禽流感病毒宿主特異性與致病性的分子基礎研究進展

張苗苗，許凱迪，陳鴻軍，徐建青，閆大為，李澤君*，張曉燕*

(1.復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.四川農業(yè)大學，四川成都 611130)

?

禽流感病毒宿主特異性與致病性的分子基礎研究進展

張苗苗1,2，許凱迪3，陳鴻軍2，徐建青1，閆大為2，李澤君2*，張曉燕1*

(1.復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；3.四川農業(yè)大學，四川成都 611130)

摘要：禽流感病毒不斷重排和變異導致新型流感病毒不斷出現(xiàn)，其中有些毒株已經獲得了感染哺乳動物的能力，嚴重危害人類公共衛(wèi)生安全。近年來，對于禽流感病毒致宿主特異性和致病性的研究取得了一定進展。病毒蛋白某些氨基酸位點的突變就能夠改變病毒的宿主特異性，使病毒能夠跨宿主傳播。而且，病毒的RNA聚合酶、NS1非結構蛋白和幾種新發(fā)現(xiàn)的病毒蛋白都與病毒的致病性密切相關。論文闡述了禽流感病毒宿主特異性與致病性的分子基礎，為禽流感跨物種傳播機制研究及防控工作提供參考。

關鍵詞：禽流感病毒；宿主特異性；致病性；病毒分子基礎

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的一種傳染病，天然宿主是禽類和鳥類。我國存在多種亞型禽流感病毒，不同亞型禽流感病毒的基因組重組頻繁。近年來，不斷產生新型禽流感病毒，能夠直接跨物種傳播到人類。1997年，香港暴發(fā)了高致病性H5N1禽流感病毒感染人并致6人死亡；2003年，荷蘭暴發(fā)了H7N7禽流感病毒感染84人并致1人死亡；2004年，亞洲又暴發(fā)了高致病性H5N1禽流感，多個國家均發(fā)生了人感染并致死事件；近幾年來，我國暴發(fā)了H7N9禽流感病毒感染人并致多人死亡事件，2013年底至2014年初，我國報道了3例H10N8禽流感病毒感染人事件，其中2人死亡。這些事件表明多種亞型禽流感病毒正在獲得直接感染人的能力，成為威脅人類健康的重要病原。

1　宿主特異性分子基礎

A型流感病毒具有一定宿主特異性，人體分離株不能在禽體內復制，禽源分離株在靈長類動物體內復制的能力也極低。這取決于細胞受體類型和HA基因上受體結合位點(receptor binding site，RBS)相互識別能力。人類上呼吸道氣管上皮細胞上分布著大量的唾液酸α2,6-半乳糖苷(SAα2,6Gal)受體，人流感病毒優(yōu)先識別并結合該受體，該受體又稱為“人型”受體；禽類腸道上皮細胞上分布著大量的唾液酸α2,3-半乳糖苷(SAα2,3Gal)受體，禽流感病毒優(yōu)先識別并結合該受體，該受體又稱為“禽型”受體。

雪貂對人流感病毒非常易感，是研究流感病毒的最佳動物模型。H5N1流感病毒HA Q222L和G224S突變后，病毒宿主特異性發(fā)生改變，由“禽型”轉為“人型”特異性受體[1]。研究發(fā)現(xiàn)2009 H1N1流感病毒的HA D222G突變后，病毒由原來的"人型"轉為雙重受體特異性[2]。隨后研究發(fā)現(xiàn)H5N1流感病毒HA蛋白 N154D和T156A突變也可使病毒具有雙重受體特異性，而H5N1流感病毒HA蛋白T156的突變可以同時增加病毒結合唾液酸α2,3-半乳糖苷和唾液酸α2,6-半乳糖苷的能力，從而增加病毒的空氣傳播能力[3]。Chen L M等[4]研究證實H5N1流感病毒HA蛋白Q222L/G224S和Q192R的改變可以改變病毒的受體特異性，從而增加病毒在雪貂中的空氣傳播能力。Herfst S等[5]通過H5N1流感病毒HA蛋白Q226L和G228S的改變，發(fā)現(xiàn)病毒能夠通過呼吸道飛沫在雪貂模型中傳播。這些研究說明HA基因的突變影響病毒受體結合特異性和空氣傳播的能力。

