銀鯧ERα基因片段的克隆及卵黃發(fā)生期間飼料n-3LC-PUFA對其組織表達的影響

彭士明，李云莉，2，高權(quán)新，施兆鴻，張晨捷，王建鋼

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

銀鯧ERα基因片段的克隆及卵黃發(fā)生期間飼料n-3LC-PUFA
對其組織表達的影響

彭士明1，李云莉1，2，高權(quán)新1，施兆鴻1，張晨捷1，王建鋼1

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

本研究克隆獲得銀鯧（Pampus argenteus）雌激素受體α（estrogen receptorα，ERα）基因的部分cDNA序列，長度196 bp，編碼65個氨基酸。經(jīng)BLAST比對，與其它魚類ERα基因序列的一致性在89%～93%之間，證明實驗所得序列為銀鯧ERα基因的部分片段。以1年齡雌性銀鯧為實驗對象，配制了4組等氮、等能及等脂的實驗飼料，分別以100%魚油（FO組）、70%魚油和30%大豆油（FSO組）、30%魚油和70%大豆油（SFO組）、100%大豆油（SO組）為脂肪源，研究銀鯧在卵黃發(fā)生期間組織中ERα基因表達量的變化以及飼料n-3LC-PUFA對其組織表達的影響，實驗周期185 d。結(jié)果表明，在卵黃發(fā)生中期與后期，肝臟與卵巢中ERα基因表達量均顯著高于卵黃發(fā)生前期（P＜0.05）；卵黃發(fā)生后期肝臟組織中ERα基因表達量雖較卵黃發(fā)生中期呈升高趨勢，但除了SO組之外，兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）；而卵巢組織中ERα基因表達量在整個卵黃發(fā)生期間均呈現(xiàn)顯著升高趨勢（P＜0.05）。飼料n-3LC-PUFA對肝臟與卵巢ERα基因表達量的影響在卵黃發(fā)生前期均未表現(xiàn)出明顯的組間差異，但在卵黃發(fā)生中期與后期，飼料中較高的n-3LC-PUFA含量顯著提高了組織中ERα基因表達量。在卵黃發(fā)生中期與后期，F(xiàn)O與FSO組肝臟與卵巢組織中ERα基因表達量均分別顯著高于SO組（P＜0.05）。雙因素方差分析結(jié)果表明，飼料n-3LC-PUFA與卵黃發(fā)生時期對銀鯧組織中ERα基因表達量均具有顯著性影響，且兩者對組織中ERα基因表達量存在顯著性的交互作用。

銀鯧；雌激素受體α；卵黃發(fā)生；n-3LC-PUFA；基因表達

雌二醇（E2）是影響魚類卵巢發(fā)育、成熟及排卵的一種重要的性類固醇激素[1]。卵巢發(fā)育、成熟過程中卵泡會分泌E2，后者通過血液運輸至肝臟并與肝細胞中的雌激素受體（estrogen receptor，ER）結(jié)合，從而發(fā)揮其生物學效應，誘導肝臟合成卵黃蛋白原[2－3]。換言之，E2功能的發(fā)揮，其前提條件是必須與其相應的ER結(jié)合[4]，因此，組織中ER的表達情況直接影響著E2所能發(fā)揮的生理效應。此外，研究也已證實，性類固醇激素及其與受體的相互作用是誘導調(diào)節(jié)魚類性腺發(fā)育、成熟的重要信號途徑[5]。在魚類的研究中發(fā)現(xiàn)，ER共有3種類型，分別為ERα、ERβa和 ERβb[5－6]，但只有ERα具有雌激素效應[7]。

