結締組織生長因子在糖尿病視網膜病變中的調控機制及研究進展

梁曦達，王　光，陳曉隆

作者單位：(110004)中國遼寧省沈陽市， 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院眼科

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·文獻綜述·

結締組織生長因子在糖尿病視網膜病變中的調控機制及研究進展

梁曦達，王光，陳曉隆

作者單位：(110004)中國遼寧省沈陽市， 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院眼科

Regulatory mechanism and research progress of connective tissue growth factor in diabetic retinopathy

Xi-Da Liang, Guang Wang, Xiao-Long Chen

Department of Ophthalmology,Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Correspondence to:Xiao-Long Chen. Department of Ophthalmology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. chenxl@sj-hospital.org

Received：2015-12-23Accepted：2016-03-07

Abstract

?Diabetic retinopathy is one of the microvascular abnormal diseases. In the late stage of disease progression, the antibody of vascular endothelial growth factor can significantly inhibit the formation of new blood vessels and improve macular edema, which is widely used in clinical. However, the aggravation of pro-fibrotic influence after long-term treated by the medicine also attracts a wide range of attention. Connective tissue growth factor, as an important cytokine in intraocular fibrosis, over expressed after treated by the drug, is considered to be one of the most important factors in the side effect of the drug, and is also a potential therapeutic target. After finishing the current research, the regulation mechanism of connective tissue growth factor, includes two ways, regulation of gene expression and direct binding to other cell factors or receptors. Because of its special four module structure, it has many kinds of cell factor specific binding sites, and its regulation mode is more dependent on the latter, which promotes or inhibits the expression of several important cytokine pathways. In diabetic retinopathy, its expression goes throughout the disease process. The accumulation of connective tissue growth factor plays an important role in promoting the thickening of basement membrane and the formation of new blood vessels in the early stage of the clinical stage and the formation of the new blood vessels. In this paper, the regulatory mechanism of connective tissue growth factor and the research progress of this factor in DR are systematically expounded.

KEYWORDS:?connective tissue growth factor;diabetic retinopathy

Citation:Liang XD, Wang G, Chen XL. Regulatory mechanism and research progress of connective tissue growth factor in diabetic retinopathy.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(4):673-677

摘要

糖尿病視網膜病變是一種微血管循環(huán)異常的致盲性眼病。在疾病進展后期，血管內皮生長因子抗體類藥物因可顯著抑制新生血管形成和改善黃斑水腫而被廣泛應用于臨床。然而，藥物應用后纖維化趨勢的加重也引起了廣泛的關注。結締組織生長因子作為眼內纖維化的重要細胞因子，在藥物應用后過量表達，被認為是引起上述副反應的重要因素之一，也是一種潛在的輔助治療靶點。整理目前研究進展后發(fā)現(xiàn)，結締組織生長因子的調控機制包括調控下游細胞因子基因表達和直接結合于其他細胞因子或受體兩種方式。因其特殊的四模塊結構上具有多種細胞因子特異結合位點，其調控方式多依賴于后者，進而促進或抑制了多種重要細胞因子通路的表達。在糖尿病視網膜病變中，其表達貫穿整個疾病進程。在臨床前期和新生血管形成末期，結締組織生長因子的累積分別起到促進基底膜增厚和新生血管纖維化形成的重要作用。本文將對結締組織生長因子多樣化的調控機制及該因子在DR中的研究進展進行系統(tǒng)闡述。

關鍵詞：結締組織生長因子；糖尿病視網膜病變

引用：梁曦達，王光，陳曉隆.結締組織生長因子在糖尿病視網膜病變中的調控機制及研究進展.國際眼科雜志2016;16(4):673-677

0引言

糖尿病視網膜病變(dibetic retinopathy, DR)是一種嚴重糖尿病微血管并發(fā)癥。據(jù)一項2015年的調查顯示，我國DR的發(fā)病率達1.8%/人年[1]。最新的流行病學調查顯示，高血糖和基因遺傳是較高血壓和異常脂類代謝相比更為重要的兩項DR危險因素[2]。其致病機制主要包括：(1)多元醇代謝通路異常；(2)晚期糖基化終產物形成；(3)蛋白激酶C的激活;(4)活性氧的產生；(5)遺傳因素[3]。在高糖和組織缺氧狀態(tài)下，視網膜微血管擴張，血-視網膜屏障被破壞，新生血管形成，視網膜前纖維血管膜的形成，最終造成牽拉性視網膜脫離。結締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)作為眼內纖維化的重要始動及調節(jié)因子，在DR的基底膜增厚，周細胞凋亡與遷移，肌成纖維細胞的過量聚集和細胞外基質的堆積和重構等多項病理改變中均有參與。

