大腸埃希菌強(qiáng)毒力島核心基因fyuA研究進(jìn)展

王　莊，張澤輝，劉耀川，張德顯，劉明春*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心，遼寧沈陽 110161)

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大腸埃希菌強(qiáng)毒力島核心基因fyuA研究進(jìn)展

王莊1，張澤輝1，劉耀川2，張德顯1，劉明春1*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省重大動(dòng)物疫病應(yīng)急中心，遼寧沈陽 110161)

強(qiáng)毒力島(HPI)基因最先在耶爾森菌體內(nèi)檢出，是一種負(fù)責(zé)編碼合成、調(diào)節(jié)和運(yùn)輸鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)受體蛋白的基因，可顯著提高細(xì)菌的毒力。HPI通過水平轉(zhuǎn)移進(jìn)入大腸埃希菌中，提高大腸埃希菌致病性及生存增殖能力，對(duì)食品安全、人類健康造成危害。fyuA基因位于HPI的核心功能區(qū)irp2-fyuA基因簇，常作為HPI毒力島基因檢測(cè)的標(biāo)志性基因之一。關(guān)于fyuA基因及其表達(dá)產(chǎn)物的研究將為大腸埃希菌感染性疾病的治療與預(yù)防提供新思路。

強(qiáng)毒力島；大腸埃希菌；fyuA

強(qiáng)毒力島(high pathogenicity island,HPI)最早在耶爾森菌中檢出，該毒力島攜帶和表達(dá)是耶爾森菌表現(xiàn)高毒性表型的必要條件，并與耶爾森菌小鼠致死表型相關(guān)。HPI基因長(zhǎng)度為35 kb～45 kb，含有編碼鐵載體耶爾森菌素介導(dǎo)的鐵攝取系統(tǒng)以及編碼耶爾森菌素受體的基因，其核心功能區(qū)為irp2-fyuA基因簇。1997年，Schubert S等[1]首次報(bào)道在大腸埃希菌中檢測(cè)到含有irp2-fyuA基因簇的HPI。之后，在多種致病性大腸埃希菌中均檢測(cè)出irp2和fyuA基因片段，插入點(diǎn)大多位于asn-tRNA[2]。其中，在B2型和D型大腸埃希菌中HPI檢出率最高[3-4]。fyuA基因作為HPI的核心基因之一，其編碼產(chǎn)物對(duì)于細(xì)菌在低鐵環(huán)境下的生存具有重要意義。

1　HPI對(duì)大腸埃希菌的影響

通過比較HPI陽性與陰性致病性大腸埃希菌對(duì)小鼠的致死率之間的差異，發(fā)現(xiàn)HPI可顯著增強(qiáng)致病性大腸埃希菌毒性[5]。HPI基因編碼的鐵攝取系統(tǒng)中含有3價(jià)鐵螯合物，該螯合物對(duì)于鐵元素具有高度親和性，可以解離與宿主鐵結(jié)合蛋白結(jié)合的鐵，從而顯著增強(qiáng)細(xì)菌的鐵攝取功能。同時(shí)，編碼產(chǎn)物可以抑制宿主的免疫功能，增強(qiáng)細(xì)菌在宿主體內(nèi)的生存能力。

大腸埃希菌中檢測(cè)出的irp2和fyuA基因片段插入點(diǎn)大多位于asn-tRNA[1-2]?；蛐蛄蟹治霭l(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌與耶爾森菌中的irp2-fyuA基因簇的同源性在98.6%以上。fyuA基因位于HPI核心區(qū)irp2-fyuA基因簇的末端，長(zhǎng)度為2 022 bp，負(fù)責(zé)編碼合成鼠疫巴氏桿菌素和耶爾森菌素受體蛋白FyuA(ferric yersinia uptake)及細(xì)菌膜外3價(jià)鐵螯合物受體蛋白。隨著基因缺失株的成功構(gòu)建以及基因?qū)W研究的深入，fyuA基因編碼產(chǎn)物的作用及fyuA基因與其他基因的關(guān)聯(lián)也逐漸清晰。

