piRNA/PIWI在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究進展

周代兵　張凌云　許國雄

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piRNA/PIWI在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究進展

周代兵張凌云許國雄

人類全基因組中僅約1%～2%的核苷酸能夠被轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)，余下98%以上均為非編碼RNA (non-coding RNA，ncRNA)，可在基因水平上發(fā)揮其生物學功能[1]。在ncRNA中，核苷酸序列長度小于200bp的稱為短鏈非編碼RNA (short non-coding RNA，sncRNA)，占全部ncRNA的10%～20%[2, 3]，包括PIWI蛋白結(jié)合RNA (PIWI-interacting RNAs， piRNAs)、微小RNA (microRNA，miRNA)、重復相關小RNA(repeat associated small interfering RNAs，rasiRNA)以及小干擾RNA (small interference RNA，siRNA)[4]。肝臟惡性腫瘤是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)生率和死亡率居我國惡性腫瘤的前五位[5]。盡管2016年美國癌癥總死亡率下降23%，但肝癌的發(fā)病率和死亡率卻呈上升趨勢[6]。肝癌的早期篩查與診斷對肝癌的治療和預后的改善至關重要。piRNA可以在分子水平調(diào)控肝癌的發(fā)生發(fā)展，可以為肝癌的早期篩查和靶向治療提供新的思路。

一、piRNA概述

(一)piRNA/PIWI的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)特征以及生物學功能2006年，Aravin等[7]利用離心淘析和免疫共沉淀技術(shù)在雄性小鼠睪丸組織分離出一段小RNA。研究發(fā)現(xiàn)，此小RNA主要與Argonaute家族PIWI蛋白成員(Argonaute3、Piwi、Aubergine)[8]相互作用而將其命名為piRNA。PIWI蛋白作為piRNA/PIWI復合物中的核心組分，結(jié)合其他重要功能分子，在piRNA發(fā)揮生物功能過程中起著關鍵作用[9]。piRNA主要是作為PIWI的“信使”調(diào)控靶基因的穩(wěn)定性表達、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后水平的修飾[10]。

piRNA是一類長約30 nt的單鏈小RNA，5′端含有一個單磷酸其團，并具有強烈的尿嘧啶傾向性，3′端2-OH呈現(xiàn)甲基化[9]。piRNA主要存在于基因間隔區(qū)，具有成簇分布特點，基因區(qū)或重復序列區(qū)較少見[11, 12]。piRNA以高度特異鏈的方式對應于單鏈基因組位點，正義鏈或反義鏈專一性較好，在生物體內(nèi)表達具有組織特異性。在果蠅實驗中發(fā)現(xiàn)，生殖細胞中piRNA基因在Zucchini核酸酶的參與下，由lncRNA前體加工而來；轉(zhuǎn)錄成的初級piRNA穿過核膜到胞漿后，經(jīng)定位在核周體NUAGE上的Aub和AGO3的核酸內(nèi)切酶Slicer激活PIWI蛋白內(nèi)切酶活性，剪切形成次級piRNA，并且通過“乒乓循環(huán)”機制使細胞中的piRNA大量擴增，最后PIWIL4蛋白結(jié)合piRNA進入核內(nèi)發(fā)揮生物學效應[13-15]。

研究發(fā)現(xiàn)，piRNA主要存在于老鼠[7]、果蠅[16]、斑馬魚、人等哺乳動物體內(nèi)的生殖細胞和干細胞中。其中，人類已發(fā)現(xiàn)的PIWI蛋白主要有PIWIL1(HIWI、piwi homology), PIWIL2 (PIWIL1L、CT80、Miwi like、鼠科Mili)，PIWIL3(HIWI3)和PIWIL4 (HIWI2、 MIWI2)四種亞型[17, 18]。piRNA通過與PIWI蛋白結(jié)合形成piRNA復合物，識別并結(jié)合轉(zhuǎn)座子，裂解轉(zhuǎn)座子基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA或沉默胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)座子基因，從而調(diào)控著生殖細胞自我更新和干細胞的增殖分化[19]。除此之外，piRNA在表觀遺傳控制、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及維系基因的穩(wěn)定性等方面也起著重要作用[12]。

(二)piRNA/PIWI與腫瘤關系近年來，短鏈非編碼RNA與實體腫瘤細胞增殖分化和浸潤轉(zhuǎn)移的研究取得很大進展，在乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌等癌癥中均有大量短鏈非編碼RNA的相關報道。自2006年發(fā)現(xiàn)piRNA后，piRNA/PIWI蛋白與癌癥的關系引起了研究者們的關注[20]，piRNA作為短鏈非編碼RNA成員之一，主要是通過PIWI蛋白形成piRNA/PIWI復合體參與到機體的生命活動中。短鏈非編碼RNA可在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上通過RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)調(diào)控基因表達，還可作為“免疫警察”監(jiān)控外源核酸類似物，免遭外來威脅。Argonaute家族蛋白作為RISC重要成員之一，有三個重要RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即PAZ (Piwi/Argonaut/Zwille)、MID(Middle)和Piwi (P-element-induced wimpy testis)結(jié)構(gòu)域，piRNA/PIWI復合體與RISC PAZ結(jié)構(gòu)域相互作用,結(jié)合到靶mRNA上進行剪切或抑制翻譯[21]。

