糖化血紅蛋白檢測標(biāo)準(zhǔn)化方法學(xué)評價

于 強(qiáng)，汪詠新，吳新華

(1.江西省九江市第三人民醫(yī)院 332000；2.新疆維吾爾自治區(qū)克孜勒蘇柯爾克孜

自治州人民醫(yī)院臨檢中心 845350)

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·個案與短篇·

糖化血紅蛋白檢測標(biāo)準(zhǔn)化方法學(xué)評價

于 強(qiáng)1，汪詠新2，吳新華2

(1.江西省九江市第三人民醫(yī)院 332000；2.新疆維吾爾自治區(qū)克孜勒蘇柯爾克孜

自治州人民醫(yī)院臨檢中心 845350)

標(biāo)準(zhǔn)化； 方法學(xué)評價； 糖化血紅蛋白

糖尿病發(fā)病率多年來呈不斷上升趨勢，已經(jīng)嚴(yán)重危害到人類健康。中國已成為世界上糖尿病患者最多的國家，因此，盡早發(fā)現(xiàn)糖尿病并及時干預(yù)尤為重要。糖化血紅蛋白(HbA1c)水平可反映過去8～12周血糖水平，是評價血糖控制水平的“金標(biāo)準(zhǔn)”，世界衛(wèi)生組織正式推薦HbA1c≥6.5%作為糖尿病診斷切入點。美國糖尿病協(xié)會(ADA)頒布的最新指南將HbA1c作為糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，并將其作為判斷血糖控制效果的評價指標(biāo)[1]。

1 HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法

1.1 離子交換色譜法 血紅蛋白β鏈N末端纈氨酸糖基化后，總HbA1c與血紅蛋白A在酸性溶液中都具有陽離子特征，血紅蛋白A所帶正電荷比總HbA1c高。分別用pH 6.8和pH 6.4的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫，將血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白后圖譜分析，HbA1c用百分率表示。

1.2 等電點聚集法 根據(jù)兩性電解質(zhì)形成連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度進(jìn)行電泳。血紅蛋白中各組分會遷移到對應(yīng)等電點pH上，然后通過微量光密度儀，進(jìn)行掃描分析，便可精確地對每個組分進(jìn)行定量測定。

1.3 瓊脂凝膠電泳法 由于血紅蛋白不同結(jié)構(gòu)所帶電荷情況不同，使其在瓊脂糖凝膠上電泳遷移速度不同，從而達(dá)到分離的目的。

1.4 免疫法

1.4.1 免疫比濁法 采用抗原、抗體反應(yīng)原理進(jìn)行測定。在血紅蛋白β鏈N末端，可用單克隆抗體或多克隆抗體，特異識別其抗原表位，結(jié)合比色或比濁法算出HbA1c水平。

1.4.2 膠乳凝集法 由于HbA1c與特異性單克隆抗體、膠乳結(jié)合發(fā)生凝集，凝集量可用全自動生化分析儀檢測吸光度變化，求出HbA1c水平。

1.4.3 化學(xué)發(fā)光法 HbA1c用熒光標(biāo)志物進(jìn)行特異性標(biāo)記，連接陰離子復(fù)合物，用帶有正電荷的纖維吸附，后用洗脫液洗脫，檢測熒光強(qiáng)度，求出HbA1c水平。

1.4.4 酶法 檢測原理采用蛋白酶特異性將HbA1c的β鏈N末端糖化二肽進(jìn)行酶切，后通過果糖基肽氧化酶作用使糖化二肽生成氧化氫，在過氧化酶作用下與顯色劑結(jié)合產(chǎn)生反應(yīng)，求出HbA1c百分比。

1.5 親和色譜法 采用硼酸衍生物與HbA1c分子葡萄糖順位二醇進(jìn)行可逆性反應(yīng)，HbA1c通過共價結(jié)合凝膠柱，而非HbA1c會被洗脫分離，后用高水平含糖或順位二醇基的多羥基復(fù)合物HbA1c置換。親和色譜法檢測的是總HbA1c量，不是HbA1c單一組分的水平[2]。