2　大腸埃希菌中的fyuA基因

隨著HPI在各種致病性大腸埃希菌的水平轉(zhuǎn)移，已在豬、禽、牛等多種動(dòng)物源大腸埃希菌中檢出fyuA基因[6-8]。醫(yī)學(xué)臨床的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，女性尿路感染患者體內(nèi)分離的大腸埃希菌菌株中fyuA檢出率高達(dá)44.4%[9]。毒力島基因不穩(wěn)定的特性導(dǎo)致HPI在耶爾森菌與大腸埃希菌之間水平轉(zhuǎn)移過程中存在基因重組或基因突變的現(xiàn)象。fyuA基因位于HPI核心功能區(qū)邊緣，在細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移的過程中更易發(fā)生突變。因此，大腸埃希菌HPI陽性菌中存在fyuA基因缺失的現(xiàn)象[10]。通過基因探針及蛋白質(zhì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在部分?jǐn)y帶fyuA基因的致病性大腸埃希菌中fyuA基因無法編碼合成FyuA蛋白，原因有待進(jìn)一步研究。根據(jù)Jin H等[11]研究，攜帶fyuA基因無法保證HPI核心功能區(qū)的完整性，而完整的HPI毒力島核心功能區(qū)也并不保證功能性耶爾森菌素的合成。

2.1fyuA基因與大腸埃希菌菌株耐藥性的關(guān)系

毒力因子和耐藥基因是影響致病菌在其宿主體內(nèi)生存和表現(xiàn)致病性的主要因素。若是某種毒力因子與耐藥基因通過同一遺傳平臺(tái)遺傳或轉(zhuǎn)移，在藥物的遺傳選擇壓力下，易產(chǎn)生高致病性耐藥菌株，加重致病菌對(duì)人畜健康造成的危害。目前，關(guān)于發(fā)現(xiàn)fyuA基因的攜帶與某些耐藥性狀的表現(xiàn)在數(shù)據(jù)上呈現(xiàn)正負(fù)相關(guān)性[12-14]，兩者之間基因相關(guān)性仍需深入研究。

2.1.1fyuA基因與超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因的關(guān)系頭孢類藥物在臨床治療中廣泛使用，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum β-lactamase,ESBLs)菌株的出現(xiàn)，對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的臨床有效性提出了挑戰(zhàn)。根據(jù)多人的研究報(bào)道，遼寧、新疆及我國(guó)東部地區(qū)等多地發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素已表現(xiàn)出廣泛的耐藥性[15-17]。近年來，對(duì)于HPI fyuA基因與超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥基因相關(guān)性的研究得到了廣泛的關(guān)注[18]。劉紅玉等[19]研究發(fā)現(xiàn)，fyuA基因在禽源大腸埃希菌非產(chǎn)ESBLs菌株中檢出率達(dá)到了14.29%，遠(yuǎn)大于其在產(chǎn)ESBLs菌株中的檢出率。陳偉等[20]關(guān)于HPI毒力基因(irp2和fyuA)與β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(TEM和SHV)相關(guān)性的研究，巢湖流域的動(dòng)物源性大腸埃希菌中fyuA+TEM以及fyuA+SHV的檢出率均為16.2%，并通過irp2基因缺失株證明irp2基因與TEM及SHV基因之間無關(guān)聯(lián)。

2.1.2fyuA基因與生物膜通過對(duì)比正常株與單基因敲除株在致病性、黏附能力等方面的差異，可以準(zhǔn)確判斷目的基因在菌體內(nèi)的作用。鄧聰?shù)萚21]成功構(gòu)建了大腸埃希菌fyuA基因缺失株 ，研究發(fā)現(xiàn)，尿路致病性大腸埃希菌fyuA基因缺失株與原菌株在無菌尿液中的生長(zhǎng)繁殖能力及生物膜形成方面存在差異。fyuA基因缺失株與原菌株在液體LB培養(yǎng)基中的增殖速率大致相同，但在無菌尿液中培養(yǎng)時(shí)基因缺失株的增殖速率明顯低于原菌株，表明fyuA基因?qū)τ诖竽c埃希菌在無菌尿液中的增殖具有重要意義。不同于LB培養(yǎng)基中的富鐵環(huán)境，在無菌尿液中，鐵元素含量極低，fyuA基因編碼產(chǎn)物可以增強(qiáng)大腸埃希菌的攝鐵能力，因此原菌株在無菌尿液中增殖速率要明顯高于fyuA基因缺失株。研究同時(shí)表明fyuA基因可以增強(qiáng)致病性大腸埃希菌的生物膜形成能力。細(xì)菌生物膜的形成有助于細(xì)菌在宿主體內(nèi)的生存，通過生物膜，獨(dú)立菌株之間產(chǎn)生協(xié)同作用，增加免疫逃避的幾率。比較fyuA基因缺失株與原菌株的生物膜形成能力，發(fā)現(xiàn)fyuA基因的缺失會(huì)顯著降低大腸埃希菌生物膜的形成能力[22]，具體機(jī)理需進(jìn)一步的研究闡明。

