兒童抗核抗體不同稀釋度檢測結(jié)果分析*

龐舒尹，陳奕豪，劉海英△，陳曲波，蔡　莉，彭小芳，高　飛，代玉梅，劉云鋒

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗科，廣州 510000；2.廣東省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)資源中心，廣州 510000；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心體檢中心，廣州 510000)

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·論著·

兒童抗核抗體不同稀釋度檢測結(jié)果分析*

龐舒尹1，陳奕豪1，劉海英1△，陳曲波2，蔡莉3，彭小芳1，高飛1，代玉梅1，劉云鋒1

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心檢驗科，廣州 510000；2.廣東省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)資源中心，廣州 510000；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心體檢中心，廣州 510000)

摘要:目的比較不同血清稀釋滴度對兒童抗核抗體間接免疫熒光分析(ANA-IIF)結(jié)果的影響，探討降低血清起始稀釋度必要性。方法以間接免疫熒光法檢測110例健康兒童系列稀釋度血清標(biāo)本抗核抗體(ANA)，并與特異性ANA線性免疫(ANA-LIA)結(jié)果相比較；同時分析一組ANA-IIF陰性的臨床患兒標(biāo)本ANA-LIA結(jié)果。結(jié)果健康組標(biāo)本隨著稀釋度從1∶80、1∶40、1∶20逐步減低，ANA-IIF陽性檢出率有所上升，分別為7.3%、9.1%、10.9%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，弱陽性分別為7.3%、15.5%、31.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。110例健康體檢兒童中8例標(biāo)本檢測出特異性ANA，陽性率為7.3%。8例IIF法稀釋度1∶80陽性者中，特異性ANA陽性者2例；稀釋度1∶40、1∶20新增的4例熒光ANA陽性標(biāo)本中，有1例特異性ANA陽性。若視ANA-IIF(1∶80)或ANA-LIA任一陽性為ANA陽性，ANA陽性率從7.3%上升到12.7%。29例ANA-IIF(1∶80)為陰性的自身免疫肝病相關(guān)自身抗體檢測患兒臨床標(biāo)本中，特異性ANA-LIA檢測出5例陽性(17.2%)。結(jié)論降低兒童血清起始滴度并不能明顯提高ANA-IIF陽性檢出率，反而增加了非特異的弱陽性，因此，臨床實驗室不需改變兒童ANA常規(guī)標(biāo)本稀釋滴度，聯(lián)合特異性ANA-LIA的檢測有利于ANA的發(fā)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞:抗核抗體；兒童；間接免疫熒光分析；自身免疫性肝病

抗核抗體(ANA)是風(fēng)濕免疫病診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后的重要指標(biāo)，在臨床醫(yī)療工作中發(fā)揮著越來越重要的作用。以HEp-2細(xì)胞為基質(zhì)的間接免疫熒光分析(IIF)則為臨床上最為常用的ANA初篩方法。自身抗體檢測一般都需要采用稀釋血清，只有在一定的稀釋度上的陽性結(jié)果才具有臨床參考意義，尤其是IIF，其陽性滴度越高，越表明自身免疫性疾病的可能。傳統(tǒng)系統(tǒng)的ANA滴度達(dá)1∶160陽性才被視為具有診斷意義，而1∶80滴度陽性往往很少發(fā)現(xiàn)有診斷相關(guān)的特異性ANA，從而被作為臨界線，相應(yīng)地，臨床上將血清1∶80稀釋度當(dāng)作ANA篩查的起始稀釋度[1]。因此，ANA的起始稀釋度直接決定了結(jié)果的陰陽，影響著臨床的判斷。目前，ANA的標(biāo)本稀釋度一般是建立在成人數(shù)據(jù)基礎(chǔ)之上，這個工作稀釋度是否適用于兒童人群有待研究。大多數(shù)兒童自身免疫性疾病發(fā)生在3～13歲，該年齡段包括免疫系統(tǒng)在內(nèi)各個系統(tǒng)尚處于發(fā)育成熟過程。以自身抗體常見的免疫球蛋白亞類IgG為例，其血液濃度在5歲時只達(dá)到成人的一半，8歲時為80%，13歲以后才接近成人水平[2-3]。眾多臨床醫(yī)生懷疑，對于自身免疫性疾病患兒，其血清滴度并不能以成人的水平去要求，于是有人提出在臨床高度疑似患兒，如常規(guī)稀釋度(1∶80或1∶40)為陰性時，可降低稀釋度，有些還被納入疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)中，如兒童自身免疫性肝炎，在其簡化積分制診斷標(biāo)準(zhǔn)中將ANA陽性滴度降為1∶20[4-5]。盡管目前沒有研究數(shù)據(jù)證明降低稀釋度究竟能有多大幅度提高診斷陽性率，在實際工作中，也沒有評估過降低稀釋度對由于非特異染色增高而影響結(jié)果判斷、帶來假陽性的負(fù)面干擾[6]。本研究擬采用健康體檢的正常兒童血清標(biāo)本進(jìn)行不同稀釋度的ANA檢測，并結(jié)合特異性ANA的線性免疫分析，以探討為提高兒童ANA檢測靈敏度而降低工作起始稀釋度的必要性。

