MicroRNA研究概述

彭可可，歐陽伶宣，鄧朝謙，蔣　元，徐素萍，李曉寧，韋顯凱，羅廷榮*

(1．廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2．亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004)

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MicroRNA研究概述

彭可可1,2，歐陽伶宣1,2，鄧朝謙1,2，蔣元1,2，徐素萍1,2，李曉寧1,2，韋顯凱1，羅廷榮1,2*

(1．廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2．亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004)

摘要:MicroRNA(miRNA)是一類真核生物內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA，長約21 nt～23 nt。越來越多的miRNA在動物細胞和植物組織中發(fā)現(xiàn)，這些成熟的小分子RNA是從具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA(pre-miRNA)剪切出來，通過與靶mRNA分子互補結(jié)合而抑制蛋白翻譯或?qū)е耺RNA降解，從而調(diào)控靶基因的表達。miRNA是一類重要的基因調(diào)控子，在機體的基因表達調(diào)控、細胞分化和凋亡以及抗病毒防御中發(fā)揮重要的作用。深入理解miRNA介導(dǎo)的宿主與病毒之間的相互調(diào)節(jié)作用，對于闡明病毒的致病機理與制定治療策略具有深遠的意義。

關(guān)鍵詞:：miRNA；基因調(diào)控；抗病毒

MicroRNA(miRNA)是一類非編碼的小分子單鏈RNA，長約21 nt～23 nt，廣泛存在于動植物細胞中，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達，并且參與細胞分化、增殖、凋亡和病毒感染等生物學(xué)進程的調(diào)節(jié)。到目前為止，已有數(shù)以千計的miRNA在果蠅、線蟲、小鼠和人等多種生物物種中發(fā)現(xiàn)，研究推測人類30%編碼蛋白的基因也受到這些小的非編碼RNA的調(diào)控[1]。這些miRNA首先在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)內(nèi)，然后在RNA內(nèi)切酶Dicer和Drosha的切割作用下最終形成成熟的miRNA分子。它們通過與靶標(biāo)基因相結(jié)合后降解其mRNA或抑制其mRNA的翻譯來調(diào)控基因的表達。miRNA能夠微調(diào)蛋白質(zhì)的合成，其調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)大量基因的功能顯示了許多生物學(xué)特性，因而深入研究miRNA的調(diào)控模式也將有助于我們了解生物體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1miRNA的發(fā)現(xiàn)

最早的microRNA家族成員是1933年Lee RC等[2]從秀麗隱桿線蟲中通過胚胎發(fā)育時間控制缺陷性遺傳試驗發(fā)現(xiàn)的lin-4，他發(fā)現(xiàn)兩條大小為22 nt和61 nt的lin-4的轉(zhuǎn)錄物，不編碼蛋白，這些lin-4 RNAs含有l(wèi)in-14 mRNA 3′非編碼區(qū)重復(fù)序列的互補序列，以反義RNA-RNA的相互作用來降解其靶mRNA lin-14的表達，導(dǎo)致lin-14蛋白質(zhì)合成的減少，從而調(diào)控線蟲的發(fā)育。2000年，在秀麗隱桿線蟲中鑒定出第2個調(diào)控時序性發(fā)育的miRNA分子let-7，由于let-7家族成員的序列和功能在物種間高度保守，這也是其成為第1個在人類中發(fā)現(xiàn)的miRNA。盡管let-7與其靶基因lin-41mRNA的3′非編碼區(qū)序列只有部分互補，但最終導(dǎo)致lin-41 mRNA降解[3]。自證明lin-4和let-7能參與線蟲時序發(fā)育以來, miRNA已經(jīng)逐漸成為調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定和mRNA翻譯的研究熱點。