1 CTGF分子結構及調控機制

1.1 CTGF/CCN家族結構CCN家族的提出始于1990年代末期，最初其表達的蛋白被歸于早期基因的產物或生長因子。最早發(fā)現(xiàn)的成員包括富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich protein 61, Cyr61)，CTGF，腎母細胞過度表達基因(nephroblastoma-overexpressed, NOV)。其生物學作用覆蓋發(fā)育分化，血管生成，組織纖維化，炎性作用，腫瘤生長等多個領域[4]。其中，CTGF又名CCN2，是一種可刺激成纖維細胞增殖和膠原沉積的生長因子，在成人心血管、腦、胎盤、皮膚、腎、肝、肺及胰腺等多種組織中均有表達, 其中以腎臟組織中含量最為豐富[5]。目前發(fā)現(xiàn)的CCN家族成員包含Cyr61、CTGF、NOV、CCN4、CCN5、CCN6。除CCN5缺失部分模塊外，其余家族成員均具有特征性四模塊結構。CCN家族成員由胰島素樣生長因子結合區(qū)(IGFBP)和Von Wille因子C型重復區(qū)(VWC)，血小板反應蛋白I型重復區(qū)(TSP-1)和生長因子半胱氨酸群(CT)四個模塊組成。每個模塊都具有其獨特的結合位點，中間由鉸鏈區(qū)域連接，兩側各有兩個模塊，稱之為“-NH2末端”和“-COOH末端”。在金屬基質蛋白酶類(matrix metalloproteinases, MMPs)的水解作用下，CTGF的鉸鏈結構斷裂，分解為CTGF-N末端和CTGF-C末端，而彈性蛋白酶和血纖維蛋白溶酶可使CTGF水解為四個獨立片段[6-8]。

1.2 CTGF/TGF-β通路轉化生長因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)是CTGF最為人熟知的上游細胞因子，其通過絲裂原活化蛋白激酶等多個通路誘導CTGF的表達，共同誘導細胞外基質的產生[9]。不僅如此，TGF-β與CTGF還具有直接作用關系。研究人員在CTGF的VWC模塊發(fā)現(xiàn)了TGF-β1和骨成型蛋白質-4(bone morphogenetic protein-4, BMP-4)的結合位點。CTGF與TGF-β1的結合不會抑制TGF-β1/TGF-β受體(TGF-β1/TGF-βR)通路，反而會促進TGF-β1與受體結合及下游因子的表達。值得注意的是，CTGF與TGF-β1的結合親和力較低，且CTGF激活TGF-β1通路有若干條件限制，如受體和細胞膜結合，Smad2磷酸化，基因表達活化等。然而，CTGF的VWC模塊與BMP4結合后，可減少BMP4與BMP4同源受體的結合來抑制BMP4信號通路。這種效應可被BMP2和TGF-β1競爭性抑制[10]。

纖連蛋白選擇性剪接區(qū)域A(fibronectin- extra domain A，F(xiàn)N-EDA)是纖維連接蛋白mRNA的選擇性剪接區(qū)域發(fā)生保留性剪接產生，在血管內皮細胞向間質細胞轉化中起到重要作用。人們在視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium, RPE)中發(fā)現(xiàn)完整CTGF和CTGF-N末端均可輔助TGF-β2/TGFβRII對FN-EDA的激活作用，使其表達增加，但兩者均不能直接激活FN-EDA的表達。TGF-β2可與CTGF-N末端結合驗證了這一結論。而CTGF-C末端可與TGFβRII結合，在給予CTGF-N單克隆抗體后，CTGF-C的過表達可抑制TGF-β2對FN-EDA的促進作用，可能與CTGF-C末端競爭性抑制TGFβRII有關。另外，大量激活的FN-EDA可促進MMPs的產生，進一步促進了CTGF水解為CTGF-N末端和CTGF-C末端[11]。

