MF59佐劑的研究進(jìn)展

李卓凡 綜述，李衛(wèi)東 審校

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118)

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·綜述·

MF59佐劑的研究進(jìn)展

李卓凡 綜述，李衛(wèi)東△審校

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118)

MF59；佐劑；作用機(jī)制

MF59佐劑的研究始于20世紀(jì)80年代末期。在當(dāng)時(shí)重組DNA背景下，許多新的蛋白質(zhì)抗原都可以用于疫苗制備。Chiron疫苗公司研制的HBV重組疫苗的成功尤其推動(dòng)了這種微生物加鋁佐劑的疫苗模式[1]。但HBV是1種特殊的，可以自發(fā)形成高免疫原性病毒樣顆粒的抗原，而其他大多數(shù)重組抗原均是可溶解的單體，并且在和鋁佐劑結(jié)合后只有很弱的免疫原性。這些抗原需要比鋁佐劑效力更強(qiáng)的佐劑來獲得保護(hù)性的免疫力，如弗氏佐劑。因此，研制1種既能提高抗原的免疫原性，又可以避免像弗氏佐劑一樣的反應(yīng)原性佐劑就成了問題的關(guān)鍵。而20多年后，MF59成為第2個(gè)成功上市的佐劑，說明了這一工作的成功。

1　MF59

1.1乳劑作為佐劑將乳劑用于佐劑已有很長的歷史。Freund等[2]在70多年前證明了礦物油(石蠟)與結(jié)核分枝桿菌結(jié)合具有佐劑的作用，即弗氏完全佐劑。而之后油包水(w/o)不含細(xì)菌成分的乳劑(弗氏不完全佐劑)被用于獸用疫苗。盡管弗氏不完全佐劑也曾被用于人用疫苗(如流感疫苗)，但其反應(yīng)原性限制了廣泛的使用。乳佐劑的早期應(yīng)用為MF59的研制提供了一定的思路，即油相需要生物可降解，表面活性劑需具有可安全應(yīng)用的歷史背景。水包油(o/w)乳劑可將油相比例降低，從而顯著增加人體對(duì)佐劑的耐受性，同時(shí)也可降低佐劑的黏度。因此，在20世紀(jì)80年代末，o/w乳劑作為佐劑開始被應(yīng)用于免疫增強(qiáng)劑[3-4]。

1.2表面活性劑藥物乳劑是1種內(nèi)部不穩(wěn)定的分散體，需要加入表面活性劑降低界面張力，防止液滴凝結(jié)。表面活性劑通常含有疏水性和親水性2種組分，定位于界面上。盡管帶電的表面活性劑是乳劑穩(wěn)定劑的最佳選擇，但非離子性表面活性劑因其低毒性和對(duì)添加劑的低敏感性而更廣泛地使用。表面活性劑根據(jù)其親水性與疏水性的比例(HLB、1～20)，可以定義其相對(duì)的水相或油相的親和力。聚山梨醇酯(Tween)是HLB在9～16的表面活性劑，而失水山梨醇酯(Span)HLB為2～9。HLB值高與低的表面活性劑的組合是常用的乳劑穩(wěn)定劑。因此，表面活性劑的選擇是MF59研制的重要步驟，使其成為微小的、穩(wěn)定的液滴，能夠被過濾除菌[5]。

1.3角鯊烯MF59中的油相組分是角鯊烯，是1種自然生成的三萜烯烴，組分單一(C30H50)但結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在許多植物、動(dòng)物以及人體中都有分布。角鯊烯是生物合成人體甾類激素途徑的中間物，是合成膽固醇的前體物質(zhì)。角鯊烯在人體肝臟中合成(>1 g/d)并通過血流循環(huán)，在皮膚分布最多，是皮脂分泌物的主要組分。同時(shí)，在脂肪組織、肌肉和淋巴結(jié)中，大量的角鯊烯在自然情況下均有分布。因此，角鯊烯是兼具生物可降解性和生物兼容性的組分，也是人類飲食的1種正常組分，人類正常攝入50～200 mg/d。

1.4MF59的生產(chǎn)MF59基本生產(chǎn)步驟是將Span85分散在含有角鯊烯和Tween80的緩沖液中，之后高速攪拌至乳狀。之后，將乳劑反復(fù)用微射流機(jī)流射以形成o/w乳劑的微粒(160 nm)，再過濾除菌。MF59乳劑制備后可保持穩(wěn)定性達(dá)3年以上。

2　MF59的作用機(jī)制

2.1MF59不在注射部位形成抗原庫早期用于疫苗生產(chǎn)的乳佐劑是w/o的形式，通常包含不可降解的油脂，可在注射部位有效地形成1個(gè)抗原庫[6]。在針對(duì)MF59的機(jī)制研究中，研究者用放射性物質(zhì)(I125Ag、H3squalene)標(biāo)志抗原(gD2)和角鯊烯，觀察了其在兔的肌肉注射部位的運(yùn)輸情況。這些研究顯示，被標(biāo)志的角鯊烯中只有10%在注射6 h后仍在注射的點(diǎn)上，并在120 h后降低至5%。同時(shí)，盡管在6 h后有25%的gD2抗原仍在注射點(diǎn)，120 h后降低至0.05%。因此，說明MF59不同于w/o形式的佐劑，并未在注射部位形成抗原庫?？乖妥魟┮圆煌膭?dòng)力學(xué)速率被相對(duì)快速地清除[7]。