2miRNA的生物合成

國內(nèi)外對miRNA的生物合成已經(jīng)有了一定的研究。在哺乳動物細胞核內(nèi)，RNA聚合酶Ⅱ(RNA-Pol Ⅱ)將基因組轉(zhuǎn)錄生成miRNA基因的初級轉(zhuǎn)錄物(primary-miRNA, pri-miRNA)，長度有數(shù)百個核苷酸，再經(jīng)核酸酶Drosha加工成70 nt～90 nt具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單個miRNA的前體 (precursor-miRNA, pre-miRNA)，Drosha酶在pre-miRNA的3′端產(chǎn)生一個2 nt突起，通過突起的識別，pre-miRNA由轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5轉(zhuǎn)出細胞核，運送到細胞質(zhì)，進一步由細胞漿中的核酸酶Dicer加工成成熟的miRNA，大小為21 nt～23 nt[4]。成熟的miRNA與其互補序列互相結(jié)合成miRNA-miRNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，之后，雙螺旋解旋，其中一條成熟的miRNA裝配進核糖核蛋白(ribonucleo protein，RNP)生成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物( RNA-induced silencing complex，RISC)，通過與其靶基因堿基互補的方式對靶基因表達發(fā)揮調(diào)控功能，另一條miRNA發(fā)生降解[5]。

3miRNA的作用機制

miRNA存在于基因組基因間隔區(qū)或內(nèi)含子中，這些小分子RNA通過與靶mRNA 3′非編碼區(qū)以完全或不完全互補的方式結(jié)合，指導(dǎo)靶mRNA在特異性位點斷裂，減少靶mRNA的轉(zhuǎn)錄水平或翻譯抑制，從而調(diào)控靶基因的表達。miRNA與靶基因調(diào)控作用取決于miRNA與靶基因互補配對的兩種方式：完全互補和不完全互補。若miRNA與靶基因完全互補配對，則起到降解mRNA的功能；若miRNA與靶基因不完全互補配對，則起到抑制mRNA翻譯的功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)，植物的miRNA多以第1種方式造成mRNA降解；動物的miRNA多以第2種方式抑制mRNA的翻譯。有研究發(fā)現(xiàn)，單一家族的miRNA可以直接或間接地調(diào)節(jié)人類14%基因的表達，每個miRNA可以調(diào)控許多靶標(biāo)位點的mRNA，而每個mRNA又會受到多種miRNA的調(diào)節(jié)，在不同的細胞狀態(tài)和不同的病理條件下，同一miRNA也可能有不同的調(diào)節(jié)作用[7]。miRNA表達的主要特點是細胞特異性或者組織特異性，其在不同的物種間具有高度的保守性、時序性和組織特異性，如miR-122在肝臟中高表達，而miR-124在腦組織中特異性高表達。

4miRNA的生物學(xué)功能

miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)mRNA表達，是一類重要的基因調(diào)控子，miRNA的調(diào)節(jié)功能主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)細胞周期、干細胞自我更新過程、細胞分化及生長發(fā)育等方面，它在動物的基因表達調(diào)控、細胞分化及抗病毒防御中發(fā)揮著重要作用。盡管miRNA和病毒引起的疾病之間的聯(lián)系還沒有完全建立，但是最新的研究表明，miRNA與疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有聯(lián)系。miRNA由于結(jié)構(gòu)的多樣性與進化保守性決定了生理生化功能上的重要性與普遍性，其揭示了非編碼區(qū)提供給機體的一種新的、重要的調(diào)節(jié)機制，為新型基因治療方案的設(shè)計、抗病毒疫苗的制備及基因功能分析等方面提供了潛在的應(yīng)用價值[8]。

5miRNA介導(dǎo)宿主與病毒的相互作用關(guān)系

病毒感染使得宿主細胞內(nèi)的微環(huán)境發(fā)生巨大變化，會導(dǎo)致宿主細胞基因表達的急劇變化，所以病毒的感染也將改變宿主細胞miRNA的表達模式。并且隨著miRNA的深入研究，對宿主和病毒各自編碼的miRNA調(diào)節(jié)宿主和病毒之間的關(guān)系上也有了更深一步的認識。其之間的關(guān)系包括宿主miRNA的抗病毒感染功能、病毒對宿主的干擾作用、病毒miRNA對自身基因和宿主基因的調(diào)節(jié)作用等。

