內(nèi)皮微粒檢測在慢性阻塞性肺疾病診療中的應(yīng)用

劉　娜 綜述，閆衛(wèi)利 審校

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院　300150)

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·綜述·

內(nèi)皮微粒檢測在慢性阻塞性肺疾病診療中的應(yīng)用

劉娜 綜述，閆衛(wèi)利 審校

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院300150)

內(nèi)皮微粒；慢性阻塞性肺疾病；CD144；CD31；CD62E

血管內(nèi)皮細(xì)胞是襯覆于血管內(nèi)壁的單層扁平細(xì)胞，在保持血管內(nèi)膜完整性和維持血管正常功能方面具有重要作用[1]。微粒(MPs)是細(xì)胞脫落的小囊泡，來源于血小板、紅細(xì)胞、白細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞。它表達(dá)大量的細(xì)胞表面標(biāo)志，富含mRNA，與多種生物學(xué)行為有關(guān)[2]。它包含了前體細(xì)胞特有的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，在大小和組成上與其他亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如凋亡體和外染色體不同，且功能各異。幾乎所有類型的細(xì)胞都能釋放MPs。有研究表明，內(nèi)皮微粒(EMPs)不僅是內(nèi)皮功能紊亂的新的標(biāo)志物，并被認(rèn)為在炎癥、血管損傷、內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。心血管、代謝、肺部疾病患者血液中EMPs水平均升高，而EMPs水平升高反映這些疾病內(nèi)皮損傷嚴(yán)重程度[3]。本文首先回顧MPs的起源，重點探討EMPs與慢性阻塞性肺疾病(COPD)的關(guān)系，總結(jié)血漿EMPs的檢測方法。

1　MPs的起源

MPs存在于血漿中，直徑為0.1～1.0 μm，是富含磷脂的細(xì)胞膜顆粒。1967年，Wolf[4]發(fā)現(xiàn)來自活化血小板膜脫落顆粒，命名為血小板塵埃。1986年，Wagner等[5]在鐮刀形紅細(xì)胞病、遺傳性紅細(xì)胞增多癥患者中相繼發(fā)現(xiàn)了來源于紅細(xì)胞的MPs。1994年，Satta等[6]證實單核細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖刺激下釋放顆粒。1999年，Combes等[7]用腫瘤壞死因子(TNF)-α刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能使其釋放EMPs。隨后就MPs釋放機制的研究表明，細(xì)胞活化過程中，胞內(nèi)鈣離子流增加，磷脂爬行酶激活，翻轉(zhuǎn)酶激活，致使膜磷脂重新分布，導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸由膜內(nèi)層遷移至外層，鈣離子流增加還可引起細(xì)胞收縮和細(xì)胞支架重建，細(xì)胞外形改變、出芽，這些隆起的泡狀物擠壓胞膜并脫落，脫落的細(xì)胞MPs整合了一部分細(xì)胞膜表面蛋白和其他成分，而MPs內(nèi)容物多為核苷酸類如mRNA、小RNA，蛋白水解酶如金屬蛋白酶、凝血活酶等[8]。MPs在細(xì)胞生物功能調(diào)節(jié)方面的作用可概括為MPs與靶細(xì)胞表面的特殊受體結(jié)合，通過細(xì)胞的胞吞過程，將這些小分子物質(zhì)和RNA轉(zhuǎn)移入靶細(xì)胞中。

2　近年研究熱點

EMPs是近年提出的反映內(nèi)皮功能障礙的生物指標(biāo)，表面表達(dá)磷脂酰絲氨酸和內(nèi)皮細(xì)胞特征性的表面抗原，分為血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31、玻連蛋白CD51、鈣連蛋白CD144、黑色素瘤細(xì)胞黏附分子CD146、E選擇蛋白CD62E等5種。

2.1鈣連蛋白CD144鈣連蛋白CD144僅表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，是特異性最強的標(biāo)志物，其他4種EMPs在血小板、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞上也有表達(dá)。鈣連蛋白的脫落，常伴隨中性粒細(xì)胞的遷移以及血管滲透性的改變。鈣連蛋白CD144的升高，不僅表明炎癥的發(fā)生，而內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)也被破壞。

