基層醫(yī)院嗜血桿菌檢測(cè)方法及耐藥性的研究應(yīng)用

梁建芬 綜述,吳開進(jìn) 審校

(1.貴港市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣西貴港 537132；2.玉林市紅十字醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西玉林 537000)

·綜 述·

基層醫(yī)院嗜血桿菌檢測(cè)方法及耐藥性的研究應(yīng)用

梁建芬1綜述,吳開進(jìn)2審校

(1.貴港市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,廣西貴港 537132；2.玉林市紅十字醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西玉林 537000)

嗜血桿菌; 分離鑒定; 生物型; 抗菌藥物耐藥性

嗜血桿菌引起人類機(jī)會(huì)性感染致病越來越受到臨床關(guān)注，主要有流感嗜血桿菌(haemophilus influenzae，HI)和副流感嗜血桿菌(hemophilus parainfluenzae，HPI)，國(guó)內(nèi)對(duì)嗜血桿菌研究也有60年歷史。嗜血桿菌初次培養(yǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求高，在血平板上不生長(zhǎng)或易被革蘭陽性球菌抑制，不易培養(yǎng)。在基層醫(yī)院由于缺乏可培養(yǎng)菌的分離培養(yǎng)條件，如專用培養(yǎng)基、CO2環(huán)境、人員業(yè)務(wù)水平所限而不能辨別菌落等因素影響，實(shí)驗(yàn)室往往忽略嗜血桿菌分離而導(dǎo)致其檢出率極低，對(duì)其致病性、分布、分型及耐藥研究應(yīng)用較少，本文就此作簡(jiǎn)單的綜述。

1 嗜血桿菌檢測(cè)分離培養(yǎng)

1.1 直接涂片染色鏡檢 革蘭染色鏡檢對(duì)具有特殊形態(tài)的病原微生物檢查是一種快速有效的方法，在基層實(shí)驗(yàn)室里仍然是十分重要的病原微生物檢測(cè)手段。對(duì)呼吸道原始標(biāo)本進(jìn)行革蘭染色，如鏡檢見短小呈絲狀體或線狀體陰性桿菌可初步懷疑為嗜血桿菌。由于嗜血桿菌本身就存在多形態(tài)特點(diǎn)，呈高度的異質(zhì)性，抗菌藥物使用也會(huì)引起細(xì)菌變異，鏡檢出典型嗜血桿菌形態(tài)的幾率逐漸下降，因此，涂片檢查嗜血桿菌存在局限性。

1.2 選擇培養(yǎng)基分離 傳統(tǒng)使用普通巧克力平板分離嗜血桿菌的結(jié)果往往不太理想，許多改良的巧克力瓊脂培養(yǎng)基有效提高嗜血桿菌的分離率[1-2]。除了巧克力培養(yǎng)基外，國(guó)內(nèi)已研制出不含巧克力的嗜血桿菌專用培養(yǎng)基(溫州市康泰生物科技有限公司生產(chǎn))，更容易分辨嗜血桿菌生長(zhǎng)菌落形態(tài)。基層醫(yī)院可根據(jù)成本核算情況購(gòu)買成品，避免自制巧克力培養(yǎng)基質(zhì)量難控問題，而市售巧克力平板的質(zhì)量良莠不一，使用前需用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。選擇好培養(yǎng)平板后，將標(biāo)本同時(shí)接種在血平板、嗜血桿菌培養(yǎng)基上，嚴(yán)格三區(qū)劃線，接種以保證長(zhǎng)出單個(gè)菌落，置5%～10%CO2環(huán)境中(無CO2箱也可用稍大的燭缸代替)35 ℃培養(yǎng)24～48 h[3]。