銀鯧（Pampus argenteus）隸屬鯧科（Stromateidae），鯧屬，是我國主要的海產(chǎn)經(jīng)濟魚類之一，市場需求度大，具有較高的養(yǎng)殖開發(fā)潛力。近些年來，盡管國內(nèi)在銀鯧人工繁育及養(yǎng)殖方面取得了一系列技術(shù)突破與成果[8－12]，但仍存在諸多限制因素致使其產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖推廣至今尚未實現(xiàn)。缺乏適宜且高效的親體培育所需飼料就是其中主要的限制因素之一，并由此導致養(yǎng)殖銀鯧親體性腺發(fā)育欠佳，配子質(zhì)量較差，育苗成活率低。目前，關于銀鯧營養(yǎng)飼料方面的研究報道主要集中在幼魚階段[13－18]，針對養(yǎng)殖親體的研究尚未見有相關報道。本文以與魚類性腺發(fā)育密切相關的基因ERα為立足點，研究了其在銀鯧卵黃發(fā)生期間組織中的基因表達情況，并進一步分析了飼料中n-3 LC-PUFA含量對其組織表達的影響，以期為進一步探討ERα在魚類性腺發(fā)育過程中的作用機理及其調(diào)控機制奠定基礎，并為養(yǎng)殖銀鯧親體人工飼料的合理配制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用銀鯧為中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所培育的1齡銀鯧親本，叉長（17.76± 2.39）cm，體質(zhì)量（150.82±5.41）g。實驗分別以100%魚油（FO）、70%魚油和30%大豆油（FSO）、30%魚油和70%大豆油（SFO）、100%大豆油（SO）為脂肪源配制等氮、等能、等脂的4組飼料，其飼料成分組成見表1，脂肪酸組成見表2。飼料蛋白水平在50%左右，脂肪水平16%左右，F(xiàn)O組、FSO組、SFO組、SO組n-3 LC-PUFA含量依次為5.18%、4.01%、3.02%、2.22%。所有飼料原料經(jīng)過充分混合后經(jīng)絞肉機制成2 mm的顆粒，于25℃烘箱中風干后，放于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗設計

飼養(yǎng)實驗在中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所實驗基地進行。實驗參照1.1設置4個飼料試驗組，每個飼料組設3重復。將240 ind 1年齡雌性銀鯧隨機平均分入12個16 m3的水泥池中。實驗自2013年10月開始，于2014年4月結(jié)束，共計185 d。飼養(yǎng)期間，連續(xù)充氣增氧，每天飽食投喂2次（9∶00和17∶00），日換水量為30%。冬季采用加溫措施保障實驗水溫不低于16℃，維持銀鯧的基本攝食，整個實驗期間水溫變化范圍為16～23℃，鹽度25～28。

1.3 樣品采集

分別于2013年11月20日（卵巢Ⅱ期）、2014年2月15日（卵巢Ⅲ期）以及2014年4月8日（卵巢Ⅳ期）分3次取樣，每個水泥池每次取3 ind魚，經(jīng)100 mg·L-1MS222麻醉，酒精體表消毒后解剖取其肝臟與卵巢樣品，浸于RNA保存液（Qiagen）中4℃過夜后，－80℃保存。

1.4 檢測方法

1.4.1 引物的設計與合成

根據(jù)已知魚類的ERα基因序列，使用CodHope原理設計簡并引物如下：ERαF：CTCCACCCCTGGCTACTACT；ERαR：GGGTGTTGA GGTGGTTTCCA。根據(jù)已知魚類β-Actin基因序列，設計熒光定量PCR內(nèi)參引物如下：β-ActinF：TGAAATCGCCGCACTGGTTG；β-ActinR：ACCAAC GTAGCTGTCCTTCTG。所有引物均由上海派森諾生物科技有限公司合成。

表1 實驗飼料的組成Tab.1 Com position of the experimental diets

表2 飼料脂肪酸組成（%，占總脂肪酸比例）Tab.2 Fatty acid com position（%of total fatty acids）of the experimental diets

1.4.2 總RNA提取及cDNA的合成

按TRIzol試劑操作使用說明書分別提取銀鯧肝臟及卵巢組織的總RNA，使用紫外分光光度計測定所提取總RNA的濃度，并根據(jù)OD260/280值判斷RNA的質(zhì)量。取2μL各組織的總RNA為模板利用隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶AMV（Invitrogen）合成cDNA第一鏈。

1.4.3ERα基因片段的克隆及序列驗證

以卵巢組織的cDNA為模板，利用引物ERαF和ERαR擴增ERα的部分片段。反應程序為：94℃5 min；然后94℃45 s，59℃1 min，72℃1 min，共進行30個循環(huán)，最后72℃10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收試劑盒（TIANGEN）進行純化，克隆到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆由上海派森諾生物科技有限公司進行測序。

根據(jù)GenBank上已經(jīng)提交的魚類ERα基因序列，在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.blast）上通過BLAST對實驗所得ERα基因序列進行比對分析。

