血小板微粒在血栓性疾病中的診斷價(jià)值

楊正亮，金　紅，李　琪，陳宏娟 綜述， 閆海潤(rùn) 審校

(牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江牡丹江 157011)

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血小板微粒在血栓性疾病中的診斷價(jià)值

楊正亮，金紅，李琪，陳宏娟 綜述， 閆海潤(rùn)△審校

(牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江牡丹江 157011)

血小板微粒； 血栓性疾??；血栓形成

在血栓形成過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的受損起著非常重要的作用。內(nèi)皮受損后暴露的膠原激活人體的凝血因子引起血小板聚集，引發(fā)凝血過(guò)程。血小板在活化的同時(shí)釋放血小板微粒，血小板微粒具有促凝功能。目前，血小板微粒的檢測(cè)方法主要是通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)，具有非常高的精確度。血小板微粒在冠心病、腦梗死、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病等多種血栓性疾病的發(fā)病及病程發(fā)展過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)就血栓形成過(guò)程、血小板微粒的生理功能、血小板微粒的檢測(cè)方法以及血小板微粒在血栓性疾病形成過(guò)程中的作用進(jìn)行論述。

1　血栓的形成過(guò)程

在人體血液中存在凝血與抗凝血兩大系統(tǒng)。人體正常的生理狀態(tài)下，游離在血液中的凝血因子持續(xù)被有限地激活，激活的凝血因子產(chǎn)生凝血酶，然后催化纖維蛋白原形成少量的纖維蛋白并在心血管內(nèi)膜上沉積。與此同時(shí)，這些沉積的纖維蛋白又持續(xù)被激活的纖維蛋白溶解系統(tǒng)所溶解。被激活的凝血因子在發(fā)揮作用后又不斷被單核巨噬細(xì)胞吞噬。這種凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng)在血液中所維持的動(dòng)態(tài)平衡，既維持了血液潛在的可凝固性，又保證了血液的流體狀態(tài)[1]。但是，在一些能夠觸發(fā)血液凝固的影響因素作用下，以上動(dòng)態(tài)平衡很快被打破，一旦觸發(fā)了人體的凝血機(jī)制，就會(huì)導(dǎo)致血栓形成[2]。

2　血小板微粒的生理功能

1967 年，Wolf 率先報(bào)道了血小板微粒的存在，并且將它定義為“血小板塵?！盵3]。血小板微粒是從血小板質(zhì)膜中脫落而來(lái)的細(xì)小顆粒，有完整的血小板膜蛋白以及膜脂質(zhì)等結(jié)構(gòu)[4]，主要在血栓的形成、促炎性反應(yīng)以及調(diào)節(jié)血管功能方面發(fā)揮作用[5-6]。

血小板微粒包含著一個(gè)特殊的蛋白質(zhì)子集，Kim等[7]用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記血小板微粒的膜聯(lián)蛋白V，然后把一部分用FITC標(biāo)記的血小板微粒膜蛋白V再用細(xì)胞膜紅色熒光探針(DiI-C18)標(biāo)記，通過(guò)標(biāo)記的DiI-C18可以表明一些血小板微粒是由幼稚的血小板衍生而來(lái)。此外，用GPⅡb抗體標(biāo)記所有血小板衍生的微粒，發(fā)現(xiàn)被GPⅡb抗體標(biāo)記的微粒比被DiI-C18標(biāo)記的微粒占的比例要高，這表明血小板微粒由幼稚和成熟的血小板衍生而來(lái)。

