肝性腦病動物模型的研究進展

200032　上?！?fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院(李政)；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科(石虹)

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·綜述·

肝性腦病動物模型的研究進展

李政石虹

200032上海復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院(李政)；復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化科(石虹)

肝性腦病(hepatic encephalopathy, HE)是由肝功能不全和/或門體靜脈分流(portal systemic shunting, PSS)所引起的大腦功能障礙，其神經(jīng)或心理異常表現(xiàn)程度各異，輕者為亞臨床改變，重者可發(fā)生昏迷[1,2]。HE分為3種類型：A型HE為與急性肝功能衰竭相關(guān)的HE；B型HE為單純門體旁路所引起；C型HE是在慢性肝病患者中發(fā)生的HE，患者通常已進展至肝硬化，并建立了較為豐富的門體側(cè)支循環(huán)[3]?，F(xiàn)就模型建立方法、機制、優(yōu)缺點和行為學(xué)檢測等方面對三型HE的常用動物模型作一綜述。

一、A型HE動物模型

(一)非肝性動物模型

建模方法可采用肝斷流手術(shù)或全肝臟切除術(shù)。肝斷流手術(shù)中，肝臟被完整保留，但流入肝臟的血循環(huán)被轉(zhuǎn)道(門腔靜脈吻合)和阻斷(肝動脈結(jié)扎)；全肝臟切除術(shù)中肝臟被移除，內(nèi)臟血循環(huán)轉(zhuǎn)道[4]。機制為通過切除肝臟或擾亂肝臟的血液循環(huán)造成肝功能衰竭。肝切除模型和肝斷流模型大鼠均會出現(xiàn)星型膠質(zhì)細胞足突腫脹，肝斷流術(shù)后的大鼠腦水腫、血氨升高、顱內(nèi)壓增高、其腦動作電位的表現(xiàn)和急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)患者的表現(xiàn)相似[4]。由于24h死亡率較高，不利于療效的觀察，從而限制了這些模型的應(yīng)用[5]。

(二)藥物誘導(dǎo)模型

1. 硫代乙酰胺(Thioacetamide, TAA)誘導(dǎo)的鼠模型：TAA誘導(dǎo)的ALF大鼠模型最早由Zimmermann等[6]建立。不同文獻選用的實驗動物、TAA劑量和給藥時間有所不同，如Sprague Dawley(SD)大鼠連續(xù)4天300 mg/kg腹腔注射[7]，雌性C57BL/6小鼠連續(xù)2天300 mg/kg腹腔注射[8]，或小鼠連續(xù)3天100 mg/kg腹腔注射[9]等。TAA被肝臟攝取后，經(jīng)肝細胞內(nèi)的細胞色素P450混合功能氧化酶代謝為TAA-硫氧化物，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和肝細胞損傷，并可直接作用于肝細胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成酶產(chǎn)生毒性作用，誘導(dǎo)肝代謝紊亂，致肝壞死[5]。TAA制備的HE模型具有良好的可重復(fù)性、易操作、成功率高、與人類HE相似度高等優(yōu)點[10]。

2. 四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的鼠模型：將CCl4按1∶4體積比溶于礦物油，按2.5 mL/kg劑量給予BALB/c裸鼠腹腔注射[11]。CCl4經(jīng)肝微粒體細胞色素P450代謝激活, 生成活性自由基及一系列氧化活性物質(zhì), 與肝細胞質(zhì)膜或亞細胞膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng), 降解膜磷脂, 破壞細胞膜完整性, 使其通透性增加, 致肝細胞壞死[5]。CCl4價格低廉；但實驗動物存活率低(24和48 h存活率分別為40%和10%)[12]。

3. D-氨基半乳糖(D-galactosamine, D-GalN)誘導(dǎo)的兔子模型：該模型的建立方法為將D-GalN溶于5%濃度的右旋糖溶液，按4.25 mmol/kg的劑量予以雄性新西蘭白兔耳靜脈注射。星形膠質(zhì)細胞的損傷和功能受抑制是該模型HE的發(fā)生機制[13]。該模型可以重現(xiàn)星型膠質(zhì)細胞水腫[13]，但實驗動物相對較貴。

4. 脂多糖和α-鵝膏蕈堿誘導(dǎo)的獼猴模型：將1 μg/kg脂多糖和0.1 mg/kg α-鵝膏蕈堿溶于50 mL的生理鹽水之中，緩慢注射到雌性恒河猴的腹腔中。脂多糖和α-鵝膏蕈堿先引起恒河猴肝細胞脂肪變性，最后發(fā)展成肝細胞大片壞死，爆發(fā)性肝功能衰竭。恒河猴模型與人類HE有相似的代謝和生理學(xué)特點[14]。但價格昂貴；迄今為止研究例數(shù)少，缺乏對比。

5. 氧化偶氮甲烷(azoxymethane, AOM)誘導(dǎo)的小鼠模型： 雄性C57Bl/6大鼠腹腔注射100 mg/kg AOM。AOM促進趨化因子配體2(chemokine ligand 2, CCL2)上調(diào)，CCL2與肝性腦病小膠質(zhì)細胞的激活和神經(jīng)功能下降相關(guān)[15]。該模型是研究急性肝損傷和肝性腦病的理想模型，具有可逆性、可重復(fù)性、具有治療窗等；但AOM對人體有生物毒性，實驗中還需注意對動物的體溫控制[16]。