1.4 .4 組織中ERα基因的表達量分析

按照SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit操作說明書，以β-actin為內(nèi)參，對得到的各樣品Ct值進行均一化處理，以卵黃發(fā)生前期FO飼料組中的一個肝臟樣品為基準，應用2-ΔΔCT法[19]確定組織中ERα基因的相對含量。熒光定量PCR反應體系為cDNA 2μL，2×SYBR Premix EXTaqTM 12.5μL，ROX Reference Dye II 0.5μL，dH2O 9 μL，正反向引物（10μM）各0.5μL；反應條件為95℃4 min，然后35個循環(huán)（95℃15 s，57℃15 s，72℃25 s），最后72℃3 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差（Mean±SD）表示，實驗結(jié)果用SPSS軟件進行統(tǒng)計與分析，采用Duncan氏檢驗進行多重比較，同時采用雙因素方差分析方法確定飼料與卵黃發(fā)生時期對組織中ERα基因表達量的交互作用。P＜0.05即認為有顯著性差異，P＜0.01即認為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERα基因的克隆與序列分析

以卵巢cDNA為模板克隆獲得一條196 bp的cDNA序列，編碼65個氨基酸（圖1）。通過BLAST比對分析可以看出（表3），所得序列與其它魚類的ERα基因序列具有較高的一致性（≥89%），且與大黃魚（Larimichthys crocea）和舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）的ERα基因序列的一致性均達到93%。這表明本實驗所得序列是銀鯧ERα基因的部分片段。

表3 銀鯧ERα基因與其它魚類間的BLAST結(jié)果Tab.3 BLAST results of ERα gene between Pampus argenteus and other fish species

圖1 銀鯧ERα基因cDNA部分序列與翻譯的氨基酸序列Fig.1 Partial nucleotide sequence and deduced am ino acid sequence of ERαcDNA in Pampus argenteus

2.2 飼料n-3 LC-PUFA對卵黃發(fā)生期間肝臟ERα基因表達量的影響

飼料n-3 LC-PUFA對卵黃發(fā)生期間肝臟ERα基因表達量的影響見圖2。由圖2可以看出，卵黃發(fā)生中期與后期肝臟ERα表達量與卵黃發(fā)生前期相比呈現(xiàn)顯著性的升高（P＜0.05），但是除了SO飼料組外，卵黃發(fā)生后期肝臟ERα表達量雖有升高趨勢，但與卵黃發(fā)生中期并無顯著性差異（P＞0.05）。在卵黃發(fā)生前期，各飼料組間肝臟ERα表達量無顯著性差異（P＞0.05）。在卵黃發(fā)生中期，F(xiàn)O與FSO組肝臟ERα表達量均顯著高于SFO與SO組（P＜0.05），但FO與FSO組間、SFO與SO組間并無顯著性差異（P＞0.05）。在卵黃發(fā)生后期，F(xiàn)O與FSO組肝臟ERα表達量均顯著高于SO組（P＜0.05），但FO與FSO組間、FSO與SFO組間、SFO與SO組間均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 飼料n-3 LC-PUFA對卵黃發(fā)生期間卵巢ERα基因表達量的影響

圖3為飼料n-3 LC-PUFA對卵黃發(fā)生期間卵巢ERα基因表達量的影響。由圖3可知，卵巢ERα基因表達量在整個卵黃發(fā)生過程中一直呈現(xiàn)顯著性升高趨勢（P＜0.05）。在卵黃發(fā)生前期，飼料n-3 LC-PUFA對卵巢ERα基因表達量并無顯著性影響（P＞0.05）。在卵黃發(fā)生中期，F(xiàn)O與FSO組卵巢ERα基因表達量均顯著高于SO組（P＜0.05），但FO、FSO與SFO3組間并無顯著性差異（P＞0.05）。在卵黃發(fā)生后期，F(xiàn)O、FSO與 SFO組卵巢ERα基因表達量均顯著高于SO組（P＜0.05），同時FO組ERα基因表達量也顯著高于SFO組（P＜0.05），但FO與FSO組間、FSO與SFO組間均無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 飼料n-3 LC-PUFA對銀鯧卵黃發(fā)生期間肝臟ERα表達量的影響Fig.2 Effect of dietary n-3 LC-PUFA on hepatic ERαexpression levels in female Pampus argenteus broodstock during vitellogenesis

2.4 飼料n-3 LC-PUFA與卵黃發(fā)生時期對組織中ERα基因表達量的交互作用

表4為飼料與卵黃發(fā)生時期對組織中ERα基因表達量的雙因素方差分析結(jié)果。由表4可知，實驗飼料與卵黃發(fā)生時期均對銀鯧組織中ERα基因表達量具有極顯著的影響（P＜0.01）。同時，實驗飼料與卵黃發(fā)生時期兩者對肝臟ERα基因表達量具有顯著的交互作用（P＜0.05），對卵巢ERα基因表達量的交互作用則達到極顯著（P＜0.01）。