2.2血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31有調(diào)節(jié)血小板功能，參與血管生成，以及T細(xì)胞、B細(xì)胞的激活。有實驗證明血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子由肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放，與過氧化氫或吸煙的刺激有關(guān)[9]。另有研究報道，90% COPD患者和60%吸煙者血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子CD31表達(dá)錨定蛋白V,通過檢測錨定蛋白V，從而反映受損內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

2.3黑色素瘤細(xì)胞黏附分子CD146黑色素瘤細(xì)胞黏附分子CD146，參與內(nèi)皮細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、細(xì)胞遷移、血管生成、免疫應(yīng)答[10]。

2.4E選擇蛋白CD62EE選擇蛋白CD62E在炎癥刺激后數(shù)小時被激活，招募白細(xì)胞至感染部位，反映了炎癥的進(jìn)展程度。E選擇蛋白CD62E在相應(yīng)細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)下有一定水平的表達(dá)，在某些因素的作用下，可發(fā)生上調(diào)或下調(diào)。

2.5玻連蛋白CD51玻連蛋白CD51是整合素的α鏈，也是玻璃粘連蛋白受體的α鏈，在內(nèi)皮細(xì)胞來源特異性方面低于上述4種EMPs[11]，但在白細(xì)胞的歸巢過程中起一定的作用。

3　EMPs與COPD的關(guān)系

3.1COPD的發(fā)病機制和肺功能測定的局限性COPD是一種破壞性的肺部疾病，是以不完全可逆的氣流受限為特征的疾病，氣流受限通常呈進(jìn)行性發(fā)展，并與肺對有害顆?；驓怏w的異常炎性反應(yīng)有關(guān)。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激是引起COPD發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。氧化應(yīng)激不僅直接損傷肺組織，還可通過激活核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶等信號通路上調(diào)炎癥基因表達(dá)，引起肺內(nèi)炎性反應(yīng)，而炎性反應(yīng)又可產(chǎn)生大量活性氧，加重肺氧化損傷，從而促進(jìn)COPD病情的發(fā)生、發(fā)展[12]。氧化應(yīng)激中H2O2增多引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放CD31+、CD144+EMPs[9]，二者升高提示COPD急性加重。而COPD急性加重又進(jìn)一步導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而使二者血漿水平進(jìn)一步升高。現(xiàn)階段診斷和評估COPD病情時,肺功能測定可作為一項金標(biāo)準(zhǔn),能客觀測定氣流阻塞的程度，其中第一秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比(FEVl/FVC)，可檢出輕度氣流受限。第一秒用力呼氣容積(FEV1)占預(yù)計值的百分比(FEV1%預(yù)計值)是中、重度氣流受限的良好指標(biāo)，二者變異性小，易于操作，是目前COPD肺功能檢查的基本項目。FEVl/FVC<70%,且在應(yīng)用支氣管擴張劑后FEV1%預(yù)計值<80%時,可肯定患者有氣流阻塞且不能完全逆轉(zhuǎn)。然而其有兩點局限性：首先，F(xiàn)EV1敏感性并不高。其次，F(xiàn)EV1的降低不能區(qū)分是疾病的頻繁加重還是支氣管的高反應(yīng)性。再次，COPD的臨床表現(xiàn)和放射學(xué)變化多樣，但往往氣流受限的程度用FEV1來評價卻是相同的，導(dǎo)致對COPD病情的評估可能會滯后，因此用于評價COPD的新的生物學(xué)標(biāo)志物有待于發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。

