蛋白質組學應用于早期妊娠流產(chǎn)的研究進展

姚婷，侯海燕，陳娟，陳亞瓊

·綜述·

蛋白質組學應用于早期妊娠流產(chǎn)的研究進展

姚婷，侯海燕，陳娟，陳亞瓊△

妊娠過程類似于半同種異體移植，母胎界面的功能失調與早期妊娠流產(chǎn)，如早期自然流產(chǎn)、復發(fā)性流產(chǎn)等有關，但具體發(fā)病機制仍不十分清楚。蛋白質組學是通過高通量、快速鑒定與定量分析細胞、組織、體液中的所有蛋白質組成、功能及蛋白之間的相互作用的學科，將蛋白質組學應用于早期妊娠流產(chǎn)病理機制研究，發(fā)現(xiàn)早期妊娠流產(chǎn)與胎盤滋養(yǎng)細胞的侵襲力不足、母胎界面血管形成異常、氧化應激、母胎界面免疫功能失調、凝血功能異常、肥胖等有關，有利于相關疾病的早期診斷。將蛋白質組學應用于不明原因復發(fā)性流產(chǎn)（URSA）的治療研究，發(fā)現(xiàn)淋巴細胞主動免疫療法可通過調整并恢復患者的免疫狀態(tài)，從而維持妊娠，改善妊娠結局。綜述蛋白質組學及其在早期妊娠流產(chǎn)中的應用。

蛋白質組學；流產(chǎn)，自然；流產(chǎn)，人工；診斷

妊娠過程是一個復雜、精細而又相互協(xié)調的過程，胚胎作為一種半同種異體抗原組織，從受精卵成功著床到胎兒的順利娩出，離不開母胎界面的免疫耐受作用，若母胎界面的功能失調，可能導致妊娠期相關疾病的發(fā)生，如早期自然流產(chǎn)、復發(fā)性流產(chǎn)、胎兒生長受限、妊娠期高血壓疾病、羊膜腔感染、胎膜早破、早產(chǎn)等，嚴重影響母胎的生命安全。蛋白質組（proteome）是指一個細胞或組織中由基因組表達的全部蛋白質，最早由澳大利亞科學家Wilkins等[1]提出，而蛋白質組學（proteomics）是以某一類型細胞、組織、體液中的所有蛋白質為標本，大規(guī)模、高通量、系統(tǒng)研究全部蛋白的組成、功能及其蛋白之間相互作用的學科[2]，現(xiàn)已廣泛應用于醫(yī)學領域，如肝病[3]、心臟疾病[4]等。將蛋白質組學應用于早期妊娠流產(chǎn)，以滋養(yǎng)細胞、絨毛組織、蛻膜組織、胎盤組織、羊水、血清等為標本，可以從分子水平研究相關疾病的發(fā)生機制，尋找生物標志物，以便早期診斷，更好地管理整個妊娠過程，改善妊娠結局。

1 蛋白質組學的概況

蛋白質組學是分子研究終點，也是對生物體性狀的最直接反映，其研究內容主要包括表達蛋白質組學、結構蛋白質組學、功能蛋白質組學。其研究步驟包括：收集標本，制備樣品，提取樣品中的全部蛋白，再選擇適宜的技術，如：雙向電泳技術、液相色譜技術、層析技術、超離技術、質譜技術、免疫共沉淀技術、酵母雙雜交技術、蛋白質芯片技術、同位素標記相對和絕對定量技術、生物信息學分析等[5]，找出差異蛋白及其相關信號通路，進而為揭示生命本質，為疾病的早期診斷提供生物標志物。

2 蛋白質組學在早期妊娠流產(chǎn)中的應用

2.1 早期自然流產(chǎn)早期自然流產(chǎn)是指妊娠在12周以前自行終止，胎兒體質量＜1 000 g，發(fā)生率約為12%，引起早期自然流產(chǎn)的原因復雜，主要包括：夫婦雙方或一方的染色體或胎兒的染色體異常；孕婦高齡；孕婦存在黃體功能不全、多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能異常等基礎疾?。簧车澜馄十惓?；生殖道感染；母胎界面免疫耐受失調等[6]。