圖3 飼料n-3 LC-PUFA對銀鯧卵黃發(fā)生期間卵巢ERα表達量的影響Fig.3 Effect of dietary n-3 LC-PUFA on ovarian ERαexpression levels in female Pampus argenteus broodstock during vitellogenesis

3 討論

本研究分離克隆得到銀鯧ERα基因的部分cDNA片段，經(jīng)BLAST比對，所得序列與大黃魚、舌齒鱸、美洲條紋狼鱸（Morone saxatilis）、真鯛（Chrysophrys major）、莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）、布氏新亮麗鯛（Neolamprologus brichardi）以及斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）ERα基因序列的一致性依次為93%、93%、92%、91%、91%、90%和89%，表明了本文所得序列確實為銀鯧ERα基因，保障了本實驗后續(xù)研究內(nèi)容的準確性。

ER是一種蛋白質(zhì)分子，于靶細胞內(nèi)與激素發(fā)生特異性結(jié)合形成激素-受體復合物，進而保障激素發(fā)揮其應有的生物學效應[4，20]。研究證實，魚類3種ER中，僅ERα具有雌激素效應[7]。本研究結(jié)果顯示，在卵黃發(fā)生中、后期（即卵巢III～IV期），肝臟與卵巢中ERα基因表達量顯著升高，表明ERα在銀鯧卵巢發(fā)育、成熟過程中具有至關重要的生理作用。魚類在卵巢發(fā)育、成熟過程中需要積累大量的卵黃蛋白，用于胚胎及幼體早期發(fā)育階段主要的營養(yǎng)來源，而此過程則需要E2與ERα的介導。已有資料顯示，卵泡分泌的E2通過血液運輸至肝臟并與肝細胞中的ERα結(jié)合，進而發(fā)揮其生物學效應，誘導肝臟合成卵黃蛋白原[2－3]。這進一步解釋了本實驗中銀鯧肝臟ERα基因表達量在卵黃發(fā)生中、后期顯著升高的原因。本實驗中卵巢ERα基因表達量在卵黃發(fā)生中、后期顯著升高的原因推測可能與其卵子的成熟密切相關。PANKHURST等[21]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢組織中E2的分泌及其與受體的結(jié)合如果受阻，將導致大西洋鮭（Salmo salar）卵子發(fā)育受阻、繁殖性能顯著降低。趙梅琳等[22]在對綠鰭馬面鲀（Navodon septentrionalis）的研究中也發(fā)現(xiàn)，卵巢中ERα基因表達量在其發(fā)育、成熟過程中呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，且在繁殖期達到最高值，表明ERα與魚類生殖周期存在密切關聯(lián)，在性腺發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的生理作用。

表4 飼料與卵黃發(fā)生時期對組織中ERα表達量影響的雙因素分析Tab.4 Results of two-way ANOVA analysis used to study the effects of diet and stages of vitellogenesis on them RNA expression levels of ERα gene in tissues.

本研究結(jié)果顯示，飼料中較高的n-3LCPUFA可顯著提高組織中ERα基因的表達量。徐永江等[20]、方永強等[23]研究均發(fā)現(xiàn)，E2與ERα在魚類卵巢發(fā)育過程中，其在卵細胞中的表達具有明顯的一致性，這間接表明了E2與ERα間具有一定程度的相互反饋調(diào)節(jié)機制。李惠云等[24]使用一種環(huán)境雌激素（雙酚 A）誘導雌性鯽（Carassius auratus），發(fā)現(xiàn)環(huán)境雌激素可誘導其肝臟ERα基因表達與血清E2水平同步明顯升高。盡管目前尚未見有關飼料組成影響魚類ERα基因表達的研究報道，但飼料組成影響魚類性類固醇激素（如E2）分泌的研究已有一些報道。李遠友等[25]在對花尾胡椒鯛（Plectorhynchus cinctus）親體的研究報道中指出，飼料中適宜的必需脂肪酸含量可顯著提高魚類機體內(nèi)性類固醇激素的分泌，保障其卵子的發(fā)生及正常成熟，而飼料中必需脂肪酸含量不足則會導致機體E2分泌水平的顯著降低，嚴重影響其生殖性能。同樣，在對施氏鱘（Acipenser schrenckii）成魚的研究中也發(fā)現(xiàn)，飼料中添加2%的大豆卵磷脂可有效提高其血清E2的質(zhì)量濃度[26]。眾所周知，肝臟合成卵黃蛋白原并轉(zhuǎn)運至卵巢組織中以卵黃蛋白的形式存儲，這是魚類卵巢發(fā)育、成熟過程中的關鍵環(huán)節(jié)，這一環(huán)節(jié)的實現(xiàn)必需依靠E2與ERα的介導，而脂類特別是n-3LC-PUFA則是合成卵黃蛋白原的主要營養(yǎng)素之一。因此，可以推測n-3LCPUFA、E2與ERα3者間勢必存在一定的關聯(lián)性。本實驗中較高的n-3LC-PUFA含量在卵黃快速發(fā)育時期顯著提高了肝臟及卵巢中ERα基因的表達量，其原因可能與上述推測不無關系，但飼料中n-3LC-PUFA影響ERα基因表達量的生理及分子機制仍需要進一步的研究探討。