盡管HA蛋白在A型流感病毒感染宿主方面起決定性作用，但是宿主特異性是由多種因素決定的。研究發(fā)現(xiàn)，突變PB2蛋白的第627、 701、591位氨基酸能夠引起宿主特異性的改變。禽流感病毒PB2蛋白E627K突變能夠使病毒獲得感染哺乳動物的能力，近幾年發(fā)生的感染人類致死的H5N1、H7N9和H10N8禽流感病毒均發(fā)生了E627K突變。此外，Li Z等[6]首次發(fā)現(xiàn)禽流感病毒H5N1 PB2蛋白發(fā)生Q701N的改變能夠使病毒跨越宿主傳播。Chen Q等[7]也發(fā)現(xiàn)H5N1禽流感病毒PB2蛋白發(fā)生D701N突變后，獲得了感染豚鼠的能力。禽流感病毒H5N2 PB2蛋白E627K和Q591K突變能夠改變宿宿主特異性，使得病毒獲得感染哺乳動物的能力。Yamaji R等[8]證實H5N1禽流感病毒PB2蛋白E249G、G309D和T339M突變能夠增加病毒在A549細胞中的復制能力，說明這幾個位點氨基酸的突變有助于H5N1禽流感病毒對人肺細胞的適應性。Sutton T等[9]發(fā)現(xiàn)H7N1流感病毒PB2蛋白T81I、NP蛋白V284M、M1蛋白R95K以及 M1蛋白Q211K這幾個氨基酸位點的突變能夠使病毒通過空氣在雪貂中傳播。Song J等[10]研究發(fā)現(xiàn)H5N1流感病毒PA蛋白S224P和N383D突變與病毒的哺乳動物適應性相關，這2個位點的突變增強了病毒在禽類和人類細胞中的聚合酶活性，提高了病毒對小鼠的致病性。Chen Q等[11]發(fā)現(xiàn)H7N7禽流感病毒小鼠傳代適應株的幾個氨基酸發(fā)生了改變，即PB2蛋白E627K、PB1蛋白R118I、PA蛋白L550M、HA蛋白G214R、NA蛋白S372N，研究證實這些位點的突變使病毒在哺乳動物細胞中復制，并增強了對小鼠的致病性。也有研究發(fā)現(xiàn)禽流感病毒NS基因A374G突變與病毒跨越宿主障礙在人、豬和犬之間的傳播有很大的關系。該位點的突變與1997年H5N1禽流感病毒和1999年H9N2禽流感病毒跨宿主傳播人類有關[12]。

2　致病性分子基礎

2.1聚合酶蛋白對流感病毒致病性的作用

流感病毒的RNA聚合酶由PB2蛋白、PB1蛋白和PA蛋白3個亞單位組成。PB2蛋白不僅與病毒宿主特異性相關，而且還與病毒的致病性有關。Linster發(fā)現(xiàn)H5N1流感病毒PB2蛋白E627K和PB1蛋白H99Y突變增強了聚合酶活性，使得病毒在MDCK細胞上的復制能力增強[3]。Yamada S等[13]發(fā)現(xiàn)H5N1禽流感病毒Q591K的突變直接改變了PB2蛋白的結構，從而影響PB2蛋白與病毒和細胞受體的相互作用，進而大大增強了病毒對小鼠的致死能力。

研究發(fā)現(xiàn)，入核轉運蛋白α主要與流感病毒的復制有關，其主要與流感病毒聚合酶蛋白進行結合，介導該類蛋白的入核轉運過程。PB2蛋白D701N突變也可以通過促進PB2聚合酶蛋白上核定位信號的暴露來增加病毒PB2蛋白與入核轉運蛋白α之間的結合，從而增強流感病毒的復制能力。研究發(fā)現(xiàn)，H7N7禽流感病毒PB2蛋白D701N、S714R和PA蛋白K615N氨基酸改變后，在哺乳動物細胞上的復制效率顯著提高，而在禽類細胞上的復制效率則顯著下降，而且對小鼠的致病性也顯著提高，PB2蛋白D701N突變也會影響病毒的傳播性，PB2蛋白第701位氨基酸為Gln是該病毒能夠在豚鼠間進行有效傳播的前提條件[14]。

PB1蛋白是RNA聚合酶的催化中心。PB1蛋白可與模板RNA(cRNA)和病毒RNA(vRNA)發(fā)生特異性結合。PB1蛋白主要定位于細胞的內質網膜上，而且在不同細胞中的表達量存在很大差異，體外研究證明該蛋白為流感病毒復制所必需。研究發(fā)現(xiàn) 2009 H1N1流感病毒 PB1蛋白T296R氨基酸突變能夠增強病毒聚合酶活性，從而增強病毒對哺乳動物的致病性[15]。PB1蛋白第622位影響H5N1禽流感病毒對小鼠的致病性，PB1蛋白G622D突變能夠減弱PB1蛋白與病毒RNA的結合，降低聚合酶活性，減弱病毒對小鼠的致病性[16]。