二、B型HE動物模型

目前常用的建模方法是端-側(cè)門腔靜脈吻合術(shù)(porta-caval anastomosis, PCA)：結(jié)扎門靜脈近端，將門靜脈和下腔靜脈之間進行端-側(cè)吻合[17,18]。門腔靜脈分流引起腦組織中氨和谷氨酰胺增高，改變晝夜生物節(jié)律，使運動功能、記憶和學(xué)習(xí)能力減退，反射下降，降低腦的葡萄糖利用率，改變多種神經(jīng)遞質(zhì)功能[5]。改良的選擇性門腔靜脈端側(cè)吻合術(shù)是將腸系膜上靜脈和下腔靜脈行端-側(cè)吻合。選擇性門腔靜脈端-側(cè)吻合術(shù)與側(cè)-側(cè)門腔靜脈吻合使流入肝臟的門靜脈血流全部終止相比，只減少了其中的50%門靜脈血流；且術(shù)中靜脈更易暴露被找到，但為了確保血管不被拉伸和卷曲所花費的手術(shù)時間更長[19]。

三、C型HE動物模型

(一)有癥狀的C型HE模型

1. 藥物誘導(dǎo)模型：予以含TAA(初始濃度0.03%)的飲用水喂養(yǎng)Wistar大鼠12周，每周根據(jù)大鼠的體質(zhì)量適當(dāng)增減TAA的濃度[20]；或20周(濃度0.3 g/L或0.5 g/L)[21]。發(fā)病機制是通過改變在注意力和記憶力中起作用的腦邊緣系統(tǒng)區(qū)的乙酰膽堿脂酶活性[20]。TAA價格低廉；但藥物誘導(dǎo)的C型HE模型建模周期較長，建模過程中需注意監(jiān)控動物體質(zhì)量，適當(dāng)增減藥物劑量。

2. 手術(shù)模型：在麻醉下結(jié)扎成年Wistar大鼠肝膽管匯合處以下和胰管開口以上的膽總管處，再將兩結(jié)扎處之間的膽總管切除[22,23]。膽管結(jié)扎(bile duct-ligated, BDL)大鼠大腦皮質(zhì)中GABA神經(jīng)遞質(zhì)的合成改變，表現(xiàn)為自主活動的時空特點和探索性活動的改變，和短期識別記憶力的下降[22]。BDL可誘導(dǎo)可重復(fù)的膽汁性肝硬化大鼠模型，表現(xiàn)為肝功能衰竭、進行性黃疸、門脈高壓、門體分流、細菌移位以及免疫系統(tǒng)功能障礙；該模型大鼠雖然血氨升高，但僅表現(xiàn)為低級別的HE[4]。

3. 藥物和手術(shù)結(jié)合的C型HE模型

(1)BDL并輔以銨鹽喂食的大鼠模型：給予BDL術(shù)后的SD大鼠連續(xù)兩周喂食含質(zhì)量百分比濃度為10%的乙酸銨的食物[24]。大鼠在肝病疾病和炎癥介質(zhì)激活的背景下，氨作為誘發(fā)因素，引起嚴(yán)重的行為損傷。大鼠表現(xiàn)出與肝硬化HE患者相似的神經(jīng)解剖學(xué)和神經(jīng)化學(xué)特點，腦水腫和炎癥激活可以在這種情況下被發(fā)現(xiàn)[25]。

(2)CCl4誘導(dǎo)肝硬化結(jié)合門靜脈結(jié)扎的大鼠模型：SD 雄性大鼠每周予以含CCl4的飲用水灌胃，初始劑量為20 μL，以后每周根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整劑量，共6周；其后實施門靜脈結(jié)扎術(shù)。大鼠有輕度的腦水腫，肝再生結(jié)節(jié)和AlzheimerⅡ型星形細胞。該模型大鼠比肝硬化模型大鼠門體分流更明顯；同時比門靜脈結(jié)扎大鼠肝功能異常更明顯。能很好地重現(xiàn)肝硬化HE患者的主要癥狀：門體分流、血氨和腦氨水平增高、輕度腦水腫。缺點在于死亡率較高(67%)[26]。

(二)MHE的模型

1. 藥物誘導(dǎo)模型：SD雄性大鼠予以200 mg/kg TAA隔日腹腔注射，共兩次，MHE發(fā)生率為83.3%[27]；或雄性albino 大鼠予以50 mg/kg TAA腹腔注射，每周兩次，共14 d[28]；或SD大鼠予以200 mg/kg TAA腹腔注射，每周兩次，連續(xù)8周[29]。谷氨酸鹽-一氧化氮-環(huán)鳥酸苷通路中多巴胺受抑制導(dǎo)致MHE大鼠的記憶受損為其發(fā)病機制[29]。需通過腦誘發(fā)電位檢查是否建模成功[27]。