1.3 CTGF與MMPsMMPs是一類鋅指肽鏈內切酶，在細胞外基質的蛋白多糖、膠原蛋白等大分子的生理反轉和病理降解中有關鍵作用。不僅如此，MMPs的底物還可以是細胞因子，如CTGF、單核細胞趨化蛋白-3(monocyte chemoattractant protein-3,MCP-3)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、Fas配體和胰島素樣生長因子結合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein-3,IGFBP-3)等。其中，MMP-1，-2，-3，-7，-9，-13均可作用于CTGF的鉸鏈區(qū)，使之水解斷裂為CTGF-N末端和CTGF-C末端[12]。在MMPs水解CTGF后，對于CTGF-C末端是否會繼續(xù)降解存在爭議。早在1998年，人們就在血清、腦脊液和腹水中觀察到了CTGF降解產物，大小為32、24、18kD[13]。體外實驗中發(fā)現(xiàn)，-COOH末端約為10kD，激活了成纖維細胞和平滑肌細胞中的DNA合成。但在MMPs水解后的產物中，未發(fā)現(xiàn)類似CTGF-C末端產物，可能此過程中還有其他蛋白酶類參與CTGF-C末端的形成和降解過程[14]。

除水解作用外，CTGF與MMPs還具有相互調控機制。在軟骨細胞中 CCN2可誘導MMP-9和MMP-13的表達[15]。研究者還發(fā)現(xiàn)CCN2通過腫瘤抑制基因p53促進MMP2基因的轉錄活性來參與視網膜新生血管形成[16]。不僅如此，在細胞外基質重構中發(fā)揮作用的MMP-3，最近被發(fā)現(xiàn)可入細胞核，直接調控CTGF的轉錄過程，從而促進CTGF和其mRNA的表達[17]。

1.4 CTGF與VEGF在組織的損傷和修復中，新生血管的形成和纖維化的形成是愈合的兩個階段。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和CTGF，作為各自的關鍵細胞因子，兩者間的相互作用機制較為復雜。在增殖性糖尿病視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy, PDR)等多種疾病中，CTGF和VEGF的表達均升高，但兩者濃度無明顯相關性[18]。在細胞實驗中，CTGF可以被VEGF-A誘導產生[19]。在大鼠實驗中，給予糖尿病大鼠CTGF mi-RNA治療后，CTGF mRNA和CTGF蛋白的濃度均顯著下降，但纖連蛋白和VEGF mRNA水平并無影響。這似乎暗示了CTGF可能為VEGF的下游細胞因子[20]。然而研究顯示，CTGF的表達與VEGF，TGF-β，視網膜細胞凋亡有密切相關。且CTGF的過表達發(fā)生于8～10wk,早于VEGF和TGF-β的12wk[21-22]。這提示CTGF應該有除VEGF和TGF-β之外更早出現(xiàn)的啟動因子。

與TGF-β、BMP-4結合機制相似，VEGF也被發(fā)現(xiàn)了與CTGF的結合位點。CTGF與VEGF的結合位點位于TSP-1模塊[9]，研究發(fā)現(xiàn)CTGF可與VEGF165結合，形成CTGF-VEGF165復合體，進而抑制VEGF165的活性表達。與此同時，MMPs可水解CTGF-VEGF165復合體[12]。VEGF可被胰蛋白酶降解，但對MMPs家族的水解作用不敏感。因此推測，MMPs通過水解CTGF-VEGF復合體，恢復了VEGF的活性[23]。

在DR中，VEGF抗體使用后CTGF的含量引發(fā)了關注。有文獻認為，在疾病早期，VEGF抗體的使用可以減少CTGF的表達。而在PDR期，有研究顯示VEGF抗體的臨床應用可以在抑制VEGF的含量同時增加CTGF的含量，而CTGF-shRNA的應用可以同時抑制CTGF和VEGF的含量[22,24]。最新研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF-A過度表達的CTGF通過鉸鏈區(qū)與甲酰肽樣受體-1(formyl peptide receptor-like,FPRL1)結合，促進了VEGF的新生血管形成作用[25]。

總之，CTGF可被VEGF-A誘導產生，過度表達的CTGF既可通過與FPRL1的結合，促進VEGF的新生血管形成作用，也可通過與VEGF-165的結合抑制VEGF的表達活性，該效應可被MMPs削弱。但目前尚未發(fā)現(xiàn)CTGF在基因表達層面對VEGF表達的抑制作用。另外，在PDR期，VEGF抗體的使用可顯著增加CTGF的含量，這種現(xiàn)象可能由于CTGF-VEGF165復合體在VEGF抗體作用下的分離。