5.1宿主miRNA對病毒的作用

宿主編碼的某些miRNA能以病毒的mRNA為靶標(biāo)，增強或沉默細胞內(nèi)病毒的mRNA，從而調(diào)節(jié)病毒基因表達，影響病毒的生活周期和致病性[9]。Jopling C L等[10]發(fā)現(xiàn)，人類肝臟特異性的miR-122能靶向結(jié)合丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV) mRNA 5′非編碼區(qū)而引起病毒的復(fù)制。他們在體外培養(yǎng)細胞中轉(zhuǎn)染miR-122的互補序列使之沉默后，HCV的RNA復(fù)制子減少了80%，而當(dāng)miR-122異位表達后，HCV的數(shù)量得到回升，表明miRNA能夠提高病毒RNA翻譯關(guān)鍵蛋白的數(shù)量，與miRNA減少靶mRNA不同，屬于復(fù)制水平上調(diào)控病毒RNA。Hariharan M等[11]發(fā)現(xiàn)人體有許多miRNA與靶基因結(jié)合后可以抑制人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的復(fù)制。有研究發(fā)現(xiàn)在對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)不易感的豬血液單核細胞中miR-181的表達量比豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)高達9倍之多，血液單核細胞不表達PRRSV的受體CD163，或者表達水平很低，試驗先證實miR-181可以通過靶向PRRSV的基因組RNA而抑制PRRSV的復(fù)制，進一步研究表明，miR-181是通過靶向PRRSV受體CD163的mRNA 3′-UTR，下調(diào)CD163受體的合成從而抑制PRRSV侵入PAMs[12]。也有報道m(xù)iRNA可以通過靶向宿主細胞的相關(guān)免疫效應(yīng)分子進而調(diào)控病毒的感染或復(fù)制[13]。感染了乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的患者，在其肝活組織檢查和血清中，miR-155的表達量都相對較低，在HBV穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細胞系(HepG2.2.15)中，miR-155表達量也下降，隨后證實TLR7的表達與miR-155呈正相關(guān)，并通過NF-κB途徑來誘導(dǎo)miR-155的表達，轉(zhuǎn)染了miR-155的HepG2.2.15細胞中，HBV的病毒量和抗原水平都下降，最后發(fā)現(xiàn)miR-155可以靶向宿主的CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(C/EBP-β)，從而抑制HBV的復(fù)制[14]。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染期間，miR-155可以參與調(diào)控機體的天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，是一個抗炎癥機制的重要的調(diào)節(jié)因子，基于miR-155的治療策略有望控制HCV的感染[15]。在病毒感染過程中，miRNA可以作為干擾素刺激產(chǎn)生的抗病毒分子和干擾素及干擾素刺激基因的調(diào)節(jié)分子[16]，參與宿主的抗病毒防御。有報道IFN-β可以上調(diào)miRNA的表達而發(fā)揮抗病毒作用，Pedersen I M等[17]研究發(fā)現(xiàn)β-干擾素(IFN-β)可以調(diào)節(jié)細胞的miRNA，抑制HCV的復(fù)制，并且IFN-β治療會導(dǎo)致人類肝臟特異性miR-122的表達顯著降低，表明哺乳動物能通過干擾素系統(tǒng)利用細胞miRNA抵御病毒感染。

