心力衰竭家兔心肌細(xì)胞中RIP2蛋白表達(dá)異常研究

張艷，武欣迎，王澈，包明威，楊波

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

·論 著·

心力衰竭家兔心肌細(xì)胞中RIP2蛋白表達(dá)異常研究

張艷，武欣迎，王澈，包明威，楊波

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

目的 研究家兔心肌細(xì)胞中受體相互作用蛋白2(RIP2)在容量負(fù)荷聯(lián)合壓力負(fù)荷產(chǎn)生的心力衰竭(HF)中的表達(dá)變化。方法20只新西蘭大耳白兔使用隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組(Sham組，n=10)和心力衰竭組(HF組，n=10)。Sham組僅行假手術(shù)，HF組經(jīng)頸動(dòng)脈刺破主動(dòng)脈瓣增加心臟容量負(fù)荷，2周后縮窄腹主動(dòng)脈增加心臟壓力負(fù)荷。2個(gè)月造模結(jié)束后家兔均行心臟超聲檢測(cè)心臟結(jié)構(gòu)及心功能，稱(chēng)量體重(BW)、心臟重量(HW)及肺臟重量(LW)，左室游離壁組織做成石蠟切片后行HE及膠原PSR染色，RIP2蛋白免疫組化染色。結(jié)果與Sham組比較，HF組家兔心臟室壁厚度增加[HW/BW：(2.25±0.31)vs(4.06±0.59)]，心腔擴(kuò)大[LVEDD：(1.12±0.09)cm vs(1.72±0.21)cm]，心功能減低[EF：(72.34±6.89)%vs(40.75±7.92)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，免疫組化中RIP2在心肌細(xì)胞內(nèi)的褐色顆粒減少。結(jié)論心力衰竭家兔心肌細(xì)胞中RIP2蛋白表達(dá)減少。

家兔；心力衰竭；心肌細(xì)胞；RIP2；心臟重構(gòu)

心力衰竭(Heart failure，HF)簡(jiǎn)稱(chēng)為心衰，是指心肌的舒張和收縮功能障礙而導(dǎo)致泵血能力降低，是臨床上心肌肥厚、心肌梗死、心肌炎、高血壓等多種心臟疾病的最終發(fā)展歸宿[1]。生命科學(xué)研究的進(jìn)展和新技術(shù)的應(yīng)用，使心血管疾病的診治取得了巨大的進(jìn)步，但是高血壓、心肌肥厚和心肌梗死后的心力衰竭仍是這些患者住院率和死亡率居高不下的主要因素[2]。目前已明確，心臟重構(gòu)是導(dǎo)致心力衰竭發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一。心臟重構(gòu)是臨床上高血壓、缺血性心臟病、瓣膜病等心血管疾病引起的心臟重要病理改變，由一系列復(fù)雜的分子和細(xì)胞機(jī)制導(dǎo)致的心肌結(jié)構(gòu)、功能和表型的變化，包括心肌細(xì)胞的肥大、凋亡，胚胎基因和蛋白的再表達(dá)，以及心肌細(xì)胞外基質(zhì)組成和量的變化[3]。因此，研究心臟重構(gòu)的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)及其調(diào)控機(jī)制具有非常重要的理論和臨床意義。

受體相互作用蛋白2(Receptor interacting protein 2，RIP2)也稱(chēng)為Rick、Cardiak、CCK2或者CARD3，是一種絲氨酸蘇氨酸激酶，分子結(jié)構(gòu)包括N端的激酶域、中間的調(diào)節(jié)域及C端的caspase募集域(Caspase recruitment domain，CARD)。RIP2的激酶域是保守的蛋白激酶類(lèi)型子域，由它在47位點(diǎn)的賴(lài)氨酸可以預(yù)測(cè)此區(qū)域是用來(lái)綁定ATP的結(jié)構(gòu)域，從而在磷酸化反應(yīng)中激酶域能夠接受質(zhì)子而改變其活性。在體外實(shí)驗(yàn)中能影響RIP2催化活性的是位于176位點(diǎn)的色氨酸殘基，此位點(diǎn)為自磷酸化位點(diǎn)[4-5]。

RIP2的主要功能是參與了天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，有研究顯示在心肌缺血時(shí)，RIP2能加重心功能的惡化。而RIP2在心力衰竭中的作用報(bào)道較少，有鑒于此，我們?cè)噲D進(jìn)一步探索RIP2與心力衰竭的關(guān)系；探討RIP2在引起心力衰竭的常見(jiàn)原因-壓力負(fù)荷及容量負(fù)荷應(yīng)激狀態(tài)下是否有蛋白表達(dá)水平的改變，從而參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 選用生長(zhǎng)2個(gè)月齡左右的健康新西蘭大耳白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重約2.5 kg，不分雌雄，放入單籠中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，光照為黑白交替各12 h。家兔共20只，分為對(duì)照組和心衰組各10只。