2 DR中的CTGF

2.1 臨床前期及非增殖期改變DR的早期改變可出現(xiàn)在臨床癥狀之前，包括毛細血管基底膜的增厚，周細胞的損傷和無細胞毛細血管的形成。多項研究認為，基底膜增厚是DR早期的特征性改變，且周細胞的損傷和無細胞毛細血管的形成都與之相關。CTGF的表達是毛細血管基底膜增厚的重要誘導因子，抑制CTGF的表達可減少周細胞的損傷和無細胞毛細血管的形成，延緩了DR中毛細血管基底膜的增厚變化[26]。TGF-β通路通過上調血漿酶原激活酶抑制因子-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)，Smad7和纖連蛋白等下游靶基因的表達，在臨床前期DR的毛細血管基底膜增厚中起重要作用。TGF-β的表達主要活躍在視網膜內皮細胞和周細胞中，且CTGF mRNA在周細胞中亦有表達[27]。這一結果提示，CTGF在基底膜增厚中的作用可能與上文所述的CTGF/TGF-β協(xié)同作用機制有關。

CTGF在DR早期周細胞損傷中作用被多項研究證實。一些研究者認為，CTGF和視網膜細胞凋亡指數(shù)正相關，和周細胞減少比例正相關。且CTGF的表達早于微循環(huán)和周細胞數(shù)目的改變[28]。在大鼠周細胞中，CTGF和CCN1存在抗周細胞黏附和促周細胞凋亡的活性。另外，磷酸酶抑制劑可反轉上述作用，說明CTGF和CCN1的作用可能與去磷酸化相關[29]。

2.2新生血管形成期CTGF作為重要促纖維化形成因子，在DR患者新生血管形成過程中表達顯著提高，但其是否參與新生血管的形成過程至今仍有爭議。在體外實驗中，Kita等[18]認為CTGF與牛視網膜內皮細胞的增殖，遷移及孵化于真皮成纖維細胞的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的體外血管形成過程無關。然而，Shimo等[30]和He等[31]的結果都提示CTGF雖不直接促進HUVECs和脈絡膜內皮細胞的增殖，卻可調控HUVECs的遷移和體外管腔形成。 Lee等[25]發(fā)現(xiàn)了CTGF在VEGF-A調節(jié)新生血管形成中的協(xié)同作用。在HUVECs中，VEGF-A可與細胞膜上VEGFR直接結合，促進HUVECs的增殖、遷移和血管結構形成過程。與此同時，VEGF-A誘導的過度表達的CTGF可通過鉸鏈區(qū)與FPRL1的結合，激活了細胞外信號調節(jié)激酶、磷酸化和細胞內鈣離子濃度，進一步促進了HUVECs的遷移和血管結構形成過程。另外，MMP-2可通過激活p53相關基因促進CTGF表達，且在新生血管形成早期的基底膜降解，細胞外基質異常堆積等改變中作用顯著[16]。

2.3纖維血管膜形成期CTGF在纖維化形成過程中有重要推動和調節(jié)作用[32]。特定的上游因子激活CTGF的初始表達后，過度表達的CTGF與TGF-β等通路的共同作用，促進細胞外基質重構因子的表達，其中包括大量膠原蛋白。在重建過程中，α-平滑肌肌動蛋白陽性肌成纖維細胞(α-smooth muscle actin myofibroblasts，α-SMA myofibroblasts)可以通過自分泌機制產生CTGF，同時α-SMA陽性肌成纖維細胞也是纖維化進程的核心細胞介質[6]。

在對PDR患者的視網膜前纖維血管膜免疫組化實驗中發(fā)現(xiàn)其中聚集了大量的肌成纖維細胞。CTGF在PDR患者纖維血管膜中的表達主要集中于血管內皮細胞和肌成纖維細胞，并通過局部旁分泌和自分泌途徑調節(jié)血管新生-纖維化過程[33-34]。深入研究發(fā)現(xiàn)，在PDR患者眼內，血管內皮細胞和循環(huán)纖維細胞可轉化為肌成纖維細胞，并參與病理性纖維化的形成。CTGF在血管內皮細胞向α-SMA陽性肌成纖維細胞轉化時所起到重要推動作用[35]。

在PDR患者視網膜纖維血管膜中，CTGF-N末端在活躍的PDR患者和DR伴玻璃體出血患者中大量表達，多于非糖尿病患者，完整CTGF在各組中相同，CTGF-C末端低于可檢測閾值。且CTGF-N末端多位于SMA活化肌成纖維細胞中[36]。