從本研究結(jié)果還可看出，銀鯧在卵黃發(fā)生過程中肝臟中ERα基因表達量一直明顯高于卵巢組織，表明ERα基因表達在不同組織間存在一定的差異性。在金魚（Carassius auratus）的研究中發(fā)現(xiàn)，雌、雄金魚其垂體中ERα基因的表達量是最高的，而在腦、性腺、肝臟、肌肉、心臟及腸道中的表達量則很低[27]。而斑馬魚（Danio rerio）中的ERα基因則在大腦、垂體、肝臟及性腺中均具有非常高的表達量[28]。此外，趙梅琳等[22]在對綠鰭馬面鲀的研究中得出，雌魚中ERα基因在垂體、心臟和卵巢中的表達量最高，而腦、肝臟、胃、腎及肌肉組織中的表達量次之。由以上研究結(jié)果可以得出，ERα基因不僅在組織間存在表達差異，而且這種組織間差異在不同魚種之間也不盡相同。

綜上可知，銀鯧卵黃發(fā)生期間肝臟及卵巢中ERα基因表達量的變化與卵巢的發(fā)育、成熟過程密切相關，且飼料中較高的n-3LC-PUFA含量（4% ～5%）可明顯提高其組織中的表達量，同時，雙因素分析結(jié)果還顯示，不同實驗飼料與卵黃發(fā)生的不同時期對銀鯧肝臟及性腺組織中ERα基因表達量均具有顯著的交互作用。

[1]溫海深，林浩然.環(huán)境因子對硬骨魚類性腺發(fā)育成熟及其排卵和產(chǎn)卵的調(diào)控[J].應用生態(tài)學報，2001，12（1）：151－155.

WEN H S，LIN H R.Effect of environmental factors on gonadal maturation as well as its ovulation and spawning in teleosts[J].Chinese Journal of Applied Ecology，2001，12（1）：151－155.

[2]WATTSM，PANKHURST NW，SUN B.Vitellogenin isolation，purification and antigenic cross reactivity in three teleost species[J].Comparative Biochemistry and Physiology（Part B），2003，134（3）：467－476.

[3]LUBZENS E，YOUNG G，BOBE J，et al.Oogenesis in teleosts：how fish eggs are formed[J].General and Comparative Endocrinology，2010，165（3）：367－389.

[4]ANDERSON K，SWANSON P，PANKHURST N，etal.Effect of thermal challenge on plasma gonadotropin levels and ovarian steroidogenesis in female maiden and repeat spawning Tasmanian Atlantic salmon（Salmo salar）[J].Aquaculture，2012，334（1－4）：205－212.

[5]DEVLIN R H，NAGAHAMA Y.Sex determination and sex differentiation in fish：an overview of genetic，physiological，and environmental influences[J].Aquaculture，2002，208（3－4）：191－364.

[6]蘭 滔，盧邁新，楊麗萍，等.奧利亞羅非魚雌激素β受體兩種亞型cDNA的克隆、組織分布及雌激素對其表達的影響[J].水產(chǎn)學報，2010，34（1）：8－18.

LAN T，LU M X，YANG L P，et al.Molecular cloning，tissue distribution of two estrogen receptorβ cDNAs of blue tilapia（Oreochromis aureus）andeffects of estrogen on their expression[J].Journal of Fisheries of China，2010，34（1）：8－18.