1.2 造模程序 對(duì)照組僅行假手術(shù)，心衰組實(shí)施刺破主動(dòng)脈瓣增加心臟前負(fù)荷的主動(dòng)脈瓣反流術(shù)及2周后增加心臟后負(fù)荷的腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)[6]。主動(dòng)脈瓣反流術(shù)為分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，從頸總動(dòng)脈處插入壓力檢測(cè)裝置，用導(dǎo)絲導(dǎo)管刺破主動(dòng)脈瓣，檢測(cè)壓力變化以確定手術(shù)成功；腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)為開(kāi)腹后分離腹主動(dòng)脈，在腹主動(dòng)脈分出腎動(dòng)脈的分叉處之上將腹主動(dòng)脈與4F鞘管一起結(jié)扎后抽離鞘管關(guān)腹。

1.3 檢測(cè)分析 術(shù)后2個(gè)月時(shí)將所有家兔麻醉后胸部備皮，用B超檢查心臟結(jié)構(gòu)及心功能，稱(chēng)量體重后取出心臟放入10%高鉀溶液中，使心臟停跳在舒張期，冰生理鹽水沖洗蘸干后稱(chēng)量，計(jì)算心臟體重比值；將家兔肺臟取出蘸干后稱(chēng)重，計(jì)算肺臟體重比值。隨后取黃豆大小左室游離壁浸泡在4%多聚甲醛中固定，梯度酒精脫水、二甲苯置換后石蠟包埋切片，行HE染色及天狼猩紅膠原染色及RIP2免疫組化染色后拍照分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，雙側(cè)概率水平P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大體及超聲指標(biāo)比較 取材時(shí)發(fā)現(xiàn)，家兔心臟在術(shù)后8周顯著增大變重，肺臟重量在8周時(shí)顯著增大，出現(xiàn)心力衰竭現(xiàn)象。心臟超聲結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，心衰組心臟表現(xiàn)出顯著的心肌肥厚和心功能減弱的特征：左室后壁厚度(LVPWD)增厚，左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)增加，同時(shí)左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)均顯著增大；與這些相對(duì)應(yīng)的是反映心功能的另外的指標(biāo)左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)與左室射血分?jǐn)?shù)(EF)的改變，在心衰組中FS及EF顯著降低。這些均表明主動(dòng)脈反流增加心臟前負(fù)荷聯(lián)合縮窄腹主動(dòng)脈導(dǎo)致心臟后負(fù)荷增加，使家兔心力衰竭動(dòng)物模型成功建立(見(jiàn)表1)。

表1 兩組家兔取材及超聲結(jié)果比較(±s)

表1 兩組家兔取材及超聲結(jié)果比較(±s)

組別對(duì)照組(n=10)心衰組(n=10) t值P值HW/BW 2.25±0.31 4.06±0.59 -8.57 0.01 EF(%) 72.34±6.89 40.75±7.92 9.51 0.01 FS(%) 41.43±5.26 22.51±6.77 6.98 0.01 LVEDD(cm) 1.12±0.09 1.72±0.21 -8.29 0.01 LVESD(cm) 0.78±0.04 1.01±0.09 -6.73 0.01

2.2 HE結(jié)果比較 從HE染色切片觀察到(見(jiàn)圖1)，對(duì)照組家兔肌原纖維細(xì)胞排列整齊致密，細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核及核仁結(jié)構(gòu)清晰；心力衰竭組家兔心臟肌絲排列紊亂松散，心肌細(xì)胞明顯增大，細(xì)胞及細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞核深染、增大、畸形，細(xì)胞核仁模糊不清晰，心肌細(xì)胞面積檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-21.87，P＜0.05)。

圖1 對(duì)照組與心力衰竭組家兔心肌細(xì)胞HE染色比較

2.3 膠原結(jié)果比較 PSR染色發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖2)，心衰組在術(shù)后8周時(shí)，家兔左心室心肌組織紅色膠原含量較對(duì)照組增多，膠原增粗增大且排列紊亂，成網(wǎng)絡(luò)狀，表明容量及壓力超負(fù)荷引起了膠原合成的增加，心肌間質(zhì)纖維化增加，計(jì)算膠原面積結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.82，P＜0.05)。

圖2 對(duì)照組與心力衰竭組家兔心肌細(xì)胞PSR染色比較

2.4 RIP2蛋白比較 RIP2免疫組化結(jié)果顯示(見(jiàn)圖3)，細(xì)胞質(zhì)中染色為深褐色的顆粒表達(dá)為RIP2的陽(yáng)性表達(dá)，RIP2在心衰組中的表達(dá)明顯比對(duì)照組中的表達(dá)減少，說(shuō)明RIP2在心衰組家兔心肌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)減少。

圖3 對(duì)照組與心力衰竭組家兔心肌細(xì)胞RIP2免疫組化染色比較

3 討 論

家兔在經(jīng)歷主動(dòng)脈瓣反流術(shù)和腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)后出現(xiàn)心力衰竭的各種表現(xiàn)：心臟增重、增大，心肌細(xì)胞增粗，排列紊亂，膠原增多、紊亂。以上均表明造模成功。而RIP2蛋白的免疫組化染色結(jié)果顯示，在心力衰竭的家兔中RIP2表達(dá)顯著減少。