1資料與方法

1.1一般資料(1)健康組為3～13歲、半年內(nèi)無疫苗接種、無病毒感染史的學(xué)校統(tǒng)一體檢或門診健康體檢兒童110例，以1歲為1個年齡段，每個年齡段男女各5例，排除患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、川崎病、脈管炎、腎炎、干燥綜合征、硬皮病、重癥肌無力、幼年皮肌炎、多發(fā)性皮肌炎、混合結(jié)締組織病、韋格納肉芽腫等自身免疫性疾病以及發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛等風(fēng)濕免疫相關(guān)臨床癥狀。抽取清晨空腹靜脈血，按常規(guī)方法離心分離血清，剔除有明顯渾濁、黃疸、溶血等標(biāo)本。按時檢測，體檢標(biāo)本則在常規(guī)檢測完畢后，及時分裝剩余血清儲于-70 ℃待用。每個標(biāo)本進(jìn)行ANA-IIF和特異性ANA線性免疫(ANA-LIA)，試劑盒均購自德國歐蒙實驗診斷公司。(2)觀察組為住院或門診進(jìn)行自身免疫性肝病相關(guān)自身抗體檢測的患兒標(biāo)本，其中自身免疫性肝病相關(guān)自身抗體均為陰性的29例標(biāo)本。

1.2ANA-IIF篩查采用包含HEp-2細(xì)胞和鼠肝組織冰凍切片等2種抗原基質(zhì)。遵循試劑盒說明書的血清標(biāo)本起始稀釋度，按照操作步驟進(jìn)行實驗。結(jié)果判讀采用試劑盒說明書推薦的定性判斷，細(xì)胞核無特異性熒光視為陰性，有弱的特異性熒光模型為弱陽性，呈現(xiàn)中等強(qiáng)度清晰可辨的熒光模型時則為陽性，呈現(xiàn)強(qiáng)熒光模型為強(qiáng)陽性。根據(jù)核型的熒光強(qiáng)弱，檢測結(jié)果報告為弱陽性、陽性或強(qiáng)陽性。除常規(guī)檢測外，另采用試劑盒標(biāo)本稀釋液對血清進(jìn)行系列稀釋(1∶20，1∶40，1∶80)，之后操作、判斷均同前述。

1.3特異性ANA-LIA采用可同時檢測12種常見特異性抗體(nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、Jo-1、CENP B、dsDNA、核小體、組蛋白、核糖體P蛋白)膜條。按照試劑盒說明書進(jìn)行實驗操作和檢驗結(jié)果解釋判斷，在相應(yīng)抗原線處出現(xiàn)明顯藍(lán)紫色條帶為陽性反應(yīng)，根據(jù)抗原帶著色的深淺將結(jié)果報告為陰性、臨界陽性(弱陽性)、陽性、強(qiáng)陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，健康體檢者不同稀釋滴度陽性檢出率的比較采用R×C表的χ2檢驗，兩組間率的比較則采用四格表Pearson或Fisher′s精確χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1健康組ANA-IIF檢測結(jié)果110例健康體檢兒童中，血清稀釋滴度為1∶80時，陽性8例(顆粒型、核仁型各4例)，弱陽性8例(顆粒型1例、胞漿顆粒型7例)；稀釋滴度為1∶40時，陽性10例(顆粒型5例、核仁型4例、胞漿顆粒1例)，弱陽性17例，新增9例弱陽均為胞漿顆粒型；稀釋滴度為1∶20時，陽性12例(顆粒型5例、核仁型4例、胞漿顆粒3例)，弱陽性35例，新增19例弱陽胞漿顆粒型。標(biāo)本隨著稀釋度從1∶80、1∶40、1∶20逐步提高，陽性檢出率分別為7.3%(8/110)、9.1%(10/110)、10.9%(12/110)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.88，P>0.05)，而弱陽性的檢出率分別為7.3%(8/110)、15.5%(17/110)、31.8%(35/110)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.1，P<0.01)。