5.2病毒miRNA的基因調(diào)節(jié)作用

一些病毒在感染宿主的過程中，能形成含有莖環(huán)的二級結(jié)構(gòu)，因而能被宿主細胞內(nèi)的Dicer酶加工剪切形成病毒miRNA (virus miRNA, vmiRNA)[18]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，病毒能夠利用宿主內(nèi)源性mRNA合成自身的miRNA，如皰疹病毒、多瘤病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的某些病毒基因組能夠編碼病毒miRNA，已報道有超過200種病毒編碼的miRNA，發(fā)現(xiàn)主要在DNA病毒中出現(xiàn)，如腺病毒和猿猴空泡病毒，這兩類DNA病毒含有一個單鏈miRNA，這些vmiRNA在調(diào)控病毒基因的自身表達及病毒與宿主的相互作用方面可能起著重要的作用[19]。vmiRNA的生物合成過程與真核細胞miRNA的生成方式一致，vmiRNA的序列相對缺乏保守性，有較高的突變率，使病毒能快速地適應(yīng)不同的細胞環(huán)境變化。vmiRNA對病毒編碼區(qū)基因產(chǎn)生的調(diào)控作用取決于miRNA與靶基因3′非編碼區(qū)的互補程度，這種調(diào)節(jié)作用會降低病毒蛋白的表達，vmiRNA在細胞內(nèi)可參與細胞免疫分子或細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)vmiRNA會通過下調(diào)宿主細胞的mRNA攻擊宿主的防御系統(tǒng)、改變細胞的內(nèi)外環(huán)境，以達到病毒有效的感染致病力，保持長時間的生存力[21]?？傊瑅miRNA不僅可以調(diào)節(jié)自身基因的轉(zhuǎn)錄，而且會對宿主細胞的miRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，調(diào)控宿主細胞mRNA的表達。

6miRNA與siRNA的區(qū)別

自1998年Montgomery M K等[22]發(fā)現(xiàn)RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象以來，重新將人們的視線轉(zhuǎn)移到RNA上來，對小分子RNA的研究給科學(xué)家?guī)砹诵碌乃伎伎臻g，如siRNA、miRNA的發(fā)現(xiàn)給整個生物界帶來深遠的影響。RNAi介導(dǎo)的基因沉默效應(yīng)需要siRNA與靶基因序列完全互補才能發(fā)揮RNAi效應(yīng)，這一點與miRNA相區(qū)別開來，在大多數(shù)情況下，miRNA通過不完全配對的方式多點結(jié)合于靶標(biāo)mRNA的3′-UTR，因而在翻譯水平上負調(diào)控靶基因的表達[23]。而siRNA則通常僅在單個位點與其靶標(biāo)以完全互補配對的方式形成雙體，因此在互補位點直接介導(dǎo)靶標(biāo)mRNA裂解，但是病毒可能會通過改變siRNA的靶標(biāo)序列來逃避RNAi效應(yīng)[24]。從這個意義來說miRNA的基因沉默作用比siRNA作用更為廣泛，也使病毒更難以通過突變的方式來逃避miRNA的特異性沉默作用。

7miRNA的靶標(biāo)預(yù)測

在miRNA的研究中，miRNA與其靶標(biāo)基因之間的相互作用是一大熱點，miRNA的靶標(biāo)通常是從計算機輔助靶基因預(yù)測軟件和試驗驗證兩方面來加以研究，預(yù)測軟件有PicTar、miRanda、miTarget、microTar、RNAhybrid、psRNATarget等，根據(jù)miRNA序列與目標(biāo)靶基因序列結(jié)合自由能以及經(jīng)驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測出特定miRNA的靶基因結(jié)合位點[25]，目前,miRNA靶基因預(yù)測軟件預(yù)測已知的miRNA靶基因有較高的預(yù)測特異性和靈敏度，但存在較高的假陽性率，因此，miRNA是否能切割靶基因最終仍需要試驗驗證[26]。隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，大規(guī)模的靶基因檢測技術(shù)在以后的研究應(yīng)用中將會越來越廣泛，結(jié)合生物信息技術(shù)，miRNA靶基因的驗證也將更具有針對性。

8miRNA的檢測技術(shù)

