Gas6在胎盤或蛻膜組織中的表達(dá)及其與子癇的相關(guān)性

李綺霞，何玉蘭，金玉

(廣州市從化區(qū)南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510900)

Gas6在胎盤或蛻膜組織中的表達(dá)及其與子癇的相關(guān)性

李綺霞，何玉蘭，金玉

(廣州市從化區(qū)南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510900)

目的 探討胎盤或蛻膜組織中生長阻滯特異性蛋白6(Gas6)的表達(dá)水平及其與子癇前期的相關(guān)性。方法選取2012年6月至2015年4月本院婦產(chǎn)科收治的42例重度子癇前期剖宮產(chǎn)分娩孕婦作為子癇組，42例同期正常晚期妊娠剖宮產(chǎn)孕婦作為對照組，采用免疫組化法分別檢測兩組受檢者胎盤、蛻膜組織中的Gas6蛋白表達(dá)水平，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測胎盤組織Gas6 mRNA的表達(dá)，并分析Gas6 mRNA與重度子癇前期患者相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果子癇組患者的收縮壓、舒張壓和血肌酐(Scr)分別為(163.2±16.4)mmHg、(101.4±9.5)mmHg、(60.4±13.2)μmol/L，均明顯高于對照組的(119.5±8.3)mmHg、(71.6±8.3)mmHg和(41.0±11.9)μmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；子癇組患者的白蛋白(30.4±3.9)g/L、血小板(167.3±54.1)×109/L水平顯著的低于對照組的白蛋白(35.1±4.2)g/L、血小板(256.0±83.7)×109/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；子癇組患者胎盤、蛻膜組織中Gas6蛋白的表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)水平(0.61±0.23)顯著高于對照組的(0.34±0.18)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)水平與患者的收縮壓、舒張壓、Scr呈顯著的正相關(guān)(r=0.417、0.382、0.405，P＜0.05)；子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)水平與白蛋白、血小板水平呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.326、-0.314，P＜0.05)。結(jié)論子癇前期患者胎盤或蛻膜組織中Gas6高表達(dá)，并且與子癇發(fā)病有關(guān)。

胎盤；蛻膜組織；生長阻滯特異性蛋白6；子癇前期；相關(guān)性

懷孕前血壓正常的孕婦在妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿，稱子癇前期，或稱為先兆子癇，是妊娠期高血壓疾病的五種狀況之一，為妊娠期特發(fā)疾病，可影響機(jī)體各器官系統(tǒng)，發(fā)病率約占全部妊娠的3.9%。子癇前期患者血壓控制不佳可引起嚴(yán)重的子癇發(fā)作，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生[1]。

子癇前期的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，妊娠狀態(tài)中循環(huán)血容量的增加、動(dòng)脈血管內(nèi)皮的損傷以及胎盤界面形成不良，或者胎盤母體面的局部炎癥反應(yīng)等，均可能參與到了子癇前期的發(fā)生發(fā)展過程[2]。生長阻滯特異性蛋白6(Gas6)是一種生長阻滯特異性基因編碼的分泌性蛋白，其生物學(xué)功能與血管的炎癥、免疫以及脂蛋白的代謝有關(guān)[3-4]。本次研究重在探討胎盤或蛻膜組織中Gas6的表達(dá)水平及與子癇前期的發(fā)病關(guān)系，進(jìn)而進(jìn)一步揭示子癇前期的發(fā)病機(jī)制，并為患者的臨床預(yù)后提供新的生化指標(biāo)參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年6月至2015年4月收治的42例重度子癇前期在本院產(chǎn)科實(shí)施剖宮產(chǎn)分娩孕婦作為子癇組，同期正常孕晚期妊娠的在本院實(shí)施剖宮產(chǎn)的42例婦女作為對照組。子癇組孕婦年齡26～38歲，平均(31.6±3.8)歲，孕次(2.3±1.2)次，產(chǎn)次(1.4±0.4)次。對照組孕婦年齡24～36歲，平均(31.2±3.4)歲，孕次(2.2±1.3)次，產(chǎn)次(1.3±0.5)次。兩組孕婦的年齡、孕次、產(chǎn)次構(gòu)成等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)重度子癇前期婦女的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)樂杰主編《婦產(chǎn)科學(xué)》第七版中的標(biāo)準(zhǔn)；(2)實(shí)驗(yàn)室診斷滿足：收縮壓/舒張壓≥160/110 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa)、尿蛋白≥2.0/24 h；(3)對照組孕婦來源于同期正常孕晚期妊娠的剖宮產(chǎn)的婦女；(4)本研究取得研究對象的知情同意并簽訂協(xié)議書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)既往具有高血壓、糖尿病、慢性肝腎功能損害的患者；(2)具有精神病史的患者；(3)合并免疫系統(tǒng)疾病或正在使用糖皮質(zhì)激素、免疫制劑的患者；(4)合并其他妊娠合并癥的患者。

1.3 Gas6蛋白的免疫組化 組織采用石蠟包埋，切片機(jī)切取組織，厚度5 mm，用多聚賴氨酸處理。在脫蠟之前，將切片置于60℃恒溫箱中烘烤60 min。將切片用二甲苯浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min。水化后進(jìn)行抗原修復(fù)，3%H2O2一甲醇溶液處理切片15 min，加入一抗Fascin鼠單抗100 L，37℃，濕盒孵育1 h。加入增強(qiáng)劑50 L，室溫濕盒孵育20 min。加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗50 L，室溫37℃，孵育30 min。每張片子加2滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察。FHS-2R光學(xué)顯微鏡購自羅氏檢測公司，相關(guān)配套試劑購自南京凱基生物科技有限公司。

1.4 RT-PCR 取凍存已裂解的組織沖洗液，按照10 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心分離，每1 mL的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 mL的氯仿，進(jìn)行裂解操作，4℃冰上采用無酶的RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA。混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，37℃水浴60 min，室溫放置5 min使其完全溶解，使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為模版，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達(dá)20 μL，上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃2 min、93℃1 min、55℃2 min，共40個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)：上游3'-5'，ATGCCGCCTCGCTGAA，5'-3'，GGCAGCGAGGCGGCTA，引物購自上海華生科技有限公司。

1.5 觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 對比兩組胎盤、蛻膜組織中Gas6蛋白、mRNA、收縮壓、舒張壓、D-二聚體、血肌酐(Scr)、血漿白蛋白、血小板計(jì)數(shù)的差異。免疫組化結(jié)果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：Gas6蛋白在胎盤組織中主要定位于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在蛻膜組織中主要定位細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，呈黃色、棕黃色、褐色表達(dá)。(1)根據(jù)著色強(qiáng)度：0分為無色、1分為淡黃色、2分為棕黃色、3分為褐色、黑色；(2)根據(jù)陽性細(xì)胞比例：陽性細(xì)胞數(shù)目所占比例＜10%為1分、陽性細(xì)胞所占比例11%～50%為2分、陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分、陽性細(xì)胞數(shù)所占比例＞75%為4分，(-)為總分＜3分，陰性表達(dá)；(+)為3～5分，弱陽性表達(dá)；(++)為6～9分，中陽性表達(dá)；(+++)為＞9分，強(qiáng)陽性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析在SAS9.3軟件包中處理，正態(tài)分布的計(jì)量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較采用t假設(shè)檢驗(yàn)；等級計(jì)數(shù)資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析法采用Pearson線性相關(guān)法；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 子癇組和對照組的相關(guān)臨床指標(biāo)比較 子癇組患者的收縮壓、舒張壓、Scr水平顯著的高于對照組患者(P＜0.05)，子癇組患者的白蛋白、血小板水平顯著的低于對照組患者(P＜0.05)；兩組間D-二聚體差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 子癇組和對照組的相關(guān)臨床指標(biāo)比較(±s)

表1 子癇組和對照組的相關(guān)臨床指標(biāo)比較(±s)

組別子癇組對照組t值P值例數(shù)42 42收縮壓（mmHg）163.2±16.4 119.5±8.3 15.408＜0.001舒張壓(mmHg) 101.4±9.5 71.6±8.3 15.309＜0.001 D-二聚體(mg/L) 2.7±1.4 2.3±1.1 1.456 0.094 Scr(umol/L) 60.4±13.2 41.0±11.9 7.074＜0.001白蛋白(g/L) 30.4±3.9 35.1±4.2 5.314＜0.001血小板(109/L) 167.3±54.1 256.0±83.7 5.797＜0.001

2.2 胎盤和蛻膜組織中Gas6蛋白的表達(dá)情況 子癇組患者胎盤、蛻膜組織中Gas6蛋白的表達(dá)水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，見表2、3和圖1。

表2 子癇組和對照組蛻膜組織中Gas6蛋白的表達(dá)水平[例（%）]

表3 子癇組和對照組胎盤組織中Gas6蛋白的表達(dá)水平[例（%）]

圖1 免疫組化結(jié)果

2.3 胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)情況 子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，見表4，圖2。

表4 兩組胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)水平(±s，吸光度值)

表4 兩組胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)水平(±s，吸光度值)

組別 例數(shù)Gas6 mRNA t值P值子癇組對照組42 42 0.61±0.23 0.34±0.18 5.991＜0.001

圖2 子癇組和對照組胎盤組織中Gas6 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢查結(jié)果電泳圖

2.4 相關(guān)性分析法 子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)水平與患者的收縮壓、舒張壓、Scr呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)；子癇組患者胎盤組織中Gas6 mRNA的表達(dá)水平與白蛋白、血小板水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，見表5。

表5 相關(guān)性分析法

3 討 論

輕度子癇前期的孕產(chǎn)婦妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg伴蛋白尿≥0.3 g/24 h或隨機(jī)尿蛋白≥+，而當(dāng)血壓、血肌酐值、蛋白尿以及血清轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)進(jìn)一步惡化時(shí)，患者進(jìn)展為子癇的概率可明顯增加5%～10%[5-6]。相關(guān)妊娠期高血壓以及子癇前期的病因的探討認(rèn)為，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異常、免疫調(diào)節(jié)功能異常、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、遺傳因素和營養(yǎng)因素等方面均可獨(dú)立促進(jìn)子癇前期的發(fā)生，滋養(yǎng)細(xì)胞侵入螺旋小動(dòng)脈不全，子宮肌層螺旋小動(dòng)脈未發(fā)生重鑄，異常狹窄的螺旋動(dòng)脈使得胎盤灌注減少和缺氧，最終導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生[7]。另外，絨毛膜細(xì)胞間質(zhì)的纖維化以及血管再生的障礙，均可影響到胎盤血管的痙攣，進(jìn)而促進(jìn)血壓的波動(dòng)或者收縮壓的升高。美國國立衛(wèi)生院在分析鼠成纖維細(xì)胞在高血流灌注下的生物學(xué)功能改變中發(fā)現(xiàn)，Gas6作為調(diào)節(jié)局部免疫反應(yīng)、血管的再生以及炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，其對于下游信號通路acs-6/axl的激活以及Notch2/cyc/bcl調(diào)節(jié)，可以影響到血小板指數(shù)以及血小板活性達(dá)標(biāo)率[8-9]，而Gas-6與絡(luò)氨酸家族受體的結(jié)合，可進(jìn)一步促進(jìn)絨毛膜間質(zhì)細(xì)胞的纖維化，并影響胎盤血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定。本次研究重在探討Gas-6在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)差異，進(jìn)而揭示Gas-6在妊娠期高血壓疾病中的生物學(xué)功能。

血小板、血清白蛋白、血肌酐以及動(dòng)脈血壓均為評估子癇前期患者病情程度的重要指標(biāo)，子癇組和對照組患者動(dòng)脈收縮壓以及舒張壓均明顯升高，血小板相對降低，不足250×109/L，其中子癇組患者的收縮壓可達(dá)160 mmHg以上，而舒張壓可達(dá)100 mmHg以上，血小板的上升提示患者體內(nèi)的凝血功能存在一定的激活與紊亂，血小板活性的升高可促進(jìn)血栓性疾病的發(fā)生，加劇在收縮壓大于160 mmHg情況下發(fā)生子癇的風(fēng)險(xiǎn)。通過免疫組化分析可見，在子癇孕產(chǎn)婦胎膜以及胎盤組織中，Gas-6的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，Gas-6的表達(dá)主要位于絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)，定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，而細(xì)胞核周邊以及細(xì)胞間質(zhì)中的Gas-6表達(dá)降低。胎膜以及胎盤組織中的Gas-6蛋白水平的高表達(dá)提示其與妊娠期高血壓或者子癇前期的發(fā)生有關(guān)，有研究表明在妊娠32～37周內(nèi)發(fā)生子癇的孕產(chǎn)婦，其產(chǎn)后胎盤的免疫組化分析可見Gas-6表達(dá)陽性率達(dá)45%以上，明顯高于未發(fā)生子癇的孕產(chǎn)婦[10-11]，同時(shí)在胎盤血管再生不良以及部位間質(zhì)纖維化較為明顯的孕產(chǎn)婦胎膜中，Gas-6的高表達(dá)與孕產(chǎn)婦體內(nèi)血小板性血栓的形成以及粥樣斑塊的纖維化存在一定的關(guān)聯(lián)[12]。同時(shí)，Gas6 mRNA的表達(dá)與蛋白水平的表達(dá)具有一致性，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FXN-2的調(diào)節(jié)下，Gas6 mRNA翻譯表達(dá)為Gas6蛋白，其對于絡(luò)氨酸末端的羥基化可促進(jìn)胎膜或者胎盤組織的間質(zhì)纖維化，并可抑制血管內(nèi)皮生長因子VEGF-2的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致胎盤血管的再生性障礙，提高血流灌注的不穩(wěn)定性。Gas6 mRNA以及蛋白高表達(dá)的孕產(chǎn)婦，其體內(nèi)D-二聚體相對較高，而血小板相對較低，特別是血小板可下降至150×109/L左右，而D-二聚體亦大于2.5 mg/L，提示纖溶亢進(jìn)以及凝血機(jī)制的異?？赡苁羌觿as6對子癇患者影響的重要因素之一。

子癇前期患者胎膜或者胎盤組織中的Gas6蛋白水平以及基因水平的高表達(dá)，與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生具有顯著的關(guān)聯(lián)，Gas6的升高可能通過調(diào)節(jié)胎盤血管的形成、促凝機(jī)制以及影響絨毛膜間質(zhì)細(xì)胞的纖維化，進(jìn)而影響子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

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Expression of Gas6 in placenta or decidual tissue and its relationship with preeclampsia.

LI Qi-xia,HE Yu-lan,JIN Yu.Department of Obstetrics and Gynecology,the Fifth Affiliated Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510900,Guangdong,CHINA

Objective To investigate the expression of growth arrest specific protein 6(Gas6)in placenta or decidual tissue and its relationship with the pathogenesis of preeclampsia.MethodsFrom June 2012 to April 2015,42 pregnant women of severe preeclampsia undergoing cesarean delivery were selected as preeclampsia group,and 42 normal pregnant women undergoing cesarean section were chosen as the control group.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Gas6 protein in placenta or decidual tissue,and reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect Gas6 mRNA expression in placental tissue.The relationships of Gas6 mRNA with severe preeclampsia related indicators were analyzed.ResultsThe systolic blood pressure,diastolic blood pressure,serum creatinine(Scr)in preeclampsia group were significantly higher than those in the control group,(163.2±16.4)mmHg vs (119.5±8.3)mmHg,(101.4±9.5)mmHg vs(71.6±8.3)mmHg,(60.4±13.2)μmol/L vs(41.0±11.9)μmol/L,P＜0.05.The levels of albumin,platelet in preeclampsia group were significantly lower than those in the control group,(30.4±3.9)g/L vs(35.1±4.2)g/L,(167.3±54.1)×109/L vs(256.0±83.7)×109/L,P＜0.05.The expression intensity of Gas6 protein in placenta or decidual tissue was significantly higher in preeclampsia group than control group(P＜0.05).The Gas6 mRNA expression level in placenta was significantly higher in preeclampsia group than control group of(0.61±0.23)vs(0.34± 0.18),P＜0.05.The expression levels of Gas6 mRNA in placenta in preeclampsia group showed a significant positive correlation with systolic blood pressure,diastolic blood pressure,Scr(r=0.417,0.382,0.405,P＜0.05),but a significant negative correlation with albumin,platelet levels(r=-0.326,-0.314,P＜0.05).ConclusionPreeclampsia or placental decidua tissue Gas6 expression and the pathogenesis of preeclampsia.

Placenta;Decidual tissue;Growth arrest specific protein 6;Preeclampsia;Correlation

R714.24+5

A

1003—6350（2016）09—1402—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.09.010

2016-01-06)

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（編號：20141A041010）

李綺霞。E-mail：liqixia1979@sina.com