PA蛋白是磷酸化蛋白，其N端是聚合酶的多功能區(qū)，可調控蛋白的穩(wěn)定性、活化核酸內切酶活性、結合帽子和啟動子結構，并且對聚合酶的結構起重要作用，此區(qū)的基因突變會導致宿主蛋白降解。研究發(fā)現(xiàn)，H5N1禽流感病毒PA蛋白第185位氨基酸為Lys，則病毒在體內和體外的復制能力減弱，將其突變?yōu)锳rg后，則顯著增強了病毒在哺乳動物細胞中的聚合酶活性和病毒毒力，增強了病毒對小鼠的致病性[17]。H7N9禽流感病毒PA蛋白S409N突變能夠增強病毒的聚合酶活性，提高病毒對小鼠的致病性[18]。

2.2非結構蛋白NS1對禽流感病毒致病性的影響

NS1是禽流感病毒非結構蛋白，與病毒的毒力和致病性相關。研究發(fā)現(xiàn)位于NS1蛋白RNA結合域的第42位氨基酸對H5N1禽流感病毒在哺乳動物體內的毒力有重要作用，將H5N1禽流感病毒NS1蛋白第42位氨基酸由Pro突變?yōu)镾er后，其對小鼠具有了高致病性，進一步研究發(fā)現(xiàn)NS1蛋白第42位氨基酸對病毒抑制雙鏈RNA對NF-κB和IRF-3途徑的激活起關鍵作用。將NS1蛋白第38和41位氨基酸單獨突變?yōu)锳la時，不能改變病毒對小鼠的高致病性，而將這2個位點同時突變?yōu)锳la,病毒在小鼠體內則完全致弱[19]。Long J X等[20]將H5N1流感病毒NS1蛋白第80-84位氨基酸缺失后，發(fā)現(xiàn)病毒的毒力得到了增強，進一步研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白這5個氨基酸的缺失影響了TNF-α水平，而且NS1-92E氨基酸突變能夠調節(jié)IFN水平。Ayllon J等[21]將H7N9流感病毒NS1蛋白I106M突變后，病毒毒力增強。

2.3新發(fā)現(xiàn)的幾種蛋白對流感病毒致病性的影響

PB1-F2蛋白是PB1+1可讀框編碼的87個殘基的蛋白，該蛋白在感染細胞的線粒體內大量存在。PB1-F2蛋白能夠誘導細胞凋亡，是流感病毒的一個重要的毒力因子。H5N1流感病毒和1918年H1N1流感病毒中PB1-F2蛋白第66位氨基酸發(fā)生突變(N66S)能夠使病毒炎性細胞因子分泌增加,并大大增強病毒的毒力和致病性[22]。

PB1-N40蛋白是PB1蛋白N末端截短后的蛋白。PB1-N40蛋白對病毒的組織培養(yǎng)和雞胚增殖是非必需的蛋白。PB1、PB1-F2和PB1-N40蛋白的表達是相互依賴的，PB1-N40蛋白的一個重要作用就是維持PB1蛋白與PB1-F2蛋白表達量的平衡。去除PB1-F2蛋白的起始密碼子會導致感染初期PB1-N40蛋白的表達過量，而PB1蛋白表達延遲。截短PB1-F2蛋白8個密碼子后，由于破壞了PB1-N40蛋白的AUG起始密碼子，所以不再表達PB1-N40蛋白。PB1-N40蛋白的AUG密碼子發(fā)生突變會導致PB1蛋白的表達量增加3倍[23]。PB1-N40蛋白還能夠影響流感病毒的復制效率。Tauber S等[24]研究發(fā)現(xiàn)，病毒缺失PB1-N40蛋白會降低聚合酶活性，從而減慢病毒的復制速率。