2.2MF59激發(fā)注射部位的抗原提呈上升早期有研究應(yīng)用免疫熒光共聚焦的方法評(píng)估了小鼠中佐劑和抗原在注射部位附近組織的分布情況(DiI squalene、FITC gD2)[8]。肌肉注射3 h后，MF59大部分在細(xì)胞外，少量可在引流淋巴結(jié)的膜下檢測到，說明存在一定程度的胞外運(yùn)輸，可能直接通過淋巴管進(jìn)行。注射后48 h，MF59和抗原gD2大部分出現(xiàn)在注射部位的細(xì)胞內(nèi)。與此同時(shí)，48 h時(shí)在引流淋巴結(jié)內(nèi)也出現(xiàn)了MF59數(shù)量增多的情況。在T細(xì)胞附近的副皮質(zhì)區(qū)域也發(fā)現(xiàn)了含有MF59的細(xì)胞。MF59很可能是在細(xì)胞內(nèi)被運(yùn)輸至淋巴結(jié)，這是MF59作用機(jī)制中最重要的1個(gè)途徑。肌肉注射后，MF59和抗原在細(xì)胞內(nèi)的共定位觀察到MF59可以起到運(yùn)輸系統(tǒng)的作用，激活附近的細(xì)胞對(duì)抗原進(jìn)行提呈。注射部位含有抗原的細(xì)胞對(duì)DEC205和MHCⅡ型細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，證明這些細(xì)胞是前樹突狀細(xì)胞。關(guān)于MF59是運(yùn)輸系統(tǒng)的假設(shè)在對(duì)分離出的人的免疫細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)研究時(shí)得到了證明。研究說明，MF59可以直接增強(qiáng)吞噬作用和胞飲作用并促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞對(duì)抗原的提呈作用。并且據(jù)推測，MF59能夠作用的主要細(xì)胞類型是單核細(xì)胞，可以被募集至佐劑作用的部位，吸收抗原并參與佐劑引起的針對(duì)樹突狀細(xì)胞表型的分化[9]。

2.3MF59召集免疫細(xì)胞到注射部位MF59注射后，通過對(duì)肌肉細(xì)胞的分離，密度梯度純化及流式細(xì)胞分析，顯示出其對(duì)于單核細(xì)胞的召集作用[10]。MF59注射后2 d，分離出的肌肉部位的單核細(xì)胞增加了7倍，之后緩慢減少。這些細(xì)胞中很大一部分是F4/80陽性的巨噬細(xì)胞，少部分是CD11c陽性的樹突狀細(xì)胞。目前的猜測是MF59的注射促進(jìn)了趨化因子的分泌，從而召集了外周血中的單核細(xì)胞。1項(xiàng)研究顯示，CCR2 陽性小鼠中的細(xì)胞流動(dòng)與CCR2-/-(無主要趨化因子受體)敲除的小鼠有顯著區(qū)別。CCR2是單核細(xì)胞趨化蛋白1～5受體(MCP-1～MCP-5)，表達(dá)于單核細(xì)胞上。因此，在CCR2 敲除的小鼠上檢測到細(xì)胞流動(dòng)的增加是MF59對(duì)于細(xì)胞召集的有力說明。這項(xiàng)假說被另1個(gè)將MF59用作佐劑的團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步印證。Hui等[11]的試驗(yàn)顯示了缺乏ICAM-1分子的小鼠對(duì)鐮狀虐原蟲疫苗的中和抗體滴度遠(yuǎn)低于正常對(duì)照組小鼠。ICAM-1在細(xì)胞黏附及血細(xì)胞外滲中起重要作用，因此這是細(xì)胞滲透的重要中介。ICAM-1依賴的免疫反應(yīng)是MF59類似的乳佐劑特異性的，未在MPL類似的免疫增強(qiáng)佐劑中發(fā)現(xiàn)。

2.4MF59募集中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)行抗原提呈并運(yùn)輸至引流淋巴結(jié)Calabro和同事將熒光標(biāo)志的佐劑和模式抗原卵清蛋白(OVA)注射至小鼠體內(nèi)并用流式細(xì)胞法分析肌肉和淋巴結(jié)細(xì)胞。他們檢測到不同類型的免疫細(xì)胞在肌肉細(xì)胞中的重復(fù)波動(dòng)，包括粒細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞等，及潛在的抗原提呈細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。這些細(xì)胞會(huì)在2～3周內(nèi)將佐劑和抗原一同運(yùn)輸至引流淋巴結(jié)[12]。