纖維血管膜是PDR患者視網膜新生血管的最終形式，但新生血管向纖維增殖膜轉換的時機和調控機制一直未被發(fā)現(xiàn)。在PDR終末期，VEGF隨纖維化的逐漸發(fā)展?jié)舛冉档?，而CTGF與纖維化程度明顯相關[37]。隨后提出，CTGF/VEGF和CTGF值是評估視網膜纖維化程度最強預測指標[38]。這項結論還需要進一步研究給予理論支撐和臨床證實。

3其他CCN家族因子的功能及與DR的關系

3.1 Cyr61Cyr61與CTGF具有相似的結構，經常兩者共同出現(xiàn)參與細胞黏附、細胞增殖、新生血管形成等。Cyr61是血管生長和正常血管結構形成的重要因子。CTGF具有促纖維化形成傾向，而Cyr61似乎傾向于纖維化的消融。有研究者認為Cyr61與VEGF共同調控了CCN2因過度表達出現(xiàn)的纖維化傾向[37]。

Cyr61在DR中的作用尚不明確?？梢源_定的是Cyr61是高糖和晚期糖基化終產物的下游因子[29，39]。Cyr61在炎癥和缺氧狀態(tài)下可轉變?yōu)榧庸虪顟B(tài)或稱翻譯后縮短狀態(tài)，這種縮短狀態(tài)的Cyr61生物活性與原Cyr61蛋白不同，并且可能是Cyr61在疾病條件下的表達狀態(tài)，因此這種縮短狀態(tài)的Cyr61可能與PDR相關[40]。

3.2 NOVNOV作為目前CCN家族中唯一可以與CTGF形成二聚體的家族成員，兩者具有直接作用關系。在軟骨細胞和滑液細胞中，多研究證實NOV拮抗了CTGF在成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化中的作用。眼內是否存在相似機制需要進一步的實驗發(fā)現(xiàn)[6]。

4結語

CTGF，最初以細胞生長因子的身份為人熟知，但人們一直未發(fā)現(xiàn)其特異細胞膜受體。其對于周細胞衰老和遷移、基底膜增厚、肌成纖維細胞的聚集和細胞外基質的堆積和重構等作用多通過與其他細胞因子在其四個模塊上的特異性結合，促進或抑制該基因通路的表達來實現(xiàn)。CTGF基因敲除的小鼠不能存活，說明其在皮膚、血管、肝脾等多器官發(fā)育中作用不可或缺。但在生理狀態(tài)下，CTGF含量常在可檢測閾值以下。而在病理環(huán)境中，CTGF含量變化顯著，似乎可以成為一種機體的異常信號。CTGF被MMPs水解后，CTGF-N末端和CTGF-C末端各自扮演了與完整CTGF不同的角色。有文獻認為，CTGF-N末端作用于膠原蛋白系統(tǒng)的分化，而CTGF-C末端作用于DNA合成和細胞增殖[8]。在增殖期DR中，玻璃體腔CTGF-C末端未被檢測出，有研究發(fā)現(xiàn)其能與TGF-β2受體特異性結合，在CTGF-N末端抗體的應用下對TGF-β2通路起抑制作用[11]，其去向需要進一步研究證實。

CTGF的表達與DR的發(fā)生發(fā)展關系密切。在DR臨床前期，CTGF的異常表達可能為疾病的發(fā)生起到重要的提示預警作用。但由于眼內CTGF含量與血液CTGF含量未見明顯相關性，眼內CTGF濃度的簡易、低廉的檢測手段有待進一步發(fā)現(xiàn)。在PDR期，CTGF的眼內濃度與眼內纖維增殖程度具有一定相關性。CTGF的濃度可于玻璃體切割術中取樣檢測，為術后并發(fā)牽拉性視網膜脫離提供一定的風險評估。以上設想尚需進一步的理論證實和臨床檢測技術支持。在增殖期DR末期，VEGF的濃度呈下降趨勢，這可能與CTGF的不斷表達并與VEGF結合并抑制其活性有關。而應用VEGF抗體后，VEGF-CTGF復合體的解離或可解釋CTGF在玻璃體腔濃度的增加，并成為纖維化趨勢的重要原因。同時，CTGF的家族成員多與CTGF相互作用，共同調節(jié)纖維化進程。對于DR中，新生血管-纖維化的調控開關能否被CTGF抑制劑逆轉尚需要深入研究予以驗證和發(fā)現(xiàn)。

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DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.4.21

收稿日期：2015-12-23 修回日期： 2016-03-07

通訊作者：陳曉隆，博士，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導師，研究方向：眼底病、眼外傷.chenxl@sj-hospital.org

作者簡介：梁曦達，男，在讀碩士研究生，研究方向:眼底病。