盡管導致早期自然流產(chǎn)的原因很多，但仍有一部分原因不明，將蛋白質組學應用于早期自然流產(chǎn)，找出與流產(chǎn)相關的關鍵蛋白，可深入研究早期自然流產(chǎn)的發(fā)生機制。2006年Liu等[7]用熒光染色雙向凝膠電泳找出6例早期自然流產(chǎn)和6例正常妊娠要求行人工流產(chǎn)術患者胎盤絨毛組織的差異蛋白，并用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI-TOF/ MS）分析鑒定出13種表達下調蛋白，5種表達上調蛋白，這些蛋白與細胞的氧化應激，細胞增殖、分化、凋亡，以及蛋白水解等有關，參與早期自然流產(chǎn)的發(fā)生。2014年Ni等[8]提取了5例早期自然流產(chǎn)患者和5例正常妊娠要求行人工流產(chǎn)術者的胎盤絨毛組織中全部蛋白，用高效液相色譜-質譜聯(lián)用同位素標記法等技術，搜索人類國際蛋白質索引（International Protein Index，IPI）數(shù)據(jù)庫，共鑒別出3 423種蛋白，其中51種差異表達蛋白，經(jīng)過生物信息學技術分析這些差異蛋白中12種蛋白分子可能參與自發(fā)性流產(chǎn)的生物過程，包括上調表達的TBC1D13、LARP4B、AHSG、P4HA2和BCS1L蛋白分子，下調表達的GSTM2、CUL7、NES（nestin）、RASIP1、SLC30A2、PBXIP1和FAM21，其中NES、AHSG、BCSIL、GSTM2和CUL7參與滋養(yǎng)細胞的分裂與凋亡過程，NES、P4HA2、PBXIP1和GSTM2與滋養(yǎng)細胞浸潤子宮內膜能力有關，NES、CUL7、RASIP1、P4HA2和AHSG則參與母胎界面的血管形成，推測這些差異表達的蛋白是早期自然流產(chǎn)的分子體現(xiàn)，參與了早期自然流產(chǎn)的過程。因此，早期自然流產(chǎn)的發(fā)生可能與胎盤滋養(yǎng)細胞的侵襲力不足，母胎界面血管形成異常，氧化應激等有關。

2.2 復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）RSA是指與同一配偶發(fā)生連續(xù)3次或3次以上自然流產(chǎn)，其再次妊娠流產(chǎn)率達50%～70%，引起RSA的原因有染色體異常、內分泌失調、生殖道解剖異常、生殖道感染、凝血功能異常、環(huán)境因素和自身免疫性疾病等，但仍有50%的RSA患者原因不明[9]。

隨著蛋白質組學廣泛應用于臨床研究，有很多研究者將其應用于RSA，以期找到不明原因RSA（URSA）患者的相關差異蛋白，針對流產(chǎn)原因給予相應的處理方法，防止流產(chǎn)的再次發(fā)生。臨床上，相對于羊水、卵泡液等，血液樣本較易取得，患者也較認可，Kim等[10]收集3例有URSA史和3例有生育史、無流產(chǎn)史健康婦女的血液，采用雙向差異凝膠電泳（2-DE）及MALDI-TOF/MS技術，找出22個差異蛋白，其中5個蛋白能被蛋白質印跡法（western blot）印證，而胰蛋白酶抑制劑重鏈H4（inter-a trypsin inhibitor-heavy chain 4，ITI-H4）表達最具有差異性。另有研究發(fā)現(xiàn)，RSA的發(fā)生與輔助性T細胞1（Th1）/Th2比例失衡有關[11]，即Th1細胞升高，Th2細胞降低，Th2細胞與白細胞介素6（IL-6）細胞因子表達呈正相關[12]，故RSA患者體內的IL-6表達顯著下降，而ITI-H4又可調節(jié)IL-6的表達[13]，推測RSA患者中差異表達的ITI-H4可能與IL-6、Th2有關，可作為RSA的標志物，有助于RSA的早期診斷。