2.2健康組ANA-LIA檢測結(jié)果110例健康體檢兒童中8例標(biāo)本檢測出特異性ANA，陽性率為7.3%，具體為抗組蛋白2例、抗dsDNA 2例、抗nRNP 1例、抗Sm 1例、抗SSB 1例、抗Ro-52 1例。8例IIF法稀釋度1∶80陽性者中，特異性ANA陽性者2例(顆粒型/抗組蛋白、核仁型/抗組蛋白)；稀釋度提高的1∶40、1∶20新增的4例陽性標(biāo)本中，僅有1例1∶20胞漿顆粒陽性/抗nRNP；其余IIF陽性者特異性ANA均為陰性，余下5例特異性ANA陽性者其IIF法在不同稀釋度呈弱陽性。若視IIF法1∶80或特異性ANA任一陽性為ANA陽性，則陽性檢出率從7.3%上升到12.7%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.655，P>0.05)。

2.3觀察組線性免疫檢測結(jié)果29例IIF-ANA 1∶80為陰性的臨床患兒標(biāo)本中，特異性ANA-LIA檢測出5例陽性(17.2%)，分別為抗-組蛋白1例、抗dsDNA 1例、抗SSA 2例、抗核糖體P蛋白 1例。

3討論

無論是1999年積分診斷系統(tǒng)，還是2008年簡化診斷標(biāo)準(zhǔn)，ANA一直被納為自身免疫性肝病(AIH)診斷中的一項重要積分依據(jù)[4-5]。50%～70%的Ⅰ型AIH患者ANA陽性，均質(zhì)型、斑點型為AIH最為常見的熒光模型，但都不具備AIH特異性，目前為止尚未發(fā)現(xiàn)特異性ANA，其主要靶抗原為單鏈DNA(57%～85%)、雙鏈DNA(0～50%)、組蛋白(25%～40%)、染色質(zhì)(39%)、核糖體核蛋白(20%～58%)等。Ⅰ型AIH中ANA陽性率70%，其中與SMA共同陽性60%，另有15%僅為ANA陽性[7]。ANA滴度對可疑患者是可能或確定的AIH診斷積分有用。ANA也在其他肝臟疾病中存在，如病毒性肝炎、藥物性肝炎、酒精性肝病、肝細(xì)胞肝癌以及某些肝外疾病。抗Ro52在Ⅰ型AIH中陽性率達(dá)77%[7]。

ANA最常用以及最常規(guī)的方法是大鼠肝、腎、胃組織的冰凍切片，篩查方法可為HEp-2細(xì)胞基質(zhì)片，而診斷積分則組織切片的價值要高。AIH診斷的積分系統(tǒng)是否適用于兒童AIH的診斷標(biāo)準(zhǔn)，有學(xué)者提議了專門用于兒童AIH診斷標(biāo)準(zhǔn)，采用了基于包括臨床、生化、免疫和組織學(xué)的積分系統(tǒng)，其中自身抗體滴度要比成人低1個稀釋度，如成人ANA或SMA臨界值為1∶40，而兒童則為1∶20[8-9]。盡管如此，有研究評價得到現(xiàn)用的簡化標(biāo)準(zhǔn)其靈敏度低而特異性稍高。美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會提出，對于IIF，在每個實驗室建立自己的參考區(qū)間后，應(yīng)以適當(dāng)?shù)馁|(zhì)控和參考物確立篩查稀釋度；并且，結(jié)果分析需綜合熒光模型、抗體水平和患者年齡。老年人，尤其女性，易于產(chǎn)生低滴度(低于1∶80)的自身抗體但沒有臨床自身免疫性疾病癥狀，而對于年幼患者，篩查稀釋度可降至1∶40[10]。

IIF篩查稀釋度的高低與試驗特異性、敏感性存在辯證關(guān)系，非特異熒光干擾隨血清稀釋度減小而增加，當(dāng)篩查稀釋度越大時，敏感性降低而特異性增加，當(dāng)稀釋度越小，敏感性增加但特異性降低。因此，排除不必要的非特異干擾，實驗室必須確定正確的稀釋度，在大多數(shù)健康人群血清標(biāo)本檢測時呈陰性結(jié)果，又能保證患者群眾最低稀釋度的特異性自身抗體，對陽性結(jié)果判斷和平衡敏感性、特異性方面具有重要價值。本研究比較了健康兒童不同稀釋滴度的IIF檢測結(jié)果，顯示隨著稀釋度的提高，陽性檢出率從7.3%提高到10.9%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但是，由稀釋度提高導(dǎo)致弱陽性的胞漿顆粒染色而導(dǎo)致非特異干擾卻明顯加強(qiáng)(31.8%)。因此，提高患兒ANA檢測稀釋度，提高陽性檢出率有限，反而大大增加了結(jié)果觀察的干擾。