2.5MF59促進(jìn)抗原在淋巴結(jié)和濾泡樹突狀細(xì)胞的停留有報(bào)道，在研究MF59對(duì)疫苗抗原的促進(jìn)作用時(shí)，用免疫熒光共聚焦的方法研究了抗原向小鼠淋巴結(jié)的運(yùn)輸情況。他們?cè)谛∈竺庖吆?、6 h和7 d時(shí)取引流淋巴結(jié)觀測。1 h 后，抗原就可在淋巴結(jié)的被膜下竇和髓室被檢測到，至二免后，抗原全部保存在濾泡樹突狀細(xì)胞。同時(shí)，也檢測到生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞對(duì)抗原特異性抗體的大量分泌，而不加MF59的組別并無此現(xiàn)象，這說明MF59 對(duì)于抗原在淋巴節(jié)中保存并提呈起到了直接作用[13]。

3　MF59與流感疫苗的結(jié)合

從1990年開始，許多公司致力于研究新型的疫苗佐劑，類型包括乳佐劑、免疫刺激復(fù)合物、脂質(zhì)體和微粒[14]。Syntex公司研制的o/w 乳佐劑包含角鯊烯和1種化學(xué)合成的免疫增強(qiáng)劑，N-乙酰胞壁酸-L-蘇氨酸-D谷氨酰胺。N-乙酰胞壁酸-L-蘇氨酸-D谷氨酰胺是MDP的衍生物，是分枝桿菌細(xì)胞壁中最有效的佐劑成分。但該佐劑的反應(yīng)原性太強(qiáng)被放棄。之后Chiron 疫苗公司用角鯊烯和1種化學(xué)合成的MDP(胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺，MDP-PE)做流感疫苗佐劑(MF59)，也因反應(yīng)原性被放棄。但根據(jù)其臨床前及臨床研究，MDP-PE并不是MF59 作為流感疫苗佐劑所必須的成分[15-16]。因此，MF59的成分確定為角鯊烯1種組分，并只針對(duì)1種目標(biāo)人群是老年人的流感疫苗。

自MF59 1997年批準(zhǔn)上市，大量的臨床研究和上市后的監(jiān)控研究均證明了MF59的安全性和可靠性，在應(yīng)對(duì)2009年H1N1流感大流行時(shí)，也證明了其廣泛使用時(shí)的可靠性。最近，在連續(xù)3個(gè)流感流行季節(jié)展開的大規(guī)模(>170 000 例)具有前瞻性的觀察項(xiàng)目后，添加MF59 佐劑的流感疫苗將65歲以上因?yàn)榱鞲泻头窝锥朐旱睦先说臄?shù)量降低了23%[17]。

但目前在美國，有許多伊拉克退伍士兵在退伍之后患有“海灣戰(zhàn)爭綜合征”的情況被與其曾接種含有角鯊烯的流感疫苗的經(jīng)歷聯(lián)系起來，引起了一些質(zhì)疑。而關(guān)于佐劑中的角鯊烯是否能夠引起角鯊烯特異性的抗體，目前還存在爭議[18]。

4　MF59和其他疫苗的研究進(jìn)展

除了在流感疫苗上的成功使用，MF59在其他疫苗的臨床前研究中也表現(xiàn)出了免疫增強(qiáng)的作用。許多臨床研究的疫苗都已經(jīng)有加入MF59 佐劑之后的評(píng)價(jià)研究，如HIV、CMV、HSV、HBV、HCV等。

MF59在單純皰疹病毒疫苗(HSV-2)的3期保護(hù)效力試驗(yàn)被評(píng)價(jià)為無法提供持續(xù)的保護(hù)效力。在之前的研究中，HSV-2同樣沒有顯示出治療性疫苗的保護(hù)效力，但錯(cuò)誤的要求交叉保護(hù)性才是失敗的關(guān)鍵[19]。1個(gè)加入MF59佐劑的疫苗進(jìn)入臨床研究的原因是其能夠引起高滴度的中和抗體和效應(yīng)T細(xì)胞的反應(yīng)。如果能夠以這種簡單的標(biāo)準(zhǔn)來評(píng)價(jià)疫苗，就能夠達(dá)到疫苗研制的初衷[20]。但高滴度的中和抗體無法提供對(duì)HSV-2感染的保護(hù)，且性傳播疾病通常暴露在高病毒載量環(huán)境下。

5　結(jié)　　語

MF59能夠成為繼鋁佐劑之后第2個(gè)成功上市的佐劑，與研發(fā)者獨(dú)特的眼光密不可分，也有從之前的佐劑研發(fā)失敗的經(jīng)歷中獲得的寶貴經(jīng)驗(yàn)，也有一定的運(yùn)氣成分——與已上市的流感疫苗的聯(lián)系促成了這一成就。研究者們?cè)趪L試將更多的疫苗與MF59佐劑結(jié)合起來，但這一路途必然艱巨而不可知。無論如何，MF59 佐劑在其安全性方面從未失敗過，在其評(píng)價(jià)的試驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的耐受性。在今后的發(fā)展中，MF59 將繼續(xù)被其他疫苗所利用，例如CMV，也會(huì)在HIV疫苗的效力試驗(yàn)中作為單獨(dú)的免疫增強(qiáng)劑[21]。近期，MF59也將應(yīng)用于流感四價(jià)疫苗中。

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