血小板微粒是無(wú)生物學(xué)活性的細(xì)胞代謝物[8]，但最近研究發(fā)現(xiàn)血小板微粒也可能在炎癥、血栓形成以及血管收縮功能中發(fā)揮重要作用[9]。血小板微粒濃度增高提示血液處于高凝狀態(tài)，發(fā)生靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，患者的預(yù)后不良[10]。此外，血小板微粒是血液循環(huán)中組織因子的主要載體，組織因子是血栓形成的主要刺激物。Ramacciotti等[11]在小鼠靜脈血栓模型中發(fā)現(xiàn)微粒的濃度與組織因子活性有密切的聯(lián)系。含有組織因子的微粒很可能成為一種有用的血栓形成特異性生物標(biāo)志物。最近的研究發(fā)現(xiàn)微?？蓴y帶RNA和DNA。在人體外，微?？蓴y帶細(xì)胞核RNA和DNA，也可以攜帶細(xì)胞質(zhì)RNA和DNA，尤其是相對(duì)分子質(zhì)量低的RNA。微?？梢詫⑾鄬?duì)分子質(zhì)量低的RNA從內(nèi)皮祖細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)皮細(xì)胞，來(lái)刺激血管的生成[12]。

在血小板微粒的生理功能中，最具有特征性的是血小板微?？梢酝ㄟ^(guò)提供陰離子磷脂表面和組織因子參與血液凝固。研究表明，血管壁受損傷后，血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落而導(dǎo)致內(nèi)皮組分暴露，其中膠原、板層素、微纖維及血管性血友病因子將會(huì)引起血小板的黏附、聚集和活化反應(yīng)，產(chǎn)生血栓素A2和內(nèi)皮素，使血管呈持續(xù)收縮狀態(tài)[13]。而當(dāng)血小板黏附、聚集或活化時(shí)，釋放出來(lái)的血小板激活因子的活性源自血小板微粒，血小板激活因子在其他激活途徑下也多數(shù)與血小板微粒相關(guān)[14]，這說(shuō)明了血小板微粒有很強(qiáng)的促凝活性。此外，研究還發(fā)現(xiàn)存在于血小板微粒膜上的磷脂酰絲氨酸可形成陰離子磷脂，能促進(jìn)凝血酶的產(chǎn)生并增強(qiáng)組織因子的催化活性，表現(xiàn)出對(duì)凝血反應(yīng)的促進(jìn)。

在臨床上，血栓的形成是心血管事件發(fā)生非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，也是導(dǎo)致患者致死率和致殘率居高不下的直接原因[15]。在對(duì)冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)病機(jī)制的研究過(guò)程中，血小板微粒的作用正在引起臨床醫(yī)生的注意，大量的臨床試驗(yàn)正在對(duì)它們之間的關(guān)系進(jìn)行研究。血小板微粒可能會(huì)干擾相關(guān)組織因子的表達(dá)，組織因子是人體外源性凝血途徑的引發(fā)因子，血小板微粒通過(guò)這一途徑可引發(fā)血栓性疾病[16]。

3　血小板微粒的檢測(cè)方法

3.1顯微鏡法最原始的檢測(cè)血小板是顯微鏡法，使用電子顯微鏡可以比較直觀地看到血小板微粒的外部形態(tài)以及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，但是這種方法操作繁瑣，檢測(cè)效率不高，準(zhǔn)確性差且檢測(cè)的精密度和分辨率不能滿足臨床診斷的要求。

3.2放射性免疫標(biāo)記單抗體法放射性免疫標(biāo)記的單抗體法是先把檢測(cè)標(biāo)本(血清或者貧血小板血漿)離心，離心后用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行1～2次洗滌沉淀，在沉淀物中加入用125I標(biāo)記的抗微粒膜上相關(guān)蛋白，待反應(yīng)后再次進(jìn)行洗滌，最后用計(jì)數(shù)儀或膠片曝光測(cè)洗滌沉淀物的放射劑量，從而計(jì)算出血小板微粒的含量。這種方法使用放射性碘作為標(biāo)記物，由于這種放射性污染物對(duì)操作人員的健康和環(huán)境都有危害，已經(jīng)逐漸被淘汰。

3.3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)ELISA的原理是用血小板微粒與制備好的純化CD41和CD42b抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的抗體，加底物顯色。ELISA的敏感性和特異性都非常高，但是由于可溶性抗原對(duì)檢測(cè)結(jié)果干擾較大，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。

