中藥有效成分對白色念珠菌生物膜作用的研究現(xiàn)狀

李亞婷，劉林波，黃燕杰 綜述，郭瑞林 審校

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712000；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西咸陽 712000)

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·綜述·

中藥有效成分對白色念珠菌生物膜作用的研究現(xiàn)狀

李亞婷1，劉林波1，黃燕杰2綜述，郭瑞林3△審校

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽 712000；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西咸陽 712000)

白色念珠菌；生物膜；中藥有效成分

近年來，隨著臨床廣譜抗菌藥物和免疫抑制劑的大量使用，老年病、艾滋病的增加，以及有創(chuàng)治療的廣泛應(yīng)用，使得白色念珠菌感染性疾病不斷增多，研究表明這與人體免疫力的下降以及相關(guān)醫(yī)療設(shè)備上白色念珠菌生物膜的形成密切相關(guān)[1]。生物膜是指微生物在生長過程中附著于物體表面形成的由微生物的細(xì)胞及其分泌的聚合物所組成的多細(xì)胞復(fù)合體[2]。生物膜是白色念珠菌的毒力因子之一，能形成生物膜的菌株毒力更強(qiáng)[3]，即使在沒有特定的耐藥基因積累的條件下，白色念珠菌生物膜對抗真菌藥物的耐藥性，仍比浮游菌高1 000倍[4]。白色念珠菌生物膜的高耐藥性伴隨臨床的診斷延遲使其在世界范圍內(nèi)具有了較高的病死率[5]。目前發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌生物膜體外形成過程為：(1)白色念珠菌菌體黏附于物體表面；(2)細(xì)胞增殖并形成一層基底膜；(3)假菌絲生長伴隨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌形成生物膜；(4)脫落的酵母相細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)移黏附形成新的生物膜[6]。因此，白色念珠菌細(xì)胞黏附及菌絲的形成是其致病性的獨(dú)特機(jī)制。針對這種情況，研究抗白色念珠菌生物膜的藥物是控制相關(guān)感染的關(guān)鍵。傳統(tǒng)中藥在抗感染治療方面具有抗菌譜廣，不良反應(yīng)少等獨(dú)特的優(yōu)勢，中藥有效成分對白色念珠菌生物膜作用的研究已經(jīng)引起關(guān)注，本文就近年來中藥有效成分對白色念珠菌生物膜作用的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1　穿心蓮

穿心蓮具有抗感染、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[7]，穿心蓮內(nèi)酯(AG)是中藥穿心蓮的有效成分之一。汪長中等[8]在成功構(gòu)建白色念珠菌生物膜后，分別用1 000 μmol/mL和100 μmol/mL的AG作用于白色念珠菌生物膜后，用Hoechst 33528染色，可觀察到細(xì)胞核呈濃染的致密、固縮狀態(tài)或顆粒狀熒光的凋亡狀態(tài)，而10 μmol/mL的AG作用的細(xì)胞未見明顯凋亡；同時(shí)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測線粒體膜電位和活性氧(ROS)，結(jié)果提示AG可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)白念珠菌生物膜細(xì)胞凋亡，也能促進(jìn)ROS的產(chǎn)生來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。施高翔等[9]通過掃描電鏡觀察不同濃度的AG對白色念珠菌生物膜的作用，發(fā)現(xiàn)500 mg/L的AG可以使酵母相細(xì)胞數(shù)有所減少，1 000 mg/L的AG作用下酵母相細(xì)胞分布稀疏；同時(shí)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測3個(gè)白色念珠菌生物膜相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)：AG干預(yù)后，促分散的HSP90基因上調(diào)，抗分散的UME6基因下調(diào)，有利于生物膜的分散，但是促分散的PES1基因下調(diào)反而不利。就檢測的3個(gè)生物膜分散相關(guān)基因的表達(dá)來說，生物膜的促分散效應(yīng)超過抗分散效應(yīng)。這表明AG可將生物膜狀態(tài)的真菌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x菌，從而利于其他抗真菌藥物發(fā)揮抑制及殺傷作用。因此，AG既能誘導(dǎo)白色念珠菌生物膜凋亡，又能促進(jìn)其細(xì)胞分散。