2 HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法評價

2.1 離子交換色譜法 優(yōu)點是精密度高、重復(fù)性好且操作簡單。缺點是易受HbA1c前體、變異血紅蛋白及甲?；t蛋白干擾，并受外界環(huán)境溫度影響，價格昂貴。主要儀器有日本TOSUO公司HLC-723G7；美國伯樂公司的D-10、DiaSTA分析儀；日本常光的HS-12。

2.2 等電點聚集法 優(yōu)點是能夠分辨出不同一級結(jié)構(gòu)的血紅蛋白，可完全避開各種物質(zhì)的干擾，是一種理想方法。缺點是儀器價格昂貴難于普及。主要儀器有美國伯樂儀器有Model Ⅲ Mini IEF cell。

2.3 瓊脂凝膠電泳法 優(yōu)點是不易受不穩(wěn)定HbA1c片段、變異血紅蛋白及甲?；t蛋白的干擾。缺點是檢測速度慢，無法進(jìn)行實時檢測；電詠法需成批進(jìn)行標(biāo)本分析，目前尚無商品化儀器。代表儀器有SEBIA凝膠電儀。

2.4 免疫比濁法 優(yōu)點是特異性好，操作簡單，不需要額外儀器。缺點易受脂肪血、黃疸等標(biāo)本因素影響，抗交叉污染能力差。主要儀器有德國拜耳的DCA-2000。

2.5 膠乳凝集法 優(yōu)點是快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、敏感性高、線性范圍寬。缺點是易受高水平葡萄糖、高三酰甘油、高膽紅素等物質(zhì)干擾。主要儀器有美國貝克曼庫爾特Beckmanlx-20全自動生化分析儀。

2.6 化學(xué)發(fā)光法 優(yōu)點是敏感性、特異性高、誤差系數(shù)小、回收率高、準(zhǔn)確度高、交叉污染率小、影響因素少。缺點只適應(yīng)批量標(biāo)本的檢測。主要儀器有韓國艾可美的I-CRROMA免疫熒光分析儀。

2.7 酶法 優(yōu)點是方便、簡單、準(zhǔn)確、省時、重復(fù)性好、特異性高。缺點是酶法檢測HbA1c在低值可檢測范圍比高效液相色譜法(HPLC)法更低，而高值檢測范圍也要比HPLC法更低。代表儀器有美國Abbou的IMX微粒子酶免分析(MEIA)。

2.8 親和色譜法 優(yōu)點是操作簡單、快速、價廉、精密度較高及不受血紅蛋白變異體影響。缺點是檢測結(jié)果為HbA1c總量，不能測試單一組分，且包含HbA1c的糖化組分，檢測成本高。目前主要儀器有英國REWSCIENTIFIC公司DSTHbA1c分析儀，挪威axis-shield的Nycocard Headev Ⅲ型金標(biāo)量快速檢測儀[3]。

3 HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化的建立

3.1 國際通用HbA1c國家標(biāo)準(zhǔn)化項目 包括美國的國家HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化計劃(NGSP),日本糖尿病學(xué)會與日本臨床化學(xué)協(xié)會的聯(lián)合計劃(JDS/JSCC)及瑞典Mono-S in Sweden計劃。其中，全球應(yīng)用最廣的HbA1c國家標(biāo)準(zhǔn)化項目是美國的NGSP，約97%以上的實驗室均采用此標(biāo)準(zhǔn)。NGSP由執(zhí)行委員會和實驗室網(wǎng)絡(luò)組成，指定離子交換HPLC為參考方法，確保不同級別的參考實驗室檢測結(jié)果可溯源至上一級參考實驗室，并通過NGSP認(rèn)證檢測，改進(jìn)實驗室HbA1c檢測質(zhì)量，使各常規(guī)實驗室檢測結(jié)果均與DCCT靶值具有可比性[4]。

3.2 NGSP的優(yōu)勢 NGSP具有廣泛臨床實踐性和應(yīng)用基礎(chǔ)，國際上2種參考方法達(dá)成統(tǒng)一共識：HbA1c檢測廠家需溯源到IFCC推薦方法，而常規(guī)實驗室方法應(yīng)得到NGSP的認(rèn)可。歐洲大部分國家均用IFCC和NGSP單位同時報告，方便統(tǒng)一檢測數(shù)據(jù)結(jié)果。