在近些年中，對(duì)于心力衰竭發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究已經(jīng)取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展，獲得了很多一致性認(rèn)識(shí)：神經(jīng)內(nèi)分泌因素和許多細(xì)胞因子均可參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[7-8]。在此過(guò)程中，許多信號(hào)分子通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了心肌肥厚的形成過(guò)程，且天然免疫相關(guān)信號(hào)分子在心力衰竭中的作用研究也越來(lái)越多[9-10]。

RIP2的主要功能是參與了自體的天然免疫和適應(yīng)性免疫[11]。RIP2對(duì)病原體的天然免疫應(yīng)答主要是通過(guò)調(diào)節(jié)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NOD)和Toll樣受體(TLR)：當(dāng)吞噬細(xì)胞將細(xì)菌吞噬后，產(chǎn)生原胞壁酞二膚(Muramyl dipeptide，MDP)在胞內(nèi)與NOD結(jié)合，聚合后再通過(guò)CARD區(qū)域募集結(jié)合RIP2，泛素化IKKr抑制性κB激酶(Inhibitory κB kinase，IKK)，然后RIP2與IKKr相互作用，激活I(lǐng)KK復(fù)合體，釋放出的NF-κB轉(zhuǎn)位到胞核內(nèi)，激活炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)；當(dāng)脂多糖刺激活化TLR后，其CARD末端與RIP2的CARD末端相互作用，調(diào)節(jié)由TLR2、3、4引起的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。RIP2還能于CASPASE-1前體的CARD相互作用，導(dǎo)致蛋白水解，IL1β活化分泌。RIP2還能通過(guò)CLARP/CFLIP引起凋亡。

在研究RIP2對(duì)心肌缺血的影響中，Sebastien等[12]用離體大鼠研究發(fā)現(xiàn)，在胞壁酰二肽存在的情況下，RIP2能通過(guò)其特殊的結(jié)構(gòu)域CARD，來(lái)激活TAK1、MKK3、MKK4、MKK6，從而激活P38MAPK途徑，并且使心臟的收縮功能下降。這個(gè)結(jié)果與Lu等[13]的研究結(jié)果相似，RIP2對(duì)MAPK途徑有影響。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在增加壓力負(fù)荷復(fù)制的小鼠心肌肥厚的模型中，與RIP2類(lèi)似的另一個(gè)天然免疫相關(guān)的蛋白DKK3的表達(dá)隨著心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展而有所改變，通過(guò)轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠的深入研究發(fā)現(xiàn)，DKK3主要通過(guò)MAPK/JNK、P38途徑影響心肌肥厚，可能靶點(diǎn)是ASK1[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)RIP2在心力衰竭家兔中的表達(dá)減少，表明在心力衰竭中RIP2參與的相關(guān)免疫反應(yīng)發(fā)揮了一定的作用，其可能機(jī)制為MAPK途徑。

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Abnormal expression of RIP2 protein in cardiomyocyte of rabbits with heart failure.

ZHANG Yan,WU Xin-ying, WANG Che,BAO Ming-wei,YANG Bo.Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060, Hubei,CHINA

ObjectiveTo observe the changes of receptor-interacting protein 2(RIP2)protein in cardiomyocytes of rabbit with heart failure(heart failure,HF),which caused by volume overload combined with pressure overload.MethodsTwenty New Zealand white rabbits were randomly divided into two groups:a control group(Sham group,n= 10)and a heart failure group(HF group,n=10).Sham group only performed sham surgery.HF group was induced by increased volume overload and pressure overload with abdominal aortic coarctation.Two months later,the rabbits underwent echocardiography to detect cardiac structure and heart function.Weighed(BW),heart weight(HW)and lung weight(LW)were recorded.Left ventricular free wall were made into paraffin tissue to underwent HE and collagen PSR staining.Immunohistochemical staining was used to test the changes of RIP2 protein.ResultsCompared with Sham group,HF rabbits had increased thickness of heart wall[HW/BW:(2.25±0.31)vs(4.06±0.59)],enlarged heart chamber [LVEDD:(1.12±0.09)vs(1.72±0.21)],and reduced heart function[EF:(72.34±6.89)vs(40.75±7.92)].The protein levels of RIP2 were significantly decreased in HF group compared with Sham group.The difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionRIP2 protein was significantly reduced in cardiomyocytes of rabbits with heart failure.

Rabbit;Heart failure;Cardiomyocyte;Receptor-interacting protein 2(RIP2);Cardiac remodeling

R-332

A

1003—6350（2016）09—1377—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.09.001

2015-04-25)

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81200071)；湖北省自然科學(xué)基金(編號(hào)：2014CFA061、2014CFB739)；武漢大學(xué)2013年實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：363004)

楊波。E-mail：yybb112@whu.edu.cn