2　肉　　桂

肉桂為樟科植物肉桂的干燥樹皮，其性甘、溫、大熱，歸腎、脾、心、肝經(jīng)，具有補(bǔ)火助陽、散寒止痛、溫經(jīng)通脈、引火歸原的功效。肉桂皮揮發(fā)油的主要成分是肉桂醛，它可以通過抑制ATP酶、細(xì)胞壁的生物合成，以及改變膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性來抑制細(xì)菌生長[10]。朱賢森等[11]用10 mg/mL肉桂醛進(jìn)行芽管試驗(yàn)，研究白色念珠菌由酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)變，發(fā)現(xiàn)它能抑制白色念珠菌芽管及菌絲的形成，使其出芽率小于20%并且沒有長度≥20 μm的菌絲出現(xiàn)。許穎等[12]用MTT法測定不同濃度肉桂醛作用于白色念珠菌生物膜后的吸光值來計(jì)算其抑制率，發(fā)現(xiàn)隨肉桂醛濃度的增加抑制率不斷增加，4 096 μg/mL的肉桂醛對48 h白色念珠菌生物膜的抑制率可達(dá)95.17%，此外256、1 024、4 096 μg/mL的肉桂醛對培養(yǎng)了60、90、120 min的白色念珠菌的黏附均有抑制作用。說明肉桂醛具有較明顯的抑制白念珠菌生物膜的作用。

3　赤　　芍

赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根，其味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有涼血活血、通經(jīng)止痛、清肝消癰之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明赤芍具有保肝、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓形成、抗血小板聚集、降血糖、抗腫瘤等作用[13]。芍藥苷屬于單萜糖苷類化合物，是中藥赤芍的主要成分之一。王殿明等[14]用瓊脂打孔、MTT活細(xì)胞染色以及FDA/PI熒光染色3種方法發(fā)現(xiàn)隨著芍藥苷濃度的增加，它對白色念珠菌的抑菌環(huán)直徑逐漸增大、黏附率逐漸降低、生物膜中死菌的比例逐漸增加，其中在芍藥苷質(zhì)量濃度為4 g/L時(shí)對白色念珠菌生物膜的抑制率高達(dá)92.63%。

4　苦　　參

苦參為清熱燥濕類中藥，具有利尿、抗感染、抗病毒、抗腫瘤、抗纖維化等功效，其主要有效成分為苦參堿。Lu等[15]用甲基四氮鹽(XTT)減低法發(fā)現(xiàn)，苦參堿抑制2、8、24、48 h白色念珠菌生物膜的抑制生物膜50%(SMIC50)分別為4.0、7.0、13.0、28.0 mg/mL。成熟生物膜是復(fù)雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以菌絲相為主且死菌濃度較低，用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察生物膜在3.0 mg/mL苦參堿的作用后，白色念珠菌細(xì)胞雖有假菌絲形成，但多以孢子相為主，其中死菌濃度顯著增高，不能形成明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。提示苦參堿可以使白色念珠菌生物膜的形成受到限制[16]。汪長中等[17]的研究顯示，苦參堿對白色念珠菌生物膜的SMIC50與SMIC80分別為0.5、1.0 mg/mL，同時(shí)在倒置顯微鏡(×200倍)下觀察可見1.0 mg/mL苦參堿作用后，白色念珠菌生物膜只出現(xiàn)少量酵母細(xì)胞，無菌絲出現(xiàn)；0.1 mg/mL苦參堿作用后可見到菌絲及沿著菌絲分布的酵母細(xì)胞；但當(dāng)濃度降至0.01 mg/mL時(shí)則可見酵母細(xì)胞與菌絲交織形成較密集的生物膜。

5　漢防己

為防己科植物漢防己的根，具有祛風(fēng)濕、止痛、利水消腫的作用。粉防己堿又稱為漢防己甲素，是從漢防己中提取的屬于雙芐基異喹啉類化合物的生物堿，具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)、抗肝纖維化等作用[18]。Zhao等[19]用XTT法發(fā)現(xiàn)，相較于陰性對照組，在培養(yǎng)白色念珠菌生物膜90 min后加入16 mg/L的粉防己堿可以顯著的抑制其生物膜的形成，在濃度達(dá)到64 mg/L時(shí)，白色念珠菌生物膜的形成不足5%；待白色念珠菌生物膜成熟后，在64 mg/L的粉防己堿作用下生物膜結(jié)構(gòu)只剩下約15%。白色念珠菌細(xì)胞表面疏水性(CSH)與其黏附力呈正相關(guān)，且白色念珠菌正常CSH為0.73，用水-烴兩項(xiàng)測定實(shí)驗(yàn)檢測CSH發(fā)現(xiàn)，隨著粉防己堿濃度的增加白色念珠菌CSH不斷降低，在32 mg/L粉防己堿作用下其CSH僅為0.04；用倒置相差顯微鏡(×40)觀察，粉防己堿對白色念珠菌酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)變的抑制呈劑量依賴性，在濃度達(dá)到16 mg/L時(shí)粉防己堿完全抑制了白色念珠菌菌絲的形成。此外用qRT-PCR觀察，在32 mg/L的粉防己堿作用下菌絲形成相關(guān)基因如ECE1、HWP1、ALS3、 SAP4、SAP5、SAP6、UME6、EED1 和HGC1的表達(dá)下調(diào)。說明粉防己堿可以抑制白色念珠菌酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)換，也能從多個(gè)方面抑制白色念珠菌生物膜的形成。