胚胎是由卵子與精子結合形成的受精卵分化發(fā)育而來，卵泡液是卵子生成發(fā)育成熟的內環(huán)境，與卵子的質量、受精能力及胚胎質量有關，為了研究卵泡液與RSA的相關性，Kim等[14]抽取3例RSA患者及3例正常對照者的卵泡液，采用2-DE及MALDITOF-MS技術，發(fā)現(xiàn)RSA患者補體C3c E鏈、γ纖維蛋白原、抗凝血酶、血管緊張素原及血紅素結合蛋白表達下調，且γ纖維蛋白原、抗凝血酶2種蛋白被Western blot、逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）及實時PCR印證。研究發(fā)現(xiàn)，γ纖維蛋白原，抗凝血酶均與凝血功能有關，而凝血功能障礙則可能導致RSA的發(fā)生[15]。纖維蛋白原是一種血糖蛋白，有α纖維蛋白原、β纖維蛋白原、γ纖維蛋白原3種不同結構，血漿低纖維蛋白原血癥與早期流產(chǎn)[16-17]、出血[17]及傷口愈合障礙[18]有關。在敲除編碼γ纖維蛋白原基因的小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白原通過維持小鼠母胎界面的血液循環(huán)及胚胎植入保持母胎界面功能穩(wěn)定，維持小鼠妊娠[19]?？鼓甘且环N絲氨酸酶抑制劑，調控血液的凝固和纖維蛋白的溶解，獲得性或遺傳性的抗凝血酶缺乏都會增加孕婦血栓形成風險，導致自然流產(chǎn)、RSA等妊娠期并發(fā)癥的發(fā)生[20]。而卵泡液中γ纖維蛋白原，抗凝血酶缺乏導致RSA相關機制仍需進一步研究。

另有研究發(fā)現(xiàn)肥胖與RSA有關[21-22]。Metwally等[23]收集16例RSA患者（12例肥胖，4例體瘦）和5例正常育齡婦女（2例肥胖，3例體瘦）的子宮內膜，采用雙向差異凝膠電泳及主成分分析發(fā)現(xiàn)：RSA患者與正常對照者比較，肥胖RSA患者與體瘦RSA者比較，結合珠蛋白表達量有差異，肥胖RSA患者的結合珠蛋白表達量較體瘦RSA者上調。結合珠蛋白是在肝臟合成的一種糖蛋白，其主要作用是結合多余的血紅蛋白以預防血管內溶血[24]。也有研究表明結合珠蛋白與胚胎植入及肥胖有關[25-26]，肥胖個體的脂肪細胞處于缺氧狀態(tài)，會釋放出一系列包括結合珠蛋白在內的炎性標記物，由于肥胖的RSA患者長期處于炎性狀態(tài)，在胚胎種植期間子宮內膜產(chǎn)生過多的炎性物質攻擊胚胎，從而導致體質量指數(shù)（BMI）偏高的育齡期婦女RSA的發(fā)生，且炎性標記物結合珠蛋白的濃度與體質量指數(shù)呈正相關。另外肥胖RSA患者與體瘦RSA者比較甲狀腺素運載蛋白、β-球蛋白表達是上調的[23]，這可能與處于慢性炎性狀態(tài)的肥胖RSA患者母胎界面血管功能障礙有關。因此，肥胖是RSA的危險因素，對于肥胖的育齡期婦女必須控制體質量，改善體內炎性狀態(tài)，減少不良妊娠結局的發(fā)生。