2. 手術(shù)模型：采用門靜脈校準(zhǔn)狹窄術(shù)：雄性Wistar Kyoto大鼠在乙醚麻醉下，予以20號鈍針頭在門靜脈旁引導(dǎo)，用3號絲線結(jié)扎門靜脈；隨后移除針頭得到一個校準(zhǔn)狹窄的門靜脈；通過門靜脈校準(zhǔn)狹窄術(shù)大約能減少門靜脈66%的容積。術(shù)后10 d發(fā)生門靜脈高壓和高血氨癥，不伴有其他明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)改變，其分子學(xué)機制可能與海馬線粒體功能障礙和細胞凋亡有關(guān)[30]。該模型可以重現(xiàn)MHE高血氨的癥狀，但需精準(zhǔn)地控制門靜脈的狹窄度，對于實驗者的手術(shù)技術(shù)要求較高。

四、HE模型行為學(xué)檢測方法

(一)強制游泳試驗實驗前1天，大鼠在室溫下，被放置在直徑24 cm，高50 cm的圓柱桶內(nèi)，注入30 cm深的水，讓大鼠在其中活動10 min，將大鼠從桶中取出，在干凈的籠中干燥后放回飼養(yǎng)籠。24 h后，大鼠被再次放置在圓柱筒內(nèi)，用攝像機監(jiān)測大鼠5 min的行為，并計算大鼠不運動、游泳或試圖爬出圓筒這三項活動每項所用的時間[21]。

(二)新物體識別實驗第一天，大鼠被放置在直徑80 cm的圓形場地5 min以適應(yīng)環(huán)境。第二天，在同一場地里放置兩個相同的物品，讓大鼠自由探索2 min。第三天，將其中一個物品替換成不一樣的物品，讓大鼠自由探索2 min，記錄其探索兩個物品的時間，并計算探索新物品的時間與探索兩個物品時間的比值，比值下降表示其記憶能力受損[21]。

(三)空間參考記憶的Morris水迷宮實驗該實驗在圓形的水箱中進行。大鼠會經(jīng)過連續(xù)四天的訓(xùn)練，將它們依次放入水中，給予其120 s時間尋找平臺，并在平臺上停留20 s。第五天，將平臺移開，每只大鼠進行四次實驗，每次有90 s的時間游泳，在原先平臺處停留的平均時間記錄為記憶再現(xiàn)指數(shù)[28]。

(四)旋轉(zhuǎn)實驗每只大鼠將進行每天5輪連續(xù)5 d的旋轉(zhuǎn)實驗。大鼠被放置在一個轉(zhuǎn)棒裝置上，轉(zhuǎn)棒的速度從第一天到第五天分別為5、10、15、20和25 rpm。每輪實驗會進行三次，每次間隔10 min，記錄三次實驗中大鼠在轉(zhuǎn)輪上停留的最長時間[28]。

(五)步態(tài)實驗大鼠的后爪被涂上墨水，在60 cm×10 cm紙帶上從光亮處走向黑暗處，測量并記錄左右爪之間的距離[28]。

(六)穿梭箱回避實驗大鼠被放置在一個雙向的穿梭箱中，內(nèi)有設(shè)備可以產(chǎn)生非條件刺激(unconditioned stimulus, US)和條件刺激(conditioned stimulus, CS,電擊后亮燈)。每只大鼠在連續(xù)五天中接受五輪測試，每輪測試前，給大鼠5 min適應(yīng)暗室，隨后進行30次試驗，每兩次間隔(30±5) s。CS中每次電擊前有20 s電燈點亮?xí)r間。US中，相當(dāng)于CS的最后10 s時會以0.5 mA電流電擊大鼠10 s或至大鼠移動到箱子的另一側(cè)即停止。如果大鼠在CS中受到電擊前即移動到箱子另一側(cè)，則此次記錄為回避；如果大鼠受到刺激后做出反應(yīng)，則記錄為逃脫；如果大鼠在刺激中不移至另一側(cè)，則記錄為無反應(yīng)。分別記錄大鼠回避、逃脫和無反應(yīng)的次數(shù)[28]。

(七)高架十字迷宮實驗高架十字迷宮組件由兩條相對開放臂(50 cm長×10 cm寬)和兩條相對閉合臂(50 cm長×10 cm寬×40 cm高)組成。裝置距離地面50 cm高，放置在紅光照明的房間正中。大鼠被放在裝備的中央，面向開放臂，自由探索5 min。分別記錄大鼠進入封閉臂的次數(shù)與進入兩組臂總次數(shù)的比值、于封閉臂處滯留時間與在兩組臂處滯留總時間的比值[31]。

(八)動物表現(xiàn)的臨床分級評分標(biāo)準(zhǔn)正常行為(0分)，輕度嗜睡(1分)，運動減少、姿勢控制困難和疼痛知覺減弱(2分)，嚴(yán)重的共濟失調(diào)、無自發(fā)翻正反射(3分)，無翻正反射、對疼痛刺激無反應(yīng)(4分)[7]。

五、結(jié)語

A型HE模型的建立期望達到如下標(biāo)準(zhǔn)：可復(fù)制性，并易于觀察分期；癥狀的進展包括腦水腫及其并發(fā)癥(顱內(nