血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)的關(guān)系

何淑貞，蒲育棟，曹金如，周麗霞，陳壽云，周玉玲

(東莞市第三人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東 東莞 523326)

血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)的關(guān)系

何淑貞，蒲育棟，曹金如，周麗霞，陳壽云，周玉玲

(東莞市第三人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，廣東 東莞 523326)

目的 探討血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1(SGK1)rs1743967以及血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶2 (SGK2)rs743998與自然流產(chǎn)之間的關(guān)系。方法采用病例對照研究方法，選取2013年1月至2013年12月我院64例自然流產(chǎn)患者作為自然流產(chǎn)組，同期40例人工流產(chǎn)患者作為對照組，利用3730XL測序儀檢測SGK1 rs1743967和SGK2 rs743998基因多態(tài)性，χ2檢驗(yàn)比較病例組與對照組基因型及等位基因頻率分布。結(jié)果①SGK1 rs1743967對照組基因型為GG+GT，而自然流產(chǎn)組以GG+GT為主，其次是TT，兩組基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對照組等位基因G和T頻率各占50.0%；自然流產(chǎn)組G占35.2%，T占64.8%，兩組等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。②SGK2 rs743998對照組基因型以CT+TT為主，其次是CC，而自然流產(chǎn)組以CC為主，其次是CT+TT，兩組基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對照組等位基因C和T頻率各占50.0%；自然流產(chǎn)組C占83.6%，T占16.4%。兩組等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論SGK1 rs1743967和SGK2 rs743998與自然流產(chǎn)有關(guān)，但相關(guān)機(jī)制有待今后進(jìn)一步研究。

血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶；自然流產(chǎn)；基因多態(tài)性；相關(guān)性

自然流產(chǎn)是育齡婦女常見的妊娠期疾病，發(fā)生率為10%～15%[1]。孕婦黃體功能不全、甲狀腺功能低下、胚胎染色體異常、免疫功能異常等是發(fā)生早期自然流產(chǎn)的常見原因[2]。Solker等[3]發(fā)現(xiàn)在患有原因不明性不孕癥婦女的子宮內(nèi)膜中，血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)激酶1 (SGK1)的含量較正常孕婦高，而習(xí)慣性流產(chǎn)者的SGK1含量則比正常孕婦低。本研究旨在探討SGK基因多態(tài)性與自然流產(chǎn)的關(guān)系，進(jìn)一步闡明自然流產(chǎn)的分子生物學(xué)機(jī)制，為尋找自然流產(chǎn)的病因提供有利的借鑒依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2013年12月期間在我院就診的自然流產(chǎn)患者作為自然流產(chǎn)組，年齡19～40歲，平均(29.6±4.3)歲。納入對象：無染色體因素、解剖因素、感染因素、內(nèi)分泌因素、抗磷脂綜合征及血管栓塞性疾病等。所有研究對象均未生育過小孩。選擇同期進(jìn)行人工流產(chǎn)的患者作為對照組，年齡19～36歲，平均(28.0±4.5)歲。兩組間的年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.889，P=0.062)。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集和抽提 收集所有對象的一般臨床資料，同時采集2 ml EDTA抗凝血，-80℃冰箱保存，用于提取DNA。按DNA提取試劑盒(Axygen)說明書要求進(jìn)行操作，從全血標(biāo)本中提取基因組DNA。

1.2.2 主要試劑和儀器 外周血基因組DNA抽提試劑盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker均購自上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司，引物由該公司合成。PRISM 3730序列分析儀購自美國ABI公司。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 通過NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫獲得SGK1基因rs1743967 G/T核苷酸序列，并用Primer5.0設(shè)計(jì)引物序列如下：上游引物AGCCGGCATCAATCTTTAAT，下游引物GCAAAAGCACCC TGTAGGC，擴(kuò)增產(chǎn)物長度是700 bp。通過NCBI基因序列數(shù)據(jù)庫獲得SGK2基因rs743998 C/T核苷酸序列，并用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物序列如下：上游引物GCTCTGTTGCCCAAGAGTCTGTTAG，下游引物AATGTCAACAACTTTCTGGTAATTCTGGTG，擴(kuò)增產(chǎn)物長度是1 583 bp。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 采用20μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，含1μL模板DNA，上下游引物各1μL，2μL dNTP，0.2μL Taq聚合酶，2μL反應(yīng)緩沖液，0.6μL Mg2+，12.2μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件：先在95℃預(yù)變性2 min，94℃ 30 s，59℃ (rs1743967)1 min 30 s，53℃(rs743998)1 min 30 s，72℃1 min 30 s，40個循環(huán)后72℃延伸10 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司3730XL測序儀測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)輸入SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用頻數(shù)和構(gòu)成比表示。Hardy-Weinberg平衡用于檢測各基因型分布，χ2檢驗(yàn)用于比較自然流產(chǎn)組與對照組基因型及等位基因頻率，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SGK1 rs1743967基因型及等位基因分布對照組基因型為GG+GT，而自然流產(chǎn)組以GG+GT為主，其次是TT，兩組基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對照組等位基因G和T頻率各占50.0%；自然流產(chǎn)組G占35.2%，T占64.8%，兩組等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 SGK1-rs1743967與自然流產(chǎn)的關(guān)系[例(%)]

2.2 SGK2 rs743998基因型及等位基因分布 對照組基因型以CT+TT為主，其次是CC，而自然流產(chǎn)組以CC為主，其次是CT+TT，兩組基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對照組等位基因C和T頻率各占50%。自然流產(chǎn)組C占83.6%，T占16.4%。兩組等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 SGK2-rs743998與自然流產(chǎn)的關(guān)系[例（%）]

3 討 論

血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶(Serum and glucocorticoid-regulated protein kinase，SGK)是一種新發(fā)現(xiàn)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，基因全長2.4 kb，在各種哺乳動物組織和細(xì)胞系中均有表達(dá)。它有SGKl、SGK2和SGK3三種異構(gòu)酶，三種異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)同源性高達(dá)80%[4]。近年來研究表明，血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶可能是多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞磷酸化級聯(lián)反應(yīng)的一個功能性交匯點(diǎn)，可被多種應(yīng)激因素誘導(dǎo)激活，在調(diào)節(jié)離子通道、細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活和凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用[5-6]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SGK1 rs1743967對照組基因型為GG+GT，而自然流產(chǎn)組以GG+GT為主，其次是TT，兩組基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步由OR值1.778可知，TT基因型是自然流產(chǎn)發(fā)生的危險因素。而等位基因也證實(shí)，當(dāng)G突變?yōu)門時，增加了患者發(fā)生流產(chǎn)的風(fēng)險，所以T等位基因是自然流產(chǎn)發(fā)生的危險因素。SGK2 rs743998對照組基因型和自然流產(chǎn)組基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步由OR值0.060可知，CT+TT基因型是保護(hù)性因素，當(dāng)CT+TT轉(zhuǎn)變成CC基因型越多，發(fā)生自然流產(chǎn)的風(fēng)險越大。而等位基因T是保護(hù)性因素，當(dāng)T突變?yōu)镃，則增加自然流產(chǎn)的風(fēng)險。

由于SGK1和SGK2的等位基因發(fā)生突變，考慮可能使上皮鈉通道(ENaC)表達(dá)上調(diào)，并且使泛素連接酶(Nedd4-2)表達(dá)下調(diào)，從而引起一系列生理反應(yīng)，導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生。Salker等[3]的研究也表明，SGK1能夠防止子宮內(nèi)膜間質(zhì)成纖維細(xì)胞的氧化細(xì)胞死亡，所以蛻膜SGK1表達(dá)減少將導(dǎo)致流產(chǎn)。

綜上所述，SGK1 rs1743967和SGK2 rs743998與自然流產(chǎn)存在著一定的關(guān)聯(lián)，但具體的機(jī)制如何有待今后進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)，以期為更好地研究自然流產(chǎn)的相關(guān)機(jī)制提供有利的借鑒依據(jù)。

[1]劉玉昆,劉穎琳,杜濤,等.早期妊娠自然流產(chǎn)患者的超聲表現(xiàn)與絨毛染色體核型分析[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2013,34(1):94-98.

[2]謝幸,茍文麗.婦產(chǎn)科學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:49.

[3]Salker MS,MChristian,Steel JH,et al.Deregulation of the serum and glucocorticoid-inducible kinase SGK1 in the endometrium causes reproductive failure[J].NATURE MEDICINE,2011,17(11):1509-1513.

[4]孫婷婷,倪鑫.血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的蛋白激酶[J].生命的化學(xué), 2007,27(2):133-135.

[5]包慶,趙勇,閏郡琴,等.分子開關(guān)蛋白激酶在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜組織中的表達(dá)[J].中國基層醫(yī)藥,2014,21(13):1947-1949.

[6]許海.血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶3在乳腺癌干細(xì)胞中的表達(dá)[J].中國組織工程研究,2013,17(40):7061-7067.

Association of SGK gene polymorphism with spontaneous abortion.

HE Shu-zhen,PU Yu-dong,CAO Jin-ru,ZHOU Li-xia,CHEN Shou-yun,ZHOU Yu-ling.Prenatal Diagnosis Center,the Third People's Hospital of Dongguan City, Dongguan 523326,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the association of serum and glucocorticoid-regulated protein kinases 1(SGK1) and SGK2 polymorphisms(rs1743967 for SGK1 and rs743998 for SGK2)with spontaneous abortion.MethodsSixty-four cases of spontaneous abortion,who enrolled into our hospital from January 2013 to December 2013,were selected as the spontaneous abortion group,and 40 cases of artificial abortion were selected as a control group for the same period. Polymorphisms of rs1743967 and rs743998 were determined through 3730XL sequencer.genotype and allele frequency distribution of the case group and the control group were compared with χ2test.Results①rs1743967 genotype of SGK1 in the control group were GG+GT,while rs1743967 genotype of SGK1 in the spontaneous abortion group were mainly GG+ GT,followed by TT.Control group and spontaneous abortion group had a statistically significant difference(P＜0.05).Allele frequency of G and T in the control group was equally 50.0%,while allele frequency of G and T in spontaneous abortion group were respectively 35.2%and 64.8%,and allele frequency distribution has a statistically significant difference between control group and spontaneous abortion group(P＜0.05).②rs743998 genotype of SGK2 in control group was mainly CT+ TT,followed by the CC,while spontaneous abortion group was mainly CC,followed by CT+TT,and genotype of the two groups have a statistically significant difference(P＜0.05).Allele frequency of C and T in control group was equally 50.0%, while allele frequency of C and T in spontaneous abortion group was respectively 83.6%and 16.4%.Allele frequency distribution of rs743998 had a statistically significant difference between control group and spontaneous abortion group(P＜0.05).ConclusionSGK1 and SGK2 polymorphisms(rs1743967 for SGK1 and rs743998 for SGK2)have the correlation with spontaneous abortion.However,the mechanisms have yet to be studied in detail.

Serum and glucocorticoid-regulated protein kinases(SGK);Spontaneous abortion;Gene polymorphism;Correlation

R714.21

A

1003—6350（2016）09—1393—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.09.006

2016-01-05)

廣東省科技廳社會發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號：2012B032000015）

周玉玲。E-mail：zhouyuling88@163.com