PIWI蛋白缺失后，RNA聚合酶II在染色體區(qū)域富集，導致RNA合成能力增強，促使表觀遺傳發(fā)生改變[9]，包括DNA高度甲基化、組蛋白去乙酰化、抑制轉(zhuǎn)座子激活、染色質(zhì)異構(gòu)化等，這些表觀遺傳學的改變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。例如DNA甲基化可引起癌基因的激活和抑癌基因的沉默，促使腫瘤失控性增生；組蛋白去乙?；蓪е录毎芷谡{(diào)控紊亂，DNA損傷修復受阻；休眠轉(zhuǎn)座子的激活則導致基因失活等。

大量研究發(fā)現(xiàn)，piRNA/PIWI除在正常人體內(nèi)的睪丸和造血干細胞大量表達外，在很多腫瘤組織和腫瘤細胞株均有異常表達[22]。例如在胰腺癌[23]、乳腺癌[24]和卵巢癌[25, 26]等腫瘤中，PIWI在腫瘤表達量越高，惡性程度越大，預后越差。敲低PIWI基因后，腫瘤細胞生長被抑制、惡性程度降低，暗示了piRNA/PIWI可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[27]。近年來，也有研究者將PIWI蛋白作為腫瘤惡性程度和預后判斷的一個監(jiān)測指標[28]。

二、piRNA/PIWI與肝癌關系

肝癌病情進展快、療效差、早期易轉(zhuǎn)移，臨床診斷時多數(shù)患者已處于中晚期，失去了最佳治療時機。目前對肝癌的治療主要是以手術(shù)治療為主，輔以介入、免疫、化療等綜合治療，但總體效果仍不理想。研究發(fā)現(xiàn)，piRNA/PIWI可能與肝癌的增殖[27]、抗凋亡[29]以及侵襲轉(zhuǎn)移[30]等發(fā)生發(fā)展密切相關。

前期研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中存在一種多潛能分化的干細胞，使得肝癌細胞具有無限增殖及細胞周期調(diào)節(jié)失控特性。干細胞是腫瘤細胞的起始細胞,它具有自我更新分化的能力。PIWIL2作為人PIWI蛋白家族成員之一，在干細胞分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，肝癌干細胞這種無限分化能力很有可能與PIWIL2有關[31]。PIWIL2過表達引起信號傳導與轉(zhuǎn)錄激活因子3 (Stat3)表達量增加，通過Stat3/Bcl-xL和Stat3/CyclinD1兩種途徑，激活Stat3下游靶基因CyclinD1和抗凋亡基因Bcl-xL，導致細胞周期調(diào)控紊亂，G1期不斷向S期轉(zhuǎn)換，抑制凋亡；Law等[32]發(fā)現(xiàn)，相比鄰近正常肝臟組織，piRNA piR-Hep1在原發(fā)性肝癌細胞中上調(diào)46.6%；Pearson相關分析發(fā)現(xiàn)PIWIL2與piR-Hep1呈現(xiàn)正相關(r=0.424，P=0.025)；PIWIL2可激活PI3K/AKT信號通路，使得下游基因AKT過度磷酸化，促進細胞增殖；敲低piR-Hep1后，細胞增殖能力下降，侵襲力減弱。Zhao等[30]也發(fā)現(xiàn)，相比正常肝細胞L02,在高侵襲性的肝癌細胞HCCLM3，MHCC97H和MHCC97L中HIWI mRNA及HIWI蛋白表達增高，組織水平也顯示瘤內(nèi)HIWI表達量明顯高于臨近正常肝組織，統(tǒng)計分析顯示HIPI表達與增殖細胞核抗原、腫瘤大小以及轉(zhuǎn)移方式正相關(P<0.05)；敲低HIWI后，細胞增殖和侵襲能力均明顯下降。同時還發(fā)現(xiàn)，HIWI高表達(尤其低甲胎蛋白和病理Edmondson-Steiner分級為低級患者)是肝癌患者總生存期和無復發(fā)生存期縮短的一個獨立危險因素，與患者的預后密切相關。