PA-X、PA-N155和PA-N182蛋白都是由PA基因編碼而來。PA-X蛋白調節(jié)宿主對流感病毒感染的應答反應。PA-X蛋白的N端核酸內切酶區(qū)能夠調節(jié)宿主mRNA的降解，但是其作用底物和特異性還不確定[25]。PA-X蛋白具有阻斷宿主細胞的作用，它能夠通過抑制宿主細胞內基因的表達來減弱宿主細胞的抗病毒反應，并介導核糖體對病毒mRNA的轉錄。研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒野毒和PA-X蛋白缺失毒感染小鼠后，小鼠體內的應答反應截然不同，PA-X蛋白缺失毒株感染的小鼠體內許多基因得到上調。分析發(fā)現(xiàn)，這些基因主要與免疫應答(IFN-γ、趨化因子受體CCR5、CD28、IL-7和IL-15信號)、細胞凋亡(Fas通路信號、淋巴毒素)和細胞分化有關。PA-X蛋白缺失毒株能夠加速宿主細胞的抗病毒反應，從而導致感染的小鼠出現(xiàn)更為嚴重的臨床癥狀[25]。PA-N155和PA-N182蛋白是PA蛋白N端截短后的蛋白。A型流感病毒感染不同宿主細胞，均能檢測到PA-N155和PA-N182蛋白的表達。PA-N155和PA-N182蛋白與病毒的致病性有關，Muramoto Y等[26]將表達PA-N155和PA-N182蛋白的第155和182位起始密碼子AUG(Met)突變?yōu)镃UA(Leu)，從而抑制這2種蛋白的表達。研究發(fā)現(xiàn)第155位突變病毒和第155與182雙位點突變的病毒，不但能夠降低病毒在細胞中的復制速率，而且還能夠減小病毒對小鼠的致病性。

最新研究發(fā)現(xiàn)H5N1禽流感病毒NA蛋白(S269D、E41H)、NS1蛋白(S48N、K212N)、M1蛋白(V166A)、M2蛋白(G14E)、NP蛋白(Q48P)以及PB1-F2蛋白(Q48P)等氨基酸位點的突變與病毒的致病性由低轉高相關[27]。

綜上所述，流感病毒的宿主特異性和致病性是多因素相互作用的結果，其不僅與病毒本身有關，而且宿主因素也起到非常重要的作用。因此，對病毒宿主范圍和致病性分子基礎進行深入的研究，不僅有助于了解病毒的致病機理，還能準確掌握病毒的變異方向，為預測具有潛在流行性的毒株奠定基礎。

參考文獻:

[1]Chutinimitkul S,van Riel D,Munster V J,et al.Invitroassessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity[J].J Vrol,2010,84(13):6825-6833.

[2]Chutinimitkul S,Herfst S,Steel J,et al.Virulence-associated substitution D222G in the hemagglutinin of 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus affects receptor binding[J].J Virol,2010,84(22):11802-11813.

[3]Linster M,van Boheemen S,de Graaf M,et al.Identification,characterization,and natural selection of mutations driving airborne transmission of A/H5N1 virus[J].Cell,2014,157(2):329-339.

[4]Chen L M,Blixt O,Stevens J,et al.Invitroevolution of H5N1 avian influenza virus toward human-type receptor specificity[J].Virology,2012,422(1):105-113.

[5]Herfst S,Schrauwen E J A,Linster M,et al.Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets[J].Science,2012,336(6088):1534-1541.

[6]Li Z,Chen H,Jiao P,et al.Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalian mouse model[J].J Virol,2005,79(18):12058-12064.

[7]Li Q,Wang X,Sun Z,et al.Adaptive mutations in PB2 gene contribute to the high virulence of a natural reassortant H5N2 avian influenza virus in mice[J].Virus Res,2015,210:255-263.

[8]Yamaji R,Yamada S,Le M Q,et al.Identification of PB2 mutations responsible for the efficient replication of H5N1 influenza viruses in human lung epithelial cells[J].J Virol,2015,89(7):3947-3956.

[9]Sutton T C,Finch C,Shao H,et al.Airborne transmission of highly pathogenic H7N1 influenza virus in ferrets[J].J Virol,2014,88(12):6623-6635.

[10]Song J,Xu J,Shi J,et al.Synergistic effect of S224P and N383D substitutions in the PA of H5N1 avian influenza virus contributes to mammalian adaptation[J].Sci Rep,2015,22;5:10510.doi:10.1038/srep10510.

[11]Chen Q,Yu Z,Sun W,et al.Adaptive amino acid substitutions enhance the virulence of an H7N7 avian influenza virus isolated from wild waterfowl in mice[J].Vet Microbiol,2015,177(1):18-24.

[12]Selman M,Dankar S K,Forbes N E,et al.Adaptive mutation in influenza a virus non-structural gene is linked to host switching and induces a novel protein by alternative splicing[J].Emerging Microbes & Infections,2012,1(11):e42.

[13]Yamada S,Hatta M,Staker B L,et al.Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus[J].PLoS Pathog,2010,6(8):e1001034-e1001034.