1.3 鑒定 嗜血桿菌在血平板上不生長(zhǎng),巧克力平板上生長(zhǎng)為無色或灰白色，圓形、透明、光滑、濕潤(rùn)的菌落，革蘭染色為陰性短小桿菌?！靶l(wèi)星現(xiàn)象”可鑒別HI和HPI，在血平板上HI和HPI的“衛(wèi)星現(xiàn)象”都能出現(xiàn)，用X因子和V因子紙片在M-H平板上，僅有HPI出現(xiàn)“衛(wèi)星現(xiàn)象”。Barbe等[4]用API-NH鑒定條能準(zhǔn)確鑒定絕大部分臨床分離的HI，API-NH鑒定試條是成熟的商品化試劑盒，因操作簡(jiǎn)便而廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室。API-NH不僅能快速鑒定細(xì)菌并可對(duì)嗜血桿菌進(jìn)行生物分型，能夠滿足基層實(shí)驗(yàn)室的要求。

2 嗜血桿菌分布

研究嗜血桿菌的分布，主要是了解嗜血桿菌的流行情況，為預(yù)防控制和治療感染提供臨床資料。嗜血桿菌的分布因研究對(duì)象和方法不同，結(jié)論不盡一致。陳東科等[5]研究發(fā)現(xiàn)嗜血桿菌分布與性別無關(guān)，而與寄生部位有關(guān)。張玉妥等[6]對(duì)健康人群中HI帶菌情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同年齡群口咽部HI帶菌率具有明顯差異，學(xué)齡前兒童、學(xué)齡兒童、成人HI檢出率分別為39.8%、20.7%、7.0%，年齡越小帶菌率越高，高帶菌率人群會(huì)成為HI感染的高危人群。王冬國(guó)等[7]調(diào)查兒科住院患者嗜血桿菌分布結(jié)果，年齡在4月至2歲的患兒有2/3以上能夠檢出HI或HPI，并且HPI的檢出率也逐步升高，帶菌率表明兒科住院患者必須切實(shí)控制呼吸道感染的傳播。吳開進(jìn)等[8]報(bào)道318例重癥手足口病兒童細(xì)菌分離狀況，其中嗜血桿菌的分離率為20.1%。目前基層醫(yī)院對(duì)嗜血桿菌分布的研究資料不多，因此，有必要積極開展相關(guān)研究工作，有利于基層醫(yī)院對(duì)嗜血桿菌感染的預(yù)防控制和治療提供制定策略依據(jù)。

3 嗜血桿菌分型

正確的分型是嗜血桿菌致病性和流行調(diào)查研究基礎(chǔ)，通常有以下幾種方法:血清學(xué)分型，生物分型法，外膜蛋白分型，基因分型等。血清學(xué)分型的特點(diǎn)為快速簡(jiǎn)便,其局限性在于莢膜多糖抗原抗原性較弱,較難制備高特異性的抗血清，不易推廣；外膜蛋白分型，基因分型等分型方法雖然有較好的前景，但受限于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室條件，目前基層醫(yī)院仍難以普及。生物分型方法簡(jiǎn)單，并且試劑商品化，是一種比較經(jīng)典的方法，根據(jù)嗜血桿菌對(duì)吲哚、脲酶、鳥氨酸脫羧酶3個(gè)生化反應(yīng)不同，嗜血桿菌被分為生物型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ8個(gè)型。1982年Holmes等[9]用API 20E可以對(duì)HI進(jìn)行生物分型。Landgraf等[10]在對(duì)1 015份腦脊液分離的HI進(jìn)行生物學(xué)分型研究中，Ⅰ型占70.9%，Ⅱ型占27.5%。賴國(guó)祥等[11]報(bào)道兒童感染組和健康組咽拭子分離的鼻咽部HI學(xué)齡前組生物分型均以Ⅵ型(分別為37.5%和61.1%)占優(yōu)勢(shì),學(xué)齡組則均以Ⅰ型(分別為25.0%和41.2%)占優(yōu)勢(shì),與解靜平等[12]報(bào)道的肺炎患兒分離株和健康兒童咽拭子培養(yǎng)株均以Ⅱ型為主(分別占49%和45%)不同。有研究資料表明，兒童攜帶的HI有致病的傾向，致病菌株以HI血清b型為主，生物學(xué)分型和血清型與HI疾病有一定的關(guān)系[13-15]?；鶎俞t(yī)院采用簡(jiǎn)易的生物分型方法是值得推廣。