當(dāng)然，兒童免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完全，血循環(huán)免疫球蛋白水平與成人有一定差距，這也是降低稀釋滴度提高陽性檢出率的客觀依據(jù)。但是，這并不是提高ANA陽性檢出率、避免漏診的唯一手段。近年來，隨著研究的不斷深入，ANA所針對的靶抗原逐一得到鑒別，在其基因工程重組抗原基礎(chǔ)上發(fā)展了靈敏度更高、特異性更強(qiáng)的特異性ANA檢測方法，如酶免疫測定(EIA)、LIA。ANA特異性抗體的EIA法可自動化、成本效益比高，是國外實驗室首選方法。LIA因技術(shù)、設(shè)備要求低、可肉眼判斷結(jié)果，在我國應(yīng)用較為廣泛。特異性ANA檢測是IIF的補充，許多IIF陰性患者，其特異性ANA可檢出陽性。因此對于臨床疑似AID的患者，無論ANA初篩試驗陰性與否，均需進(jìn)行各種針對特異性抗體的確認(rèn)試驗，但是各種特異性抗體的確認(rèn)試驗不能完全替代篩查試驗。當(dāng)然這也與IIF-ANA選取的基質(zhì)有關(guān)，如果選用轉(zhuǎn)染了Ro60 cDNA的HEp-2000細(xì)胞為基質(zhì)則可提高檢測靈敏度，從而減少IIF-ANA陰性與LIA-ANA陽性不符的發(fā)生。在健康組LIA-ANA陽性率與IIF-ANA一致，不過陽性者不完全重疊，而29例臨床標(biāo)本IIF-ANA為陰性的患兒中，17.2% LIA-ANA陽性。因此研究提示，不需提高抗體滴度，增加特異性ANA的檢測也可以提高ANA的陽性檢出率，這點也符合ANA檢測中“臨床高度懷疑時無論ANA結(jié)果如何，建議醫(yī)生申請ENA特異性抗體檢測”國內(nèi)外專家共識及建議。

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*基金項目：廣東省廣州市衛(wèi)生局西醫(yī)類重點項目(201102A212023)。

作者簡介：龐舒尹，女，技師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗工作。 △通訊作者，E-mail：xiangliuhaiying@aliyun.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.13.010

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)13-1772-03

(收稿日期：2016-02-10修回日期：2016-04-22)

Analysis on detection results of different dilution titers of antinuclear antibodies in children*

PANGShuyin1,CHENYihao1,LIUHaiying1△,CHENQubo2,CAILi3,PENGXiaofang1,GAOFei1,DAIYumei1,LIUYunfeng1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedGuangzhouMunicipalWomenandChildren′sMedicalCenter,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510000,China;2.MedicalResourceCenter,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510000,China;3.MedicalExaminationCenter,AffiliatedGuangzhouWomenandChildren′sMedicalCenter,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510000,China)

Abstract:ObjectiveTo compare the influences of different dilution titers on the ANA detection by the indirect immunofluorescence assay(IIF) in children for investigating the necessity of reducing serum initial dilution titer.MethodsSerum ANA was detected by using the indirect immunofluorescence assay at a serial of dilution titer in 110 healthy controls and the results were compared with the results of specific ANAs by the linear immunoassay (LIA);meanwhile the ANA-LIA results in clinical children patients with ANA-IIF negative were also analyzed.ResultsWith the dilution titers gradual decrease from 1∶80,1∶40 and 1∶20 in the samples of the health group,the positive detection rates of ANA-IIF were risen,which were 7.3%,9.1% and 10.9% respectively,but the differences were not statistically significant(P>0.05),the weak-positive rates were 7.3%,15.5% and 31.8% respectively,the differences were statistically significant(P<0.01).Among 110 healthy children under going the physical examination,the specific ANA was detected out in 8 samples,the positive rate was 7.3%.Among 8 positive cases at the dilution titer of 1∶80 by the IIF method,specific ANA was in 2 cases;in 4 added cases of fluorescence ANA positive samples at the dilution titers of 1∶40 and 1∶20,specific ANA was in 1 case.If with any positive of ANA-IIF(1∶80) or ANA-LIA as the ANA positive,the ANA positive rate was risen from 7.3% to 12.7%.In the clinical samples among 29 cases of ANA-IIF(1∶80) negative autoimmune liver disease related autoantibody detection,the specific ANA-LIA positive was detected in 5 cases (17.2%).ConclusionReducing the initial titer of children serum is unable to obviously increase the ANA-IIF positive detection rate,on the contrary increases the non-specific weak positive.Therefore,clinical laboratory does not change the dilution titer of children routine ANA sample.The detection by combining with the specific ANA-LIA spectrum is conducive to find ANA.

Key words:antinuclear antibodies;children;indirect immunofluorescence assay;autoimmune liver diseases