[7]GREYTAK SR，CALLARD G V.Cloning of three estrogen receptors（ER）from killifish（Fundulus heteroclitus）：differences in populations from polluted and reference environments[J].General and Comparative Endocrinology，2007，150（1）：174－188.

[8]施兆鴻，高露姣，謝營梁，等.舟山漁場銀鯧和灰鯧繁殖特性的比較研究[J].水產(chǎn)學報，2006，30（5）：247－252.

SHIZH，GAO L J，XIE Y L，et al.Comparison of reproductive characteristics betweenPampus argenteusandPampus cinereucin Zhoushan fishing ground[J].Journal of Fisheries of China，2006，30（5）：247－252.

[9]施兆鴻，馬凌波，高露姣，等.人工育苗條件下銀鯧仔稚幼魚攝食與生長特性[J].海洋水產(chǎn)研究，2007，28（4）：540－549.

SHIZ H，MA L B，GAO L J，et al.Feeding habits and growth characteristics of larva and juvenile of Pampus argenteus under artificial rearing condition[J].Marine Fisheries Research，2007，28（4）：540－549.

[10]施兆鴻，趙 峰，王建剛，等.舟山漁場銀鯧人工授精及孵化[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2009，36（1）：18－21.

SHIZ H，ZHAO F，WANG JG，et al.Artificial insemination and incubation of silver pomfret（Pampus argenteus）from Zhoushan fishing ground[J].Fishery Modernization，2009，36（1）：18－21.

[11]施兆鴻，彭士明，王建鋼，等.人工養(yǎng)殖銀鯧子代的胚胎發(fā)育及仔稚幼魚形態(tài)觀察[J].中國水產(chǎn)科學，2011，18（2）：267－274.

SHI Z H，PENG S M，WANG J G，et al.Observation of embryonic，larval and juvenile development inPampus argenteusoff spring[J].Journal of Fishery Sciences of China，2011，18（2）：267－274.

[12]王建建，施兆鴻，高權(quán)新，等.野生銀鯧消化道內(nèi)潛在產(chǎn)酶益生菌產(chǎn)酶條件的初步研究.海洋漁業(yè)，2015，37（6）：533－540.

WANG JJ，SHIZH，GAO Q X，et al.On enzymeproduction conditions of probiotics in digestive tracts of wildPampus argenteus[J].Marine Fisheries，2015，37（6）：533－540.

[13]彭士明，林少珍，施兆鴻，等.飼養(yǎng)密度對銀鯧幼魚增重率及消化酶活性的影響[J].海洋漁業(yè)，2013，35（1）：72－76.

PENG SM，LIN S Z，SHI Z H，et al.Effects of rearing density on growth rate and digestive enzyme activity of juvenilePampus argenteus[J].Marine Fishieries，2013，35（1）：72－76.

[14]彭士明，尹 飛，孫 鵬，等.不同飼料對銀鯧幼魚增重率、肝臟脂酶及抗氧化酶活性的影響[J].水產(chǎn)學報，2010，34（6）：769－774.

PENG S M，YIN F，SUN P，et al.Effects of different diets on weight gain，hepatic lipase and antioxidant enzyme of juvenile silver pomfret（Pampus argenteus）[J].Journal of Fisheries of China，2010，34（6）：769－774.

[15]ALMATAR SM，JAMESCM.Performance of different types of commercial feeds on the growth of juvenile silver pomfret，Pampus argenteus，under tank culture conditions[J].Journal of the World Aquaculture Society，2007，38（4）：550－556.

[16]HOSSAIN M A，ALMATAR S M，JAMES C M.Optimum dietary protein level for juvenile silver pomfret，Pampus argenteus（Euphrasen）[J].Journal of the World Aquaculture Society，2010，41（5）：710－720.

[17]PENG SM，SHIZ H，YIN F，et al.Effect of highdose vitamin C supplementation on growth，tissue ascorbic acid concentrations and physiological response to transportation stress in juvenile silver pomfret，Pampus argenteus[J].Journal of Applied Ichthyology，2013，29（6）：1337－1341.

[18]PENG SM，SHI Z H，YIN F，et al.Selection of diet for culture of juvenile silver pomfret，Pampus argenteus[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2012，30（2）：231－236.

[19]LIVAK K J，SCHMITTGEN TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod[J].Methods，2001，25（4）：402－408.