為了更好的研究miRNA的功能，通常需要檢測miRNA在組織或者細胞中的表達量，檢測方法也越來越具有靈敏性、特異性以及選擇性。成熟的miRNA大小只有21 nt～23 nt，并且在細胞中的表達量相對較低，這些特點使得miRNA的檢測不同于傳統(tǒng)的RNA的檢測，應(yīng)用于檢測miRNA的技術(shù)有Northern blot檢測、實時熒光定量PCR檢測、DNA微陣列芯片、利用各種酶活性檢測miRNA等[27]，這些技術(shù)推動了miRNA的深入研究。其中，實時熒光定量PCR對RNA的檢測靈敏度非常高，但由于成熟的miRNA非常短小，因而引物需要特殊的設(shè)計。它是利用加長引物反轉(zhuǎn)錄PCR來檢測miRNA，通過末端轉(zhuǎn)移酶在miRNA分子的3′末端加上Poly A尾巴，再用30個～40個核苷酸大小的Oligo(dT)作為引物進行反轉(zhuǎn)錄，得到被延長的cDNA，進而可以使用SYBR Green I進行實時定量PCR。

9miRNA的應(yīng)用前景

通過對RNAi、siRNA和miRNA大量而深入的研究，人們意識到miRNA介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)是治療病毒性感染疾病的一個很有發(fā)展?jié)摿Φ氖侄?。miRNA的優(yōu)勢在于，人們能夠運用豐富的分子病毒學(xué)知識和成熟的生物信息學(xué)技術(shù)，推算并證實出miRNA及其靶標(biāo)的存在[28]；其次，miRNA不同于siRNA，不需要與其靶標(biāo)堿基序列嚴(yán)格的互補配對，因而病毒逃避miRNA介導(dǎo)的特異性基因沉默機制可能更難實現(xiàn)。但是miRNA作為基因治療方法也存在一些技術(shù)難題，如一些miRNA的靶標(biāo)位點會被miRNA二級結(jié)構(gòu)或者高度折疊掩蓋。

miRNA在動物及人類中存在，與早期胚胎發(fā)育、細胞分化、細胞凋亡、脂肪代謝、病毒感染和癌癥等多種生物學(xué)過程有重要的聯(lián)系，越來越多的研究表明其在疾病的發(fā)生和發(fā)展中有著重要的地位。目前已有研究人員根據(jù)miRNA具有的序列保守性和前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)特征，提出了一些識別和預(yù)測miRNA的生物信息方法，也得到了生物試驗的驗證，但是已深入研究的miRNA數(shù)量有限，還有許多miRNA有待于研究發(fā)現(xiàn)。因而，全面深入地剖析miRNA的發(fā)生、作用機理及其功能，會對解讀人類和動物的發(fā)育、分化、凋亡和病毒感染等重要生物學(xué)過程具有指導(dǎo)意義。相信隨著研究的不斷深入，基于miRNA的轉(zhuǎn)錄后基因沉默將會成功應(yīng)用于功能基因組學(xué)的研究以及腫瘤、病毒感染等的基因治療。

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Introduction to MicroRNA Research

PENG Ke-ke1,2,OUYANG Ling-xuan1,2,DENG Chao-qian1,2,JIANG Yuan1,2,XU Su-ping1,2,LI Xiao-ning1,2，WEI Xian-kai1,LUO Ting-rong1,2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China;2.StateKeyLaboratoryforConservationandUtilizationofSubtropicalAgro-bioresources,Nanning,Guangxi,530004,China)

Abstract:MicroRNA (miRNA) is a kind of eukaryote endogenous non-coding small single-strand RNA with a length of 21-23 nucleotides.A growing number of miRNA were found in animal cells and plant tissue.These mature small RNA can regulate the expression of target mRNA,suppress protein translation and cause mRNA degradation through binding with complementary target mRNA,which from precursor miRNA(pre-miRNA) with hairpin.MiRNA is an important gene regulator and play an important role in expression and regulation of organism gene,cell differentiation,cellular apoptosis,and antiviral defense.Among them,the deep understanding of miRNA mediated matual adjustment between host and virus,which have far-reaching significance to clarify the virus pathogenic mechanism and treatment strategy.

Key words:MicroRNA;gene regulation;antiviral

文章編號:1007-5038(2016)04-0110-05

中圖分類號:S852.33;Q522.2

文獻標(biāo)識碼:A

作者簡介：彭可可(1991-)，女，湖南永州人，碩士，主要從事動物傳染病防控與分子病毒學(xué)研究。*通訊作者

收稿日期：2015-09-10