3.3 我國HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化現(xiàn)狀 我國HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化程度已大大提高，HbA1c參考體系已建立，形成了具有規(guī)范化統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。眾多實驗室采用IFCC和NGSP/DCCT 2個單位共同報告Hb1Ac；檢測HbA1c的實驗室開展質(zhì)量控制，確保得到準(zhǔn)確的HbA1c數(shù)據(jù)結(jié)果；所有實驗室開展常規(guī)室內(nèi)質(zhì)控并參加室間質(zhì)評，以確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性[5]。

4 討 論

由于臨床需要，對HbA1c方法學(xué)和標(biāo)準(zhǔn)化要求也在提高。我國糖尿病患者人數(shù)不斷增加，糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展與血糖控制直接相關(guān)。國際HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化已經(jīng)取得顯著成就，我國Hb1Ac標(biāo)準(zhǔn)化也取得了長足的發(fā)展，推動了糖尿病防治工作進(jìn)程，有效地提高糖尿病患者的生命質(zhì)量[6]。

HbA1c國際化標(biāo)準(zhǔn)在檢測體系、量值溯源及臨床應(yīng)用指南等領(lǐng)域已達(dá)到共識。國內(nèi)參加國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨檢中心室間質(zhì)評的實驗室越來越多。國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨檢中心已成立國際公認(rèn)的HPLC HbA1c檢測參考方法，并研制出國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為HbA1c檢測結(jié)果的量值溯源提供了質(zhì)量保證。上海市臨檢中心成功建立IFCC一級參考方法，是發(fā)展中國家第1個采用參考方法的參考實驗室，實現(xiàn)了我國HbA1c檢測的溯源性，奠定了HbA1c檢測標(biāo)準(zhǔn)化基礎(chǔ)[7]。

HbA1c臨床實驗室測定方法因各個方法原理不同，所檢測的HbA1c結(jié)果也不同。從測定方法的精確性來評價，HPLC最理想；另外，酶法、金標(biāo)法也被廣泛采用。但是，所有檢測方法都不是完美無缺的。有研究顯示，HbA1c會因年齡與種族不同而產(chǎn)生差別。年齡每增長10歲，HPLC所測得的值將增加0.11%～0.15%[8]。為更好地服務(wù)臨床，為糖尿病的診療提供準(zhǔn)確、可靠檢測結(jié)果，臨床檢驗工作者必須積極促進(jìn)HbA1c檢測的標(biāo)準(zhǔn)化工作，使實驗室檢測水平標(biāo)準(zhǔn)化，檢測能力達(dá)到國際水平。因此，HbA1c的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化及質(zhì)量評價體系的建立和實施將會大力推動糖尿病的防治及其科研工作的展開。

[1]中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會.中國2型糖尿病防治指南(2010年版)[J].中國糖尿病雜志,2011,20(1):5.

[2]呂玉芹.HbA1c的臨床應(yīng)用及檢測的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2014,20(8):1461-1464.

[3]劉蔚,紀(jì)立農(nóng).2011年全國糖化血紅蛋白檢測儀器現(xiàn)況調(diào)查[J].中國糖尿病雜志,2013,21(8):682-685.

[4]張捷,楊碩.糖化血紅蛋白檢測的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程及臨床應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2012,35(6):511-516.

[5]吳烔,邵文琦,周琰,等.上海地區(qū)糖化血紅蛋白一致性計劃建立和結(jié)果初步評價[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2012,35(4):370-372.

[6]Sacks DB.Measurement of hemoglobin A(1c):a new twist on the path to harmony[J].Diabetes Care,2012,35(12):2674-2680.

[7]范基農(nóng).我國糖尿病檢測將邁入標(biāo)準(zhǔn)化軌道--中國首家IFCC糖化血紅蛋白一級參考實驗室獲得認(rèn)可[J].檢驗醫(yī)學(xué),2012,27(7):594.

[8]黃祥芬.糖化血紅蛋白和超敏C反應(yīng)蛋白聯(lián)合檢測在糖尿病微血管病變中的應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥科學(xué),2012,2(4):126-128.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.064

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1673-4130(2016)22-3237-02

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