6　厚　　樸

厚樸其性苦、辛、溫，歸脾、胃、肺、大腸經(jīng)，具有燥濕化痰、下氣除滿的功能。和厚樸酚是從傳統(tǒng)中藥厚樸根皮中提取的具有生物活性的化學(xué)物質(zhì)[20]。田玉珠等[21]用XTT減低法研究發(fā)現(xiàn)15.63～62.5 μg/mL的和厚樸酚對白色念珠菌黏附作用的影響隨濃度的增加的而增加。此外，15.63～2 000.00 μg/mL的和厚樸酚作用于成熟的白色念珠菌生物膜，抑菌率為24.21%～90.13%，在和厚樸酚濃度為15.63～1 000.00 μg/mL時(shí)其濃度與抑菌率呈正相關(guān)，但2 000 μg/mL與1 000 μg/mL和厚樸酚抑菌率相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用CLSM觀察，相較于陰性對照組，和厚樸酚作用于白色念珠菌生物膜后，生物膜厚度降低，死菌數(shù)量增加。說明和厚樸酚能抑制白色念珠菌生物膜的形成，并可破壞已成型的生物膜。

7　大　　蒜

大蒜是常用的調(diào)味品，有健胃、助消化等作用?，F(xiàn)代研究表明從大蒜鮮莖中提取的揮發(fā)性油狀物大蒜素結(jié)構(gòu)簡單、易得，具有抗病原微生物、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等卓越功效[22]。王煥麗等[23]發(fā)現(xiàn)大蒜素對白色念珠菌生物膜形成的各個(gè)時(shí)期均有較明顯的抑制作用，這一點(diǎn)可能與其抑制白色念珠菌細(xì)胞黏附有關(guān)。此外，用血清芽管計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)在64 μg/mL的大蒜素作用下白色念珠菌芽管的形成率僅為(2.2±1.2)%，說明一定濃度的大蒜素能夠通過影響白色念珠菌芽管的形成而抑制其生物膜的形成及致病性。

8　小　　結(jié)

在傳統(tǒng)中藥有效成分對白色念珠菌生物膜相關(guān)作用的研究中發(fā)現(xiàn)：赤芍、肉桂、穿心蓮、厚樸等藥物對其有明顯的抑制作用，其中赤芍、肉桂、漢防己、厚樸、大蒜可以通過影響白色念珠菌細(xì)胞黏附而影響其生物膜的形成；苦參、漢防己、大蒜可影響白色念珠菌生物膜形態(tài)的改變而抑制其生物膜的形成；穿心蓮可誘導(dǎo)白色念珠菌生物膜細(xì)胞凋亡及分散。另有研究顯示：空心蓮子草、黃荊、廣藿香[24]、當(dāng)歸[25]、地膚子[26]等也具有良好的抗白色念珠菌的作用，但對白色念珠菌生物膜是否具有抑制作用尚不明確。目前對于白色念珠菌生物膜的研究大多是體外實(shí)驗(yàn)，而體內(nèi)環(huán)境與體外環(huán)境存在著巨大的差異，傳統(tǒng)中藥治療白色念珠菌感染的確切機(jī)制尚需大量的臨床研究證實(shí)，尋找有效對抗白色念珠菌生物膜形成的藥物仍然任重道遠(yuǎn)。

[1]Nett JE,Marchillo K,Spiegel CA,et al.Development and validation of an in vivo candida albicans biofilm denture model[J].Infect Immun,2010,78(9):3650-3659.

[2]Nobile CJ,Fox EP,Nett JE,et al.A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans[J].Cell,2012,148(1/2):126-138.