3.4流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞儀應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究是醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個(gè)重要里程碑，流式細(xì)胞分析基于細(xì)胞自身的物理、化學(xué)特性，借助流式細(xì)胞儀的單細(xì)胞高速、精確分析技術(shù)，通過(guò)閾值、光電倍增管電壓設(shè)定、陰性對(duì)照設(shè)置、熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)以及多方式設(shè)門等操作步驟對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的理化特性進(jìn)行精準(zhǔn)分析[17]。

流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于血小板微粒的檢測(cè)，是用FITC標(biāo)記抗CD41a抗體，用流式細(xì)胞儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)高精密的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)把血小板微粒的數(shù)量及濃度計(jì)算出來(lái)。這種方法最大的優(yōu)點(diǎn)是高效快速，精密度高，避免了人為原因造成的結(jié)果偏差。此外，流式細(xì)胞儀可以對(duì)選中的細(xì)胞群進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，能有效地避免白細(xì)胞和紅細(xì)胞對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。目前，流式細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)是血小板微粒檢測(cè)應(yīng)用最實(shí)用的方法。

4　血小板微粒與血栓性疾病

4.1冠心病冠心病患者由于不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂、糜爛以及出血，繼而引發(fā)血小板聚集或血栓形成導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄的程度加劇，或者是冠狀動(dòng)脈發(fā)生痙攣，導(dǎo)致心肌細(xì)胞供氧不足，清除心肌細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的廢物的能力喪失[18]。當(dāng)冠狀動(dòng)脈管壁的內(nèi)皮細(xì)胞層破壞后被粥樣斑塊所取代，血小板在粥樣斑塊附近發(fā)生聚集，被激活后釋放大量的凝血因子以及血小板微粒，可進(jìn)一步導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血管管壁狹窄甚至完全閉塞，造成心肌梗死。有研究表明：與健康患者相比，冠心病患者活化后的血小板釋放更多微粒[19]。目前對(duì)冠心病引起血小板微粒水平升高原因的研究?jī)A向于認(rèn)為與血管內(nèi)皮功能失調(diào)，冠狀動(dòng)脈血管產(chǎn)生炎性反應(yīng)以及冠狀動(dòng)脈內(nèi)血流剪切力的改變[20]。

4.2腦梗死腦梗死也稱為缺血性腦卒中，它是由于多種原因所引起的大腦血液供應(yīng)障礙，致使大腦局部組織缺血、缺氧而壞死，最終出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺失[21]。目前，臨床上最常用的牛津郡社區(qū)卒中研究分型(OCSP)標(biāo)準(zhǔn)把腦梗死分為4型：腔隙性梗死型(LACI)，部分前循環(huán)梗死型(PACI)，后循環(huán)梗死型(POCI)，完全前循環(huán)梗死型(TACI)[22]。根據(jù)腦組織缺血壞死的機(jī)制，腦梗死分為3種病理生理學(xué)類型：腦血栓形成、腦栓塞和血流動(dòng)力學(xué)機(jī)制造成的腦梗死[23]。其中，血栓形成是腦梗死最常見的病理生理學(xué)類型，而動(dòng)脈粥樣硬化是血栓形成的根本原因。有關(guān)對(duì)急性腦梗死患者調(diào)查結(jié)果顯示:與健康人群相比，急性腦梗死患者血液中血小板微粒濃度明顯增高[20，24]。

4.3慢性阻塞性肺疾病慢性阻塞性肺疾病是一種呼吸道和肺對(duì)有毒氣體或顆粒的慢性炎性反應(yīng)，其發(fā)病機(jī)制仍然沒有被明確論述，因此臨床上對(duì)慢性阻塞性肺疾病的治療僅僅停留在對(duì)癥治療的層面。目前，慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究就顯得尤為重要。對(duì)慢性阻塞性肺疾病患者血液中血小板微粒水平監(jiān)測(cè)的研究發(fā)現(xiàn)，有些患者血液中血小板微粒升高，血液處于高凝狀態(tài)，發(fā)生血栓的風(fēng)險(xiǎn)比健康人要高[25]。這提示血小板微粒在慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病過(guò)程中起著促炎和促凝的作用。