[14]Gao Y,Zhang Y,Shinya K,et al.Identification of amino acids in HA and PB2 critical for the transmission of H5N1 avian influenza viruses in a mammalian host[J].PLoS Pathog,2009,5(12):e1000709-e1000709.

[15]Yu Z,Cheng K,Sun W,et al.A PB1 T296R substitution enhance polymerase activity and confer a virulent phenotype to a 2009 pandemic H1N1 influenza virus in mice[J].Virology,2015,486:180-186.

[16]Feng X,Wang Z,Shi J,et al.Glycine at position 622 in PB1 contributes to the virulence of H5N1 avian influenza virus in mice[J].J Virol,2015(9)：2387-2415.

[17]Fan S,Hatta M,Kim J H,et al.Amino acid changes in the influenza a virus PA protein that attenuate avian H5N1 viruses in mammals[J].J Virol,2014,88(23):13737-13746.

[18]Yamayoshi S,Yamada S,Fukuyama S,et al.Virulence-affecting amino acid changes in the PA protein of H7N9 influenza A viruses[J].J Virol,2014,88(6):3127-3134.

[19]Jiao P,Tian G,Li Y,et al.A single-amino-acid substitution in the NS1 protein changes the pathogenicity of H5N1 avian influenza viruses in mice[J].J Virol,2008,82(3):1146-1154.

[20]Long J X,Peng D X,Liu Y L,et al.Virulence of H5N1 avian influenza virus enhanced by a 15-nucleotide deletion in the viral nonstructural gene[J].Virus Genes,2008,36(3):471-478.

[21]Ayllon J,Domingues P,Rajsbaum R,et al.A single amino acid substitution in the novel H7N9 influenza A virus NS1 protein increases CPSF30 binding and virulence[J].J Virol,2014,88(20):12146-12151.

[22]Conenello G M,Tisoncik J R,Rosenzweig E,et al.A single N66S mutation in the PB1-F2 protein of influenza A virus increases virulence by inhibiting the early interferon response in vivo[J].J Virol，2011,85(2):652-662.

[23]Wise H M,Foeglein A,Sun J,et al.A complicated message:Identification of a novel PB1-related protein translated from influenza A virus segment 2 mRNA[J].J Virol,2009,83(16):8021-8031.

[24]Tauber S,Ligertwood Y,Quigg-Nicol M,et al.Behaviour of influenza A viruses differentially expressing segment 2 gene products in vitro and in vivo[J].J Gen Virol，2012,93(Pt 4):840-849.

[25]Jagger B W,Wise H M,Kash J C,et al.An overlapping protein-coding region in influenza A virus segment 3 modulates the host response[J].Science,2012,337(6091):199-204.

[26]Muramoto Y,Noda T,Kawakami E,et al.Identification of novel influenza A virus proteins translated from PA mRNA[J].J Virol,2013,87(5):2455-2462.

[27]Khaliq Z,Leijon M,Belák S,et al.A complete map of potential pathogenicity markers of avian influenza virus subtype H5 predicted from 11 expressed proteins[J].BMC Microbiol,2015,15(1):128.doi:10.1186/s12866-015-0465-x.

收稿日期：2015-12-23

基金項目：國家自然科學基金項目(31472206)

作者簡介：張苗苗(1988-)，女，陜西寶雞人，博士研究生，主要從事病原生物學研究。*通訊作者

中圖分類號:S852.659.5

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)07-0102-04

Progress on Molecular Basis of Host Specificity and Pathogenicity of Avian Influenza Viruses

ZHANG Miao-miao1，2,XU Kai-di3,CHEN Hong-jun2,XU Jian-qing1,YAN Da-wei2,LI Ze-jun2,ZHANG Xiao-yan1

(1.ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,FudanUniversity，Shanghai，201508,China；2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai，200241,China；3.SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu，Sichuan，611130，China)

Abstract:Because of the reassortment and mutant,many new avian influenza viruses emerged in these years and several strains have gained the ability to infect mammals,which posed great harm to public health and safety.In recent years,the studies of host specificity and pathogenicity of avian influenza viruses made great progress.Mutation of certain amino acids of virus proteins will be able to change host specificity and enable viruses to spread across different hosts.Moreover,the viral RNA polymerase proteins,NS1 non-structural protein and several newly discovered virus proteins are closely related to virus pathogenicity.This paper described the molecular basis of host specificity and pathogenicity of avian influenza viruses,which provided an important theoretical basis for cross-species mechanism study and prevention and control of the influenza viruses.

Key words:Avian influenza virus; host specificity; pathogenicity; molecular basis