2.1.3fyuA基因與細(xì)菌黏附據(jù)報(bào)道，fyuA基因可以提高APEC黏附DF-1細(xì)胞的能力。經(jīng)過比較，irp2與fyuA雙基因敲除株的DF-1細(xì)胞黏附能力下降為irp2單基因敲除株的81.1%(4.84/5.97)；同時(shí)，irp2與fyuA雙基因敲除株中pfs和tsh在內(nèi)的多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平比在irp2單基因敲除株更加顯著地下降，而在單基因敲除株中轉(zhuǎn)錄水平顯著上升的ibeA和stx2f基因在雙敲除菌株中則表現(xiàn)出與原菌株相近的轉(zhuǎn)錄水平[23]。

2.2fyuA基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)研究

攝鐵系統(tǒng)對(duì)于尿路致病性大腸埃希菌(UPEC)在低鐵的無菌尿液中的增殖具有重要意義。目前，以攝鐵系統(tǒng)調(diào)節(jié)蛋白FyuA為目標(biāo)抗原的免疫研究取得了一定進(jìn)展。通過將生化交聯(lián)后的FyuA與霍亂菌素佐劑作為抗原接種入小鼠體內(nèi)，Brumbaugh A R等[24]已成功證明FyuA可以刺激小鼠產(chǎn)生以FyuA為目標(biāo)抗原的免疫球蛋白IgG，顯著保護(hù)小鼠不受試驗(yàn)條件下的尿路感染(P<0.05)。同時(shí)，通過檢測(cè)特異性免疫血清抗體的水平，印證了對(duì)于FyuA蛋白的免疫可以刺激機(jī)體產(chǎn)生長(zhǎng)期體液免疫。在初次免疫接種且無后續(xù)免疫情況下，血清抗體含量可在至少70 d內(nèi)維持在接近最高水平，因此認(rèn)為可以產(chǎn)生FyuA特異的長(zhǎng)期存活的血清細(xì)胞。已證明以IutA、Hma、IreA等3個(gè)與UPEC攝鐵系統(tǒng)相關(guān)的受體蛋白為抗原可以刺激小鼠產(chǎn)生相應(yīng)抗體，基于UPEC攝鐵系統(tǒng)蛋白的疫苗的研究取得長(zhǎng)足進(jìn)展。不過目前各種與攝鐵蛋白相關(guān)的基因在菌株中的檢出率雖高，但單一抗原并不足以保證制備的疫苗可以引起對(duì)所有UPEC菌株的免疫反應(yīng)。

3　展望

有關(guān)大腸埃希菌HPI核心基因fyuA的研究已取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，通過基因缺失株的構(gòu)建初步揭示了該基因?qū)Υ竽c埃希菌致病性的影響及其與耐藥性的關(guān)系。若fyuA基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)研究取得重大突破，必將對(duì)大腸埃希菌感染性疾病的防治具有十分重要的意義。

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Progress on HPI Core Gene fyuA in E.coli

WANG Zhuang1,ZHANG Ze-hui1,LIU Yao-chuan2,ZHANG De-xian1,LIU Ming-chun1

(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Shenyang Agricultural University,Shenyang,Liaoning,110866,China;2.LiaoningEmergencyCenterforSignificantAnimalEpidemicDisease,Shenyang,Liaoning,110161,China)

High pathogenecity island encodes the proteins that synthesize,modulate and transport the iron uptake system and can greatly increase the virulence of bacteria.HPI gets intoE.colithrough horizontal transportation and increase the pathogenicity and reproduction ability ofE.coli,which will threaten food security and welfare of human beings even more.fyuA is a gene located in the irp2-fyuA gene cluster-the functional core gene of HPI,encoding the yersiniabactin and pesticine receptor.fyuA is often targeted as the symbolic gene of HPI.Investigation on the fyuA provides foundation for the treatment and prevention of diseases caused by pathogeneticE.coli.

high pathogenecity island;Escherichiacoli;fyuA

2016-03-24

遼寧省科學(xué)技術(shù)廳科技特派員、農(nóng)民技術(shù)員培訓(xùn)項(xiàng)目(2013030055-201)

王莊(1993-)，男，山東萊陽人，本科，主要從事細(xì)菌毒力因子及耐藥性研究。*通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2016)08-0079-03