4.4糖尿病糖尿病是一種由于多種因素引起的以持續(xù)性處于高血糖狀態(tài)為主要特征的全身性代謝紊亂，糖尿病可以引起多個(gè)器官損害，導(dǎo)致眼、腎、神經(jīng)、心臟和血管等組織器官的慢性進(jìn)行性病變，最終可以導(dǎo)致器官功能缺陷甚至衰竭。糖尿病患者伴發(fā)高凝狀態(tài)、冠心病以及動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)非常高，通過(guò)對(duì)2型糖尿病患者血液中血小板微粒水平的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)[26]，2型糖尿病病史兩年以上的患者其血液中血小板微粒水平與健康人群相比有明顯差異，伴發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的患者其血小板微粒水平的差異程度更大[27]。這些發(fā)現(xiàn)為通過(guò)檢測(cè)糖尿病患者血液中血小板微粒的水平來(lái)評(píng)價(jià)糖尿病患者病情嚴(yán)重程度提供了依據(jù)。

另外，根據(jù)目前的臨床研究，其他可以引起心腦血管損傷如高血壓、肺動(dòng)脈高壓、房顫以及腦外傷出血等疾病都能導(dǎo)致血液中血小板微粒水平改變，這一變化對(duì)患者血栓形成早期預(yù)測(cè)具有非常重要的臨床價(jià)值。

5　小　　結(jié)

近年來(lái)，隨著各種心腦血管疾病發(fā)病率逐年增加以及心血管搭橋再通技術(shù)的快速發(fā)展，由此引起的血栓性疾病高發(fā)病率已逐漸成為困擾患者和醫(yī)務(wù)工作者的難題。對(duì)血栓性疾病的監(jiān)測(cè)在診斷和治療中的重要性顯得尤為突出。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是造成血栓形成的一種原因；血小板的過(guò)度激活可以造成血小板微粒增多，也是血栓形成的一個(gè)原因。

在冠心病、缺血性腦梗死等心腦血管疾病中，血小板微粒的變化會(huì)早于CT、MRI等影像學(xué)指標(biāo)的改變。因此，通過(guò)檢測(cè)血小板微粒水平的改變，可以在疾病發(fā)生的早期進(jìn)行預(yù)測(cè)，為疾病的治療爭(zhēng)取更多時(shí)間，提高疾病的診斷和治愈率。

目前，大多數(shù)研究者認(rèn)為血小板微粒與血栓性疾病的形成有密切的關(guān)系。但是，血液中血小板微粒濃度與血栓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間是否存在線性關(guān)系，或者這兩者存在怎樣的線性關(guān)系還沒有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，需要進(jìn)一步研究。血液中血小板微粒水平改變能夠反映患者處于高凝狀態(tài)，能否準(zhǔn)確預(yù)測(cè)血栓的形成部位，有待于進(jìn)一步探索。

對(duì)血小板微粒的深入研究提示血小板微粒對(duì)血栓性疾病的診斷與防治具有重要價(jià)值。當(dāng)血液中血小板微粒濃度升高時(shí)，提示患者處于高凝狀態(tài)而且對(duì)患者的預(yù)后有嚴(yán)重的不良影響。此外，檢測(cè)血液中血小板微粒濃度也可作為觀察臨床藥效的方法。血小板微粒是預(yù)測(cè)血栓性疾病出現(xiàn)明顯臨床癥狀前的特異性生物標(biāo)志物，可為臨床早期診斷、療效監(jiān)測(cè)以及鑒別診斷提供重要的臨床依據(jù)。

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