新疆地區(qū)1 378例羊水細胞培養(yǎng)的影響因素研究

加米拉·熱扎克，湃孜萊提·哈斯木，夏 燕，葉爾登切切克，段 玲

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學遺傳產(chǎn)前診斷中心實驗室，烏魯木齊 830054)

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·臨床研究·

新疆地區(qū)1 378例羊水細胞培養(yǎng)的影響因素研究

加米拉·熱扎克，湃孜萊提·哈斯木，夏 燕，葉爾登切切克，段 玲△

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學遺傳產(chǎn)前診斷中心實驗室，烏魯木齊 830054)

目的 探討新疆地區(qū)孕中期羊水細胞培養(yǎng)影響因素。方法 該實驗室對1 378例具有產(chǎn)前診斷指征的孕婦行羊膜腔穿刺，無菌操作下羊水穿刺獲得孕中期羊水14 mL，接種T瓶培養(yǎng)7～9 d。及時處理不合格羊水，規(guī)范培養(yǎng)環(huán)境，嚴格要求無菌操作。采用消化法收獲細胞，常規(guī)染色體制片后進行產(chǎn)前診斷，分析核型。結果 通過消化法培養(yǎng)1 378例羊水細胞，失敗13例，成功1 365例，成功率99.1%。結論 羊水細胞培養(yǎng)各個環(huán)節(jié)至關重要，直接影響培養(yǎng)結局；符合產(chǎn)前診斷適應征孕婦的異常率高于正常孕婦，應指導其行侵入性產(chǎn)前診斷，確定胎兒核型。

羊水細胞； 染色體核型； 無菌操作

染色體異常是導致新生兒出生缺陷的重要原因之一，其發(fā)病率為 0.1%～0.2%[1-2]，符合羊膜腔穿刺產(chǎn)前診斷的異常率可達3.6%[3-4]。羊水細胞培養(yǎng)及其染色體制備技術是胎兒染色體病產(chǎn)前診斷的重要手段。由于羊水細胞培養(yǎng)技術要求高、羊水中活細胞少、培養(yǎng)周期長、易污染、分裂相少；且羊水細胞染色體在收獲、低滲、固定、顯帶、染色等諸多環(huán)節(jié)的制備難度相對于外周血染色體更大，任何環(huán)節(jié)不合適都可能導致失敗。羊水細胞培養(yǎng)成功是產(chǎn)前診斷的關鍵，如進行二次穿刺，可能會錯過最佳穿刺孕周，對孕婦的身體及心理也會造成一定傷害[5]。目前，羊水細胞培養(yǎng)技術已經(jīng)推廣至我國各地區(qū)，通過對羊水細胞培養(yǎng)的時機、取材、接種等重要環(huán)節(jié)進行改良，可縮短培養(yǎng)周期，獲得理想細胞數(shù)量及有效核型，按期出具產(chǎn)前診斷報告，及時為當?shù)卦袐D妊娠提供合理指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料 在本院經(jīng)產(chǎn)前篩查評估結果為高風險的孕婦、高齡孕婦、夫妻患染色體病、不良孕產(chǎn)史，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷高風險，或具有其他產(chǎn)前診斷指征的孕婦，孕周均在 18～25周，共1 378例，經(jīng)知情同意后實施羊膜腔穿刺術獲取羊水。

1.2 方法

1.2.1 羊水細胞的接種 無菌條件下獲得羊水14 mL分裝于2個無菌離心管2 000 r/min離心10 min，棄上清液，留1～3 mL羊水與沉淀混勻，分別接種于2個細胞培養(yǎng)瓶中。加入4 mL左右細胞培養(yǎng)液，放入37 ℃、二氧化碳水平為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。羊水細胞培養(yǎng)方式包括培養(yǎng)瓶消化法與培養(yǎng)皿原位法，本中心將2種培養(yǎng)方法對比培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶消化法比培養(yǎng)皿原位法更容易獲得數(shù)量滿意的分裂相，成功率高，染色體核型顯帶更豐富，同時對大孕周羊水有較好的培養(yǎng)效果，因此決定沿用培養(yǎng)瓶消化法培養(yǎng)羊水細胞。

1.2.2 羊水細胞培養(yǎng)及發(fā)現(xiàn)污染羊水的處理 兩瓶羊水細胞培養(yǎng)6 d后進行換液，原上清液合并至另1個新細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，如前2瓶收獲不理想，第3瓶在5～7 d內(nèi)貼壁生長后繼續(xù)收獲，一般7～9 d后陸續(xù)收獲。在觀察收獲過程中，如發(fā)現(xiàn)個別培養(yǎng)瓶受細菌污染，應及時丟棄，收獲備份。如遇血性羊水、羊水雜質嚴重時，觀察到羊水細胞貼壁后勤換夜，也可得到理想的細胞克隆數(shù)。

1.2.3 羊水細胞收獲與制片 秋水仙素作用1 h后，胰酶消化法使羊水細胞脫落，收集至離心管內(nèi)離心，常規(guī)收獲后滴片、做帶、染色后鏡下分析。

2 結 果

采用上述方法對臨床采集的1 378例羊水標本進行培養(yǎng)，2例因血性嚴重、胎糞污染等情況，活細胞數(shù)目較少，收獲不到處于分裂相細胞；11例羊水因采集羊水的注射器污染；共13例培養(yǎng)失敗，其余 1 365例成功，1次性培養(yǎng)成功率達到99.1%，培養(yǎng)收獲時間大多數(shù)為7～9 d，每例羊水培養(yǎng)可獲得4～8張染色體玻片，每片可獲20～100個分散較好的分裂相細胞，完全滿足臨床診斷的要求，符合WS 322.2-2010中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準規(guī)定觀察報告標準數(shù)。1 365例羊水核型分析發(fā)現(xiàn)異常49 例，(不包括多態(tài)性核型)染色體異常率為3.6%，與其他文獻報道相近[6]，高于一般人群新生兒染色體異常的發(fā)生率(0．6%)，表明按照相關規(guī)范中的診斷指征選擇高危孕婦進行胎兒羊水染色體檢查，可顯著提高染色體異常檢出率。