調(diào)控肝癌生物學行為的機制異常復雜，信號轉(zhuǎn)導通路間相互作用可影響肝癌的發(fā)生進展和預后，這些信號轉(zhuǎn)導通路包括血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路、核化因子NF-κB信號通路等。在Baek等[33]構(gòu)建的MT1/TGFα轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，轉(zhuǎn)化生長因子-α(transforming growth factor -alpha，TGF-α)的過表達可使TGF-β失活，并使正常肝細胞獲得具有惡性肝腫瘤無限增殖的特性，從而誘變?yōu)楦伟┘毎?。與此同時，PIWI蛋白可通過與分子伴侶蛋白如熱休克蛋白90(HSP90)競爭性結(jié)合TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路中TGF-βI型受體，抑制下游的Smad2和Smad3磷酸化，導致細胞周期素依賴激酶抑制物p21和纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的表達下調(diào)，引起細胞周期調(diào)控紊亂，抑制細胞凋亡，促進腫瘤細胞的無限增殖與分化[34]。也有學者研究認為PAI-1可能是通過Fas/Fas-L介導的凋亡途徑產(chǎn)生抑制效應[35]。但是以上兩項研究并沒有闡明PIWI蛋白在促進肝癌細胞增殖分化中是否受到TGF-β信號通路的調(diào)控，因此還需進一步研究。另外，Ye等發(fā)現(xiàn)PIWI樣蛋白PIWIL2可與NF-κB相互作用，通過NF-κB信號通路參與腫瘤細胞增殖分化[36]。最近也有研究發(fā)現(xiàn)，具有NF-κB1基因多態(tài)性的HCV(Hepatitis C virus)肝病患者罹患肝癌風險明顯高于正常組[37]。同樣PIWI蛋白是否參與NF-κB1基因突變誘導肝癌發(fā)生還需深入研究。

侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌預后差、復發(fā)率高的最重要原因。側(cè)重于肝癌的一、二級預防可為肝癌的早期診斷和預防打下基礎，發(fā)現(xiàn)早期肝癌生物標志物對于提高肝癌切除率和生存期有重要意義。目前盡管還未見在肝癌患者中檢測外周血piRNA的相關報道，但在胃癌研究中已發(fā)現(xiàn)外周血piR-651和piR-823通過qRT-PCR方法檢測出來，且具有較高的靈敏度和特異性，可作為循環(huán)胃癌細胞檢測與診斷的一個分子標志物[38, 39]用于篩查胃癌患者。從這些研究中看出對于研究肝癌相關的piRNA作為肝癌發(fā)生發(fā)展的標志物具有重要的借鑒意義。

三、總結(jié)與展望

piRNA/PIWI與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關，如：piRNA-651[39]、piR-Hep1[32]等,但它們與PIWI在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體調(diào)控機制尚不明了[40]。目前，piRNA通過Argonaute蛋白家族影響著癌癥的發(fā)生發(fā)展已廣泛地受到研究者的關注[41]。有研究者根據(jù)Argonaute蛋白家族在癌癥中的作用，對piRNA/PIWI在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機制進行了推測：(1) piRNA/PIWI激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關的轉(zhuǎn)錄因子如：Twist1/2和Zeb1/2[42]，使得E-鈣黏著蛋白、波形蛋白等過表達，促進了肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移；(2) piRNA/PIWI通過DNA甲基化、組蛋白乙?；缺碛^途徑在轉(zhuǎn)錄水平上抑制轉(zhuǎn)座子表達，導致基因不穩(wěn)定性增加，雙鏈DNA斷裂后損傷修復異常，促使肝癌的發(fā)生；(3) piRNA與miRNA均屬于非編碼小RNA成員。miRNA與Argonaute蛋白相互作用以形成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，并結(jié)合到mRNA的互補序列導致mRNA降解，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，故而有理由認為piRNA與miRNA具有相似的調(diào)控效應[43-45]。另外，piRNA還可沉默miRNA 3'-UTR區(qū)的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，削弱miRNA的抑瘤效應[46]；(4) piRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上通過Slicer酶切調(diào)控lncRNA的表達量，導致原癌基因激活或者是抑癌基因滅活，進而誘導肝癌的發(fā)生[46]。

PIWI依賴性piRNA基因生物合成機制及其在癌癥中作用尚未完全明了。有研究者發(fā)現(xiàn)，機體內(nèi)還存在一種非PIWI依賴性的piRNA通路參與機體生物調(diào)控[47]，但其是否參與腫瘤細胞的生物學行為還需進一步研究。piRNA/PIWI在肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體機理尚處在初步階段，借助新型高通量測序技術(shù)及后續(xù)實驗的驗證，將會發(fā)現(xiàn)更多與肝癌發(fā)生發(fā)展相關的piRNA，給肝癌治療提供新的方向，并將有可能作為新型分子標志物用于肝癌的早期診斷、治療以及預后判斷。

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(本文編輯：張苗)

201508上海復旦大學附屬金山醫(yī)院中心實驗室

許國雄，Email：gboxu@163.com

2016-04-08)