[20]徐永江，柳學周，溫海深，等.性類固醇激素及其受體在半滑舌鰨性腺分化發(fā)育過程中的表達與生理功能[J].中國海洋大學學報，2010，40（7）：66－72.

XU Y J，LIU X Z，WEN H S，et al.Immunohistochemical study of E2，ERα and AR in gonad differentiation and development of tongue fish[J].Journal of Ocean University of China，2010，40（7）：66－72.

[21]PANKHURST N W，KING H R.Temperature and salmonid reproduction：implications for aquaculture[J].Journal of Fish Biology，2010，76（1）：69－85.

[22]趙梅琳，溫海深，張冬茜，等.綠鰭馬面鲀ERα基因部分cDNA序列克隆及其表達研究[J].海洋科學，2014，38（5）：81－88.

ZHAO M L，WEN H S，ZHANG D Q，et al.Cloning of partial cDNA of estrogen receptor α and expression analysis during the reproductive cycle inNavodon septentrionalis[J].Marine Sciences，2014，38（5）：81－88.

[23]方永強，翁幼竹，胡曉霞.性類固醇激素及其受體在文昌魚性腺和神經(jīng)系統(tǒng)中的分布[J].動物學報，2001，47（4）：398－403.

FANG Y Q，WENG Y Z，HU X X.Distribution of sex sterotd hormones and their receptors in the gonads and nervous system of amphioxus（Branchiostoma Belcheri）[J].Acta Zoologica Sinica，2001，47（4）：398－403.

[24]李慧云，劉鵬威，魏 華.雙酚A對鯽雌激素受體表達和雌二醇水平的影響[J].上海水產(chǎn)大學學報，2008，17（6）：641－646.

LIH Y，LIU PW，WEIH.Effects of bisphenol-A on expression of estrogen receptor and level of 17βeatradiol in vivo of femaleCarassius auratus[J].Journal of Shanghai Ocean University，2008，17（6）：641－646.

[25]李遠友，陳偉洲，孫澤偉，等.飼料中n-3 HUFA含量對花尾胡椒鯛親魚的生殖性能及血漿性類固醇激素水平季節(jié)變化的影響[J].動物學研究，2004，25（3）：249－255.

LIY Y，CHENW Z，SUN ZW，et al.Effects of n-3 HUFA content in brodstock diets on reproductive performance and seasonal changes of plasma sex steroids levels inPlectorhynchus cinctus[J].Zoological Research，2004，25（3）：249－255.

[26]張 穎，孫慧武，徐 偉，等.飼料卵磷脂對施氏鱘血清卵黃蛋白原、卵徑及性類固醇激素水平的影響[J].中國水產(chǎn)科學，2010，17（4）：783－790.

ZHANG Y，SUN H W，XU W，et al.Effects of phospholipids content in reserved brood diets on egg diameter performance，plasma sex steroids and vitellogenin levels in Amur sturgeonAcipenser schrenckii[J].Journal of Fishery Sciences of China，2010，17（4）：783－790.

[27]CHOI C Y，HABIBI H R.Molecular cloning of estrogen receptor a and expression pattern of estrogen receptor subtypes in male and female goldfish[J].Molecular and Cellular Endocrinology，2003，204（1－2）：169－177.

[28]MENUET A，PELLEGRINI E，ANGLADE I，et al.Molecular characterization of three estrogen receptor forms in zebrafish：binding characteristics，transactivation properties，and tissue distributions[J].Biology of Reproduction，2002，66（6）：1881－1892.

Molecular cloning of ERα from silver pomfret Pampus argenteus and the response of its expression to dietary n-3 LC-PUFA levels during vitellogenesis

PENG Shi-ming1，LI Yun-li1，2，GAO Quan-xin1，SHI Zhao-hong1，ZHANG Chen-jie1，WANG Jian-gang1
（1.East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai200090，China；2.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