[3]陽雋，張?zhí)焱?，朱家馨．白色念珠菌體外生物膜形成與基因分型關(guān)系的研究[J]．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，33(13)：1539-1541．

[4]Taff HT,Nett JE,Zarnowski R,et al.A candida biofilm-induced pathway for matrix glucan delivery:implications for drug resistance[J].PLoS Pathog,2012,8(8):e1002848.

[5]Haque F,Alfatah M,Ganesan K,et al.Inhibitory effect of sophorolipid on candida albicans biofilm formation and hyphal growth[J].Sci Rep,2016,6(1):23575.

[6]Nobile CJ,Johnson AD.Candida albicans Biofilms and Human Disease[J].Annu Rev Microbiol,2015,69(1):71-92.

[7]呂巧莉，涂國剛，王嘉琦，等．穿心蓮內(nèi)酯的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J]．南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，53(1)：83-86．

[8] 汪長中,韓寧,徐振華,等.穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)白念珠菌生物膜分散細(xì)胞凋亡的研究[J].中國中藥雜志,2012,37(3):362-365.

[9] 施高翔,嚴(yán)園園,邵菁,等.穿心蓮內(nèi)酯對白念珠菌生物膜分散的影響[J].中國中藥雜志,2014,39(17):3339-3343.

[10]Shreaz S,Bhatia R,Khan N,et al.Influences of cinnamic aldehydes on H+extrusion activity and ultrastructure of Candida[J].J Med Microbiol,2013,62(2):232-240.

[11]朱賢森，黃曉東，黃志勤．肉桂醛抗白假絲酵母菌實(shí)驗(yàn)研究[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2009，20(9)：2302-2303．

[12]許穎，西玉立，楊景云，等．肉桂醛對根管內(nèi)白色念珠菌生物膜作用的體外研究[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23(4)：335-336．

[13]Xu WP,Zhong W,Liu JL,et al.Study on anti-tumor effect of total glycosides from radix paeoniae rubra in s180 tumor-bearing mice[J].Afr J Tradit Complement Altern Med,2013,10(3):580-585.

[14]王殿明，王健平，楊景云，等．芍藥苷對白色念珠菌生物膜的作用[J]．中國組織工程研究，2014，18(25)：4038-4042．

[15]Lu J,Ye S,Qin R,et al.Effect of Chinese herbal medicine extracts on cell-mediated immunity in a rat model of tuberculosis induced by multiple drug-resistant bacilli[J].Mol Med Rep,2013,8(1):227-232.

[16] 吳嵐,周曾同,周永梅,等.苦參堿對白色念珠菌生物膜的體外抑制作用[J].上?？谇会t(yī)學(xué),2009,18(4):415-418.

[17]汪長中，程惠娟，官妍，等．苦參堿對體外白念珠菌生物膜抑制作用[J]．中國公共衛(wèi)生，2008，24(12)：1491-1492．

[18]曹金，楊兆文，李鳳，等．漢防己甲素的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J]．世界臨床藥物，2013，34(2)：75-79．

[19]Zhao LX,Li DD,Hu DD,et al.Effect of tetrandrine against Candida albicans biofilms[J].PLoS One,2013,8(11):e79671.

[20]徐才兵，賈運(yùn)濤，田睿，等．和厚樸酚羥丙基-β-環(huán)糊精包合物制備及驗(yàn)證[J]．中國藥學(xué)雜志，2013，48(16)：1385-1388．

[21]田玉珠，王健平，楊景云，等．和厚樸酚對根管內(nèi)白色念珠菌生物膜作用的體外研究[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25(2)：154-156．

[22]魯銳，項(xiàng)標(biāo)，劉靜文，等．大蒜素的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2013，24(3)：711-713．

[23]王煥麗，張錫寶，陳興平．大蒜素體外抗白念珠菌生物膜作用的初步研究[J]．中國真菌學(xué)雜志，2010，5(3)：129-132．

[24]吳和珍，蘇文煬，付聰，等．廣藿香等五種中藥體外抗白色念珠茵作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]．湖北中醫(yī)雜志，2013，35(11)：70-71．

[25]張衛(wèi)．七種中藥對口腔白色念珠菌的體外抑制作用[D]．石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2015．

[26]徐云輝，黃浩，郭兆霞，等．地膚子抗真菌化學(xué)成分研究[J]．中成藥，2012，34(9)：1726-1729．

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.032

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