4 嗜血桿菌耐藥性

嗜血桿菌耐藥性在國(guó)外研究得比較早，1972年歐洲首次發(fā)現(xiàn)HI對(duì)氨芐西林耐藥之后，在世界各地相繼被報(bào)告，并有逐年上升趨勢(shì)，Kohno等[16]對(duì)HI作一項(xiàng)全球性抗菌藥物耐藥監(jiān)測(cè)調(diào)查，結(jié)果顯示HI耐藥率在不同國(guó)家差別較大，最低意大利為1.8%，韓國(guó)為64.7%。國(guó)內(nèi)研究和報(bào)道最多的也是HI對(duì)氨芐西林耐藥性,2002年楊永弘等[17]監(jiān)測(cè)HI對(duì)氨芐西林的平均耐藥率為9.6%(4.8%～14.4%)，2010年Mohnarin報(bào)告HI對(duì)氨芐西林的耐藥率上升至45.0%[18]。HI對(duì)氨芐西林耐藥率在感染患者年齡也有差異，CHINET 2010年監(jiān)測(cè)顯示兒童分離的HI對(duì)氨芐西林的耐藥率為35.1%[19]。HI對(duì)氨芐西林的耐藥機(jī)制，除了細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶所致外，部份β-內(nèi)酰胺酶陰性流感嗜血桿菌株也出現(xiàn)對(duì)氨芐西林耐藥狀況，主要是菌株細(xì)胞壁上一種或多種青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生改變，引起青霉素結(jié)合蛋白與靶位親和力降低，其次是外膜蛋白改變導(dǎo)致耐藥[20]，這些新耐藥機(jī)制出現(xiàn)給臨床選擇抗菌素帶來挑戰(zhàn)。

HI對(duì)四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲惡唑的耐藥率較高，有資料表明HI對(duì)這兩種抗菌素的耐藥是HI基因突變所致[20]。CHINET 2010年監(jiān)測(cè)HI對(duì)頭孢克洛、頭孢呋辛、頭孢噻肟耐藥率分別為2.3%、20.8%、15.2%[19]。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，HPI耐藥率也不斷增加。有報(bào)道HPI對(duì)氨芐西林為42.5%～65.2%[18，21]，HPI對(duì)氨芐西林的耐藥性主要與產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)，其機(jī)制由質(zhì)粒介導(dǎo)，部分為質(zhì)粒接合子，并攜帶完整的TnA型轉(zhuǎn)座子及其他耐藥基因；國(guó)內(nèi)報(bào)道從兒童分離的HPI產(chǎn)酶率差異也大，最高報(bào)道為37.8%[22]，產(chǎn)酶株的增加也是導(dǎo)致HPI出現(xiàn)多重耐藥性的重要因素。

5 結(jié)束語

隨著微生物檢驗(yàn)技術(shù)快速的發(fā)展，一些半自動(dòng)或全自動(dòng)的微生物鑒定儀器和藥敏分析系統(tǒng)在基層醫(yī)院得到應(yīng)用，使微生物檢測(cè)變得簡(jiǎn)易、快捷。因此，除了完成常見的簡(jiǎn)單的鑒定藥敏報(bào)告外，基層醫(yī)院加強(qiáng)苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)及其耐藥性監(jiān)測(cè)研究是細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢驗(yàn)一種要求。

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梁建芬，女，主管檢驗(yàn)師，主要從事微生物檢驗(yàn)研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.030

A 文章編號(hào)：1673-4130(2016)07-0946-03

2015-10-11)