It has been reported that n-3 long-chain polyunsaturated fatty acids（n-3 LC-PUFAs）such as eicosapentaenoic acid（EPA，20：5n-3）and docosahexaenoic acid（DHA，22∶6n-3）play critical roles in cell permeability and enzyme activity.Marine teleosts can not synthesize LC-PUFAs from 18-carbon precursors due to a deficiency inΔ5-desaturase.Therefore，it is imperative that teleost diets contain LC-PUFAs.The importance of LC-PUFAs，especially n-3 LC-PUFAs，in fish broodstock nutrition has been extensively studied.Dietary n-3 LC-PUFAs affect spawning performance，egg and larval quality，and egg fatty acidcomposition of broodstock.In humans，fatty acids，especially PUFAs，are cell signaling molecules，structural compounds and energy sources.PUFAs are crucial for mediating immunological，metabolic，and endocrine signals within the uterine-fetal-placental unit.PUFAs are precursors of cell signaling molecules（e.g.，eicosanoids），and there is evidence that they regulate membrane signal transduction pathways and steroid hormone action，by modulating the binding of estrogen，progesterone，and glucocorticoids to their intracellular receptors.Therefore，PUFAs act as endogenous modulators of key enzymes involved in steroid metabolism.While most studies have focused on the effects of diet on body composition，growth performance，egg quality and larval survival rate，few studies have investigated the effects of nutrients on hormone synthesis during gonadogenesis.Pituitary gonadotropin hormone（GtH），follicle-stimulating hormone（FSH），and luteinizing hormone（LH）are involved in gametogenesis and sexual maturation in teleosts.In response to GtH，cholesterol is converted into testosterone（T）and 17β-estradiol（E2）.Sex steroid hormones play important roles in vertebrate reproduction.In several teleost species，E2and T，which are produced in gonadal tissues under the control of GtH，are essential in gametogenesis.Estrogen receptors（ER）are members of steroid receptor family of ligand-activated nuclear receptors and interact as homo-or heterodimers on estrogen responsive elements of target gene promoters to enhance or repress transcription.A key step in thematuration process is the production of E2by the developing ovarian follicle.E2is transported in the bloodstream to the liver where it binds to ER in the hepatocyte cytoplasm.The E2-ER complex in turn acts as a promoter for the expression of the gene or genes coding for Vtg，which is then sequestered into the developing oocyte through a process of receptor-mediated endocytosis.Pampus argenteusis a novel aquaculture species in China.In spite of important technical development and intense research in silver pomfret，some bottlenecks still limit the expansion of its industry.One is the lack of a suitable formulated diet for broodstock，which leads to the poor quality of gonads in cultured broodstock.The effects of diet on the body composition and growth performance of juvenile silver pomfret have been extensively studied.However，there is little evidence on the effects of diet on the reproductive system.The objective of this study is to investigate the molecular cloning ofERαfrom silver pomfret，and the response of its expression to dietary n-3 LC-PUFA levels during vitellogenesis.In the present study，the partial cDNA ofERαwas cloned from silver pomfretPampus argenteus，which was 196 bp，encoding 65 amino acids.The results of BLAST showed that the sequence was 89－93%similar to those of other fish species，implying that the obtained sequence was theERαof silver pomfret.For the purpose of studying the changes of tissueERαgene expression during vitellogenesis and the response of its expression to dietary n-3 LC-PUFA levels，four iso-nitrogenous，iso-energetic，and iso-lipidic（16%lipids）experimental dietswere formulated：100%fish oil（FO），70%fish oil and 30%soybean oil（FSO），30%fish oil and 70%soybean oil（SFO），and 100%soybean oil.Female silver pomfret（1 y of age）were assigned to one of the four diets（with three replicates each）for 185 days.The results showed that hepatic and ovarianERαgene expression in vitellogenesis and post-vitellogenesis stages were significantly higher than those in pre-vitellogenesis（P＜0.05）.HepaticERαgene expression levels in the postvitellogenesis stage were higher than those in vitellogenesis stage，but not significantly（except SO group）.However，the ovarianERα gene expression levels changed constantly and significantly during vitellogenesis（P＜0.05）.In pre-vitellogenesis，there was no significant difference in hepatic and ovarianERα gene expression levels among groups.However，in vitellogenesis and post-vitellogenesis stages，F(xiàn)O and FSO had higherERαgene expression levels than SO（P＜0.05）.The results of two-way ANOVA indicated that statistically significant effects of both diets and stages were observed for the tissueERα gene expression，meanwhile significant effects of diet and stage interactions were also recorded.

Pampus argenteus；estrogen receptorα；vitellogenesis；n-3LC-PUFA；gene expression

S 968.1

A

1004－2490（2016）02－0157－09

2015－05－12

國家自然基金項目（31202009）；上海市科技興農(nóng)重點攻關項目（滬農(nóng)科攻字2013－2－1）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費（東2014Z02－2）

彭士明，男，博士，副研究員。E-mail：shiming.peng＠163.com