由于RSA的復發(fā)率高，臨床上針對不同的病因，出現(xiàn)了不同療法，如：孕激素治療、免疫抑制療法、抗血小板聚集療法、淋巴細胞主動免疫治療、低分子肝素治療、靜脈滴注免疫球蛋白治療等，其中淋巴細胞主動免疫治療使得URSA患者妊娠成功率達到90%以上[27]，但其療效機制仍不清楚。為了闡明淋巴細胞主動免疫治療的療效機制，從以下3方面考慮：①正常妊娠是一種成功的“半同種移植”，母體的免疫耐受機制維持了胎兒的存活。②URSA是妊娠免疫耐受機制發(fā)生了失衡所致[28]。③淋巴細胞主動免疫療法可以使約90%URSA患者維持正常妊娠[27]。高克非等[29]選取50例RSA患者和同期48例正常初次妊娠的早孕婦女為研究對象，應用蛋白質芯片和表面增強激光解析電離飛行時間質譜（surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF/MS）技術檢測血清蛋白質譜，結果顯示，正常早孕與URSA免疫治療前比較有82個差異蛋白，URSA免疫治療后與免疫治療前比較有35個差異蛋白，兩者的“交集”蛋白有16個，提示正常妊娠和URSA免疫治療后存在相似的且與URSA免疫治療前相反的免疫耐受狀態(tài)，而對得到的相關蛋白進一步的純化、鑒定、印證，可以揭示妊娠免疫耐受的網(wǎng)絡核心機制以及免疫治療的療效機制。

3 結語

近年蛋白質組學研究發(fā)展迅速，廣泛地應用于各個領域，由于蛋白質本身結構復雜，強酸性、堿性、低豐度、難溶性蛋白質的分離仍是蛋白質組學的研究難點，需要在技術上進一步突破。一次或多次的早期妊娠流產(chǎn)排除如染色體異常等相關已知病因外，許多患者病因不明，但多與母胎界面的功能狀態(tài)有關，運用蛋白質組學技術尋找與母胎界面功能相關的差異蛋白可以更好地闡述早期妊娠流產(chǎn)的病理生理機制，有助于早期妊娠流產(chǎn)的早期預警和早期診斷，有助于提前采取有效的干預措施，防止早期妊娠流產(chǎn)的發(fā)生，提高孕產(chǎn)婦及圍生兒的生存率。

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Progress of Proteomics Applied to the Early Pregnancy Abortion

YAO Ting,HOU Hai-yan,CHEN Juan,CHEN Ya-qiong. Graduate School,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193,China（YAO Ting）；Department of Obstetrics and Gynecology,Affiliated Hospital of the Chinese People's Armed Police Force Logistics College,Tianjin 300162,China（YAO Ting, HOU Hai-yan,CHEN Juan,CHEN Ya-qiong）

CHEN Ya-qiong,E-mail:chenyq82@hotmail.com

Pregnancy is similar to semi allograft transplantation，the imbalance of the maternal-fetal interface coordination is closely related to early pregnancy abortion，such as：early spontaneous abortion,recurrent spontaneous abortion,but the pathogenesises are unclear.Proteomics is a scientific discipline which can analysis the composition,function and the relationship among proteins in cells，tissues，body fluids in a high flux,quickly identify，quantitative analytic way.The research that proteomics apply to early spontaneous abortion discovers that the pathogenesis relates to the superficial invasion of the trophocyte,the disfunction of the maternal-fetal vascular formation，oxidative stress，the maternal-fetal immune disfunction，the coagulation disorders,obesity and so on，it is benefit for early diagnosing.The research that proteomics apply to unexplained recurrent spontaneous abortion discovers that lymphocyte immunotherapy can maintain pregnancy and improve the outcomes of the pregnancy through improving the immune status.Now a review on proteomics and its application in early pregnancy abortion will be presented.

Proteomics；Abortion，spontaneous；Abortion，induced；Diagnosis（J Int Obstet Gynecol，2016,43：699-702）

2016-06-16）

[本文編輯秦娟]

300193天津中醫(yī)藥大學研究生院（姚婷）；武警后勤學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（姚婷，侯海燕，陳娟，陳亞瓊）

陳亞瓊，E-mail：chenyq82@hotmail.com

△審校者