3 討 論

羊水細胞主要來源于胎兒皮膚、消化道、呼吸道的脫落細胞，大部分是衰老固縮細胞，使羊水細胞培養(yǎng)較其他組織培養(yǎng)(如外周血細胞、皮膚細胞)更為困難[7]。影響羊水細胞成功率的因素較多[8]，如何把握好影響羊水細胞培養(yǎng)成功率的每個步驟至關重要。

孕中期(18～24周)的羊水中，羊水細胞量多，羊水中有形成分(如胎脂)少，有利于羊水細胞貼壁成活。本中心接診孕婦的孕周一般控制在19周以上，24周以下，此時期的羊水接種后生長情況大致相同，一般不需區(qū)別對待。低于18周的孕婦可建議絨毛細胞培養(yǎng)或待時機成熟后再行羊水穿刺。大于25周的孕婦可建議行臍血穿刺血細胞培養(yǎng)染色體診斷。獲取羊水細胞后，其轉運和接種須嚴格遵守無菌規(guī)范操作，以保證羊水細胞培養(yǎng)的成功。實驗室對羊水細胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基、無菌離心管、培養(yǎng)瓶等材料嚴格要求無菌，但羊水抽取時所用的材料(如注射器)卻是臨床容易忽視的問題。

本研究中，有11例羊水細胞培養(yǎng)失敗，未出染色體核型報告，只獲得熒光原位雜交技術(FISH)報告；鏡下觀察羊水細胞，11例羊水均未見貼壁細胞，細胞懸液中可見漂浮的上皮細胞及羊水細胞，各細胞形態(tài)結構完整；細胞質中可見黑色顆粒，細胞數(shù)量中等，在培養(yǎng)基底部可見黑色細砂狀顆粒，形狀不規(guī)則，逐日增多，有折光性，疑似細胞碎片；培養(yǎng)液清澈，無細菌污染征象。為改善細胞培養(yǎng)環(huán)境及備份，進行換液，抗菌藥物處理后羊水細胞仍無貼壁生長跡象。此羊水標本進行一般細菌培養(yǎng)、支原體聚合酶鏈式反應(PCR)測定結果均為陰性，排除細菌及支原體等污染可能。張晶等[9]曾報道試驗材料有細胞毒性時導致細胞培養(yǎng)失敗的因素。其同時對同一批號的注射器等試驗材料進行了人精子存活試驗，經(jīng)過3 d培養(yǎng)后，對照管中向前活動精子比率為92%，測試管向前活動精子比率為0，精子存活指數(shù)均為0，從而確定抽取羊水的注射器有細胞毒性，導致細胞培養(yǎng)失敗。通常在行羊膜腔穿刺術時抽取羊水用普通的大容量注射器內(nèi)墊片上涂有少量硅油(起潤滑作用)，筆者認為羊水細胞與硅油長時間接觸后可能會影響羊水細胞的正常貼壁，造成培養(yǎng)失敗，而1次性無菌注射器因無內(nèi)置黑色膠環(huán)，可保證此環(huán)節(jié)無細胞毒性侵害羊水細胞。羊水穿刺獲取羊水后，應盡快進行接種，一般控制在1 h內(nèi)，以減小外界環(huán)境對羊水細胞的影響。

較多文獻報道了對血性羊水的處理，但都較為繁雜。筆者認為，遇少量至中量血性羊水可不作處理，常規(guī)接種。羊水細胞在數(shù)日后均可貼壁生長，周期可能較慢，待見到貼壁后積極換液，可得到較滿意的細胞克隆數(shù)量。羊水細胞中有形成分較多時，可離心使細胞分層沉淀，吸取羊水細胞沉淀部分接種。進入收獲期的羊水細胞需要每天進行觀察，以把握最佳收獲時機。通常培養(yǎng)6～9 d后，細胞進入收獲期，每個培養(yǎng)瓶內(nèi)的克隆總數(shù)為20個以上，克隆內(nèi)有大量形態(tài)為魚眼形透亮細胞，形態(tài)、折光度都適宜時方可收獲。如羊水細胞不慎老化，可用細胞刮刀刮下細胞吸管打散后二次貼壁傳代，24 h內(nèi)可收獲。原代細胞和上清細胞都可傳代，但隨著傳代次數(shù)增多，可能造成一定比例的假嵌合體[10]。因羊水細胞貼壁生長，而本研究采用培養(yǎng)瓶法，在收獲時可能出現(xiàn)染色體受到破壞，從而增加羊水核型中出現(xiàn)嵌合體的概率[11]。如因污染等原因，培養(yǎng)2周以上仍無細胞生長，則傳代培養(yǎng)意義不大，考慮第二次穿刺。

綜上所述，1例合格羊水標本是實驗室做出快速準確產(chǎn)前診斷的前提保證，用合格的注射器及培養(yǎng)基、備份式羊水細胞收獲及污染羊水細胞純化等可增加羊水細胞的貼壁概率，縮短羊水細胞培養(yǎng)時間，提高羊水細胞培養(yǎng)成功率。只有獲得合格的羊水細胞分裂相才能保質保量的完成產(chǎn)前診斷。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.22.034

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1673-4130(2016)22-3184-02

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