3.2EMPs與COPD穩(wěn)定期、急性加重期、肺功能損傷的關(guān)系有研究報道，與戒煙對照組相比，COPD穩(wěn)定期患者，鈣連蛋白、血小板黏附分子、E選擇蛋白水平顯著升高；COPD加重期患者，E選擇蛋白水平顯著高于非頻繁發(fā)作的COPD穩(wěn)定期患者[13]，表明E選擇蛋白的水平反映了內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的進(jìn)展。COPD加重期，鈣連蛋白、血小板黏附分子和E選擇蛋白水平顯著升高。除此之外，COPD的加重與肺氣腫有關(guān)，而肺氣腫又與肺毛細(xì)血管的損傷密不可分。加重期鈣連蛋白、血小板黏附分子和E選擇蛋白的升高趨勢并不相同，28 d后，鈣連蛋白、血小板黏附分子仍繼續(xù)升高，表明臨床癥狀消失后內(nèi)皮仍處于損傷狀態(tài);E選擇蛋白卻逐漸降低，這與血漿纖維蛋白原的變化很相似。然而，有研究表明，COPD穩(wěn)定期玻連蛋白CD51和E選擇蛋白的升高卻沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，血小板黏附分子升高有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。E選擇蛋白在COPD加重期升高顯著，穩(wěn)定期變化不明顯。

上述兩份研究還探討了EMPs和肺部功能損傷的關(guān)系，結(jié)果表明，血小板黏附分子、E選擇蛋白、鈣連蛋白與FEV1占預(yù)計值的百分比呈負(fù)相關(guān)。Liu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，COPD模型大鼠較健康組CD31+/CD42b-EMPs水平升高，增高的EMPs來源于肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其用力0.3 s呼氣量/用力肺活量則下降，預(yù)示EMPs可作為COPD大鼠肺功能損害嚴(yán)重程度及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損害及凋亡的潛在生物學(xué)指標(biāo)。但增高的EMPs在COPD急性加重期中的具體作用機制尚不明確，可能與其在急性加重期引起肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及損傷和加重炎性反應(yīng)等相關(guān)。

4　EMPs的檢測

如今對EMPs的檢測應(yīng)用最為廣泛的實驗技術(shù)為流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，根據(jù)研究目的加入熒光素標(biāo)記的高特異性抗體結(jié)合EMPs表面特異性抗原，如CD31+、CD144+、CD146+、CD62E+等，但多數(shù)表面抗原不是EMPs所特有表達(dá)的，且不同F(xiàn)CM對EMPs靈敏度不一致，還受波長限制，直徑小于0.3 μm EMPs難以被檢出[15-16]。新式流式細(xì)胞儀可分辨更小的EMPs，檢出EMPs數(shù)更高[17-18]。標(biāo)本的前處理主要是采用離心法去除血細(xì)胞提取EMPs，優(yōu)點是降低了底物干擾，限制了母細(xì)胞釋放新的EMPs，阻止凍融造成的細(xì)胞碎片。二次離心后得到血小板血漿能減少50%～80%的EMPs。高速離心和沖洗將EMPs從血漿中分離出來，去除未結(jié)合的抗體和其他用來檢測EMPs表面抗原的探針類物質(zhì)。值得一提的是，離心方法比如轉(zhuǎn)速、時間、方式都可能影響EMPs的檢測數(shù)量，急切需要建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序來提高檢測的可比性。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)也可用于EMPs的檢測，但應(yīng)用受限，其原理是利用錨連蛋白V與磷脂酰絲氨酸之間的親和力，固定錨連蛋白，捕獲血漿中EMPs進(jìn)行檢測。ELISA測定EMPs相對FCM雖具有對弱抗原敏感性高、不受EMPs大小限制、一次性可完成大量標(biāo)本檢測等優(yōu)點，但非定量，且對體積不能確定，限制了ELISA的應(yīng)用，且與其結(jié)合的抗體性質(zhì)易變、易受可溶性抗原干擾及不能定量等缺點。此外標(biāo)本儲存時間和方式、處理方式、不同檢測方法等均會影響EMPs檢測結(jié)果，這些問題均值得探討[19-22]。

5　小　　結(jié)

本文總結(jié)了EMPs作為一個新的COPD標(biāo)志物在指示疾病進(jìn)展的相關(guān)研究，展望了EMPs的檢測前景，也許通過EMPs亞型的差異能夠重新對COPD的病情進(jìn)行評估。

[1]Sierko E，Sokó M，Wojtukiewicz MZ.Endothelial microparticles(EMP)in physiology and pathology[J].Postepy Hig Med Dosw，2015，69(1)：925-932.

