干燥的春秋季節(jié)可使用1周，炎熱潮濕的夏季可使用2～3 d。

培養(yǎng)器材的特性及滅菌過程的差異也會對培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響，塑料制品在生產(chǎn)過程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。因此，根據(jù)生產(chǎn)工藝，儲存不同物質(zhì)時應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器，因為酒精、強酸、強堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分[5]。此外，各生物反應(yīng)器、管道連接及工藝等進入生產(chǎn)線前均需做無菌驗證。

3.1.2 操作環(huán)境污染的控制 規(guī)模化細胞培養(yǎng)無菌室具有嚴格的要求，才能保證操作過程的無菌：首先須有防止微生物污染和有害因素影響的措施；其次要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵，不受日光直射，大小適當，高度適宜；再次要求相對封閉，設(shè)有緩沖間，對無菌室每天用一定比例的消毒液進行定期清掃和拖洗；最后室內(nèi)不易放置太多與細胞培養(yǎng)無關(guān)的雜物，要時刻保持室內(nèi)干燥，有利于降低因環(huán)境因素引起的細胞污染概率。

紫外消毒是避免細胞培養(yǎng)過程中因環(huán)境引起細胞污染的主要措施[6]，超凈工作臺應(yīng)放置在無菌室內(nèi)，每次使用前先開啟紫外燈滅菌30 min，同時啟動風機凈化30min后再進行細胞培養(yǎng)等一系列操作。操作結(jié)束后用75%酒精棉將臺面擦拭干凈，再用紫外燈照射30 min殺菌。超凈工作臺在長期使用過程中可能會因灰塵積結(jié)過多而阻塞空氣過濾器，因此使用過程中應(yīng)時刻觀察臺內(nèi)氣流，若氣流變?nèi)酰凭珶艋鹧鎺缀醪粍訒r，應(yīng)及時檢測風速、清洗或更換濾板。

3.1.3 操作人員污染的控制 操作人員在進入無菌室前，須用肥皂洗手，按規(guī)定穿隔離衣，在緩沖間換穿專用服裝和拖鞋，進出無菌間門口需用消毒劑洗手，操作開始首先采用75%酒精棉球擦拭手雙手及瓶口。操作時動作保持輕柔，盡量不談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。經(jīng)常更換吸管，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸手或其他物品外壁時均應(yīng)及時棄去更換一支。嚴禁在試驗進行過程中頻繁出入無菌室，試驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦拭臺面，將試驗產(chǎn)生的固體垃圾和廢液等分類歸置后及時清理出無菌室，在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分開。操作人員的無菌意識是生產(chǎn)操作中的重中之重，一名有良好無菌意識的操作人員對大規(guī)模培養(yǎng)細胞的穩(wěn)定性有著重要意義。

3.1.4 交叉污染的控制 細胞培養(yǎng)時，在同一個無菌室或超凈臺里最好不要同時操作兩個或兩個以上細胞株。細胞間的交叉污染可使細胞形態(tài)和生物學活性發(fā)生改變，能否控制細胞間的交叉污染對細胞產(chǎn)能起著決定性作用[7]。所以，應(yīng)盡可能減少無菌室或超凈工作臺內(nèi)放置的物品，而且培養(yǎng)試劑一定要分門別類，如同一個無菌室不同操作者所使用的，如胰酶、培養(yǎng)液等，避免因為一個操作者的失誤致使無菌間內(nèi)所有細胞發(fā)生污染。

3.1.5 內(nèi)源性污染 為了減少內(nèi)源性污染對規(guī)?；毎囵B(yǎng)的影響，必須建立細胞種子庫。細胞種子庫分為主細胞庫（Master cell bank，MC）和工作細胞庫（Working cellbank，WC）。細胞庫保存的二倍體細胞要經(jīng)過細菌、霉菌、病毒、支原體、胞核學、細胞鑒定、致瘤致癌性及病毒培養(yǎng)適應(yīng)性等一系列的檢測和鑒定，確保細胞庫的細胞的純凈性，從而作為理想的細胞來源[8]。原代細胞可以采取次代培養(yǎng)的方式避免污染的發(fā)生，例如當需要大量培養(yǎng)細胞時才可從主細胞庫中復(fù)蘇細胞來建立工作細胞庫，若試驗或生產(chǎn)需要細胞時只要從工作細胞庫復(fù)蘇細胞即可，傳代次數(shù)不能超過最高限制代次。為了保證培養(yǎng)細胞系的完整性，細胞凍存時必須進行其信息的登記，如每一個凍存標本都應(yīng)明確記錄細胞的種類、來源、代數(shù)、倍增時間、凍存日期以及有無細胞污染，有利于對細胞的遺傳及生理特性在常規(guī)傳代培養(yǎng)中因突變、污染及各種原因?qū)е碌母淖冞M行分析。對于外來的細胞系的選擇，應(yīng)保證其來源、品種明確、遺傳性穩(wěn)定、生產(chǎn)性能較佳[9]。

4 總結(jié)和展望

在規(guī)?；毎囵B(yǎng)中，造成細胞污染的原因各異，控制細胞污染舉措的多樣。本文較系統(tǒng)地闡述了規(guī)?；a(chǎn)中細胞培養(yǎng)污染的來源、種類以及防治各種污染的舉措三個方面，列舉了生產(chǎn)中經(jīng)常遇到的情況。實踐表明在生產(chǎn)過程中只要嚴格按照獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP）操作，注意每一個操作環(huán)節(jié)，加強無菌意識的防范，就能有效地減少和控制污染、降低損失，提高生物制品的質(zhì)量，為順利生產(chǎn)及試驗奠定基礎(chǔ)。

[1]Ryan J.Understanding and managing cell culture contamination[J].New York:Corning Inc,1994：180-195.

[2]鄭向陽,高永忠.細胞傳代培養(yǎng)中支原體污染的來源及預(yù)防[J].畜牧與飼料科學,2009,30(1):49.

[3]翟中和.細胞生物學[M].北京:高等教育出版社,2004.

[4]Wei-Shou Hu,John G Aunins.Large-scale mammalian cell culture[J].Current Opinion in Biotechnology,1997,8（2）：148-153.

[5]王明俊.獸醫(yī)生物制品學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社:131-135.

[6]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.獸藥生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2002.

[7]Uphoff C C,Drexler H G.Elimination of mycoplasmas from infected cell lines using antibiotics[M].Cancer cell culture:methods and protocols,2011:105-114.

[8]Degeling M H,Maguire C A,Bovenberg M S S,et al.Sensitive assay for mycoplasma detection in mammalian cell culture[J].Analytical chemistry,2012,84(9):4227-4232.

[9]王秀卿,勾凌燕,王志玲,等.細胞體外培養(yǎng)工作中存在的問題及預(yù)防［J］.臨床合理用藥雜志,2010,3(8):80．

（編輯：高真貞）

Q813.1+1

A

1006-799X(2016)19-0027-04

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費（201303046-05）

安芳蘭（1979-），女，甘肅秦安人，助理研究員，主要從事疫苗生產(chǎn)管理及工藝研發(fā)。

殷 宏（1966-），男，甘肅隴西人，研究員，主要從事對黃牛、牦牛、綿羊和山羊等反芻動物危害嚴重的外寄生

蟲及其傳播疫病的病原特性、流行病學、診斷及防治等方面的研究。