[2]辛?xí)悦簦⒘Ｔ谘ㄐ约膊≈械淖饔肹J]．中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2014，37(3)：166-169．

[3]Takahashi T,Kubo H.The role of microparticles in chronic obstructive pulmonary disease[J].Int J Chron Obstruct Pulmon Dis,2014,9(1):303-314.

[4]Wolf P.The Nature and significance of platelet products in human plasma[J].Br J Haematol,1967,13(3):269-288.

[5]Wagner GM,Chiu DT,Yee MC,et al.Red cell vesiculation：A common membrane physiologic event[J].J Lab Clin Med,1986,108(4):315-324.

[6]Satta N,Toti F,Feugeas O,et al.Monocyte vesiculation is a possible mechanism for dissemination of membrane-associated procoagulant activities and adhesion molecules after stimulation by lipopolysaccharide[J].J Immunol,1994,153(7):3245-3255.

[7]Combes V,Simon AC,Grau GE,et al.In vitro Generation of endothelial microparticles and possible prothrombotic activity in patients with lupus anticoagulant[J].J Clin Invest,1999,104(1):93-102.

[8]Martinez MC,Tual-Chalot S,Leonetti D,et al.Microparticles:targets and tools in cardiovascular disease[J].Trends Pharmacol Sci,2011,32(11):659-665.

[9]Cocucci E,Racchetti G,Meldolesi J.Shedding microvesicles:artefacts no more[J].Trends Cell Biol,2009,19(2):43-51.

[10]Takahashi T,Kobayashi S,Fujino N,et al.Differences in the released endothelial microparticle subtypes between human pulmonary microvascular endothelial cells and aortic endothelial cells in vitro[J].Exp Lung Res,2013,39(4/5):155-161.

[11]Conway D,Schwartz MA.Lessons from the endothelial junctional mechanosensory complex[J].F1000 Biol Rep,2012,4(1):1-6.

[12]Wang Z,Yan X.CD146,a multi-functional molecule beyond adhesion[J].Cancer Lett,2013,330(2):150-162.

[13]Jimenez JJ,Jy W,Mauro LM,et al.Endothelial cells release phenotypically and quantitatively distinct microparticles in activation and apoptosis[J].Thromb Res,2003,109(4):175-180.

[14]Liu H,Ding L,Zhang Y,et al.Circulating endothelial microparticles involved in lung function decline in a rat exposed in cigarette smoke maybe from apoptotic pulmonary capillary endothelial cells[J].J Thorac Dis,2014,6(6):649-655.

[15]Thomashow MA,Shimbo D,Parikh MA,et al.Endothelial microparticles in mild chronic obstructive pulmonary disease and emphysema：The multi-ethnic study of atherosclerosis chronic obstructive pulmonary disease study[J].Am J Respir Crit Care Med,2013,188(1):60-68.

[16]Takahashi T,Kobayashi S,Fujino N,et al.Annual FEV1 changes and numbers of circulating endothelial microparticles in patients with COPD:a prospective study[J].BMJ Open,2014,4(3):4571-4588.

[17]Barnes PJ.Cellular and molecular mechanisms of chronic obstructive pulmonary disease[J].Clin Chest Med,2014,35(1):71-86.

[18]Takahashi T,Kobayashi S,Fujino N,et al.Increased circulating endothelial microparticles in COPD patients:A potential biomarker for COPD exacerbation susceptibility[J].Thorax,2012,67(12):1067-1074.

[19]Takahashi T,Suzuki S,Kubo H,et al.Impaired endothelial progenitor cell mobilization and colony-forming capacity in chronic obstructive pulmonary disease[J].Respirology,2011,16(4):680-687.

[20]Chandler WL,Yeung W,Tait JF.A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer[J].J Thromb Haemost,2011,9(6):1216-1224.

[21]梁瀟，王榮麗．內(nèi)皮細(xì)胞微粒在慢性阻塞性肺疾病中的研究進(jìn)展[J]．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2015，31(24)：3750-3752．

[22]Shantsila E,Montoro-García S,Gallego P,et al.Circulating microparticles:challenges and perspectives of flow cytometric assessment[J].Thrombosis and haemostasis,2014,111(6):1009-1014.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.17.031

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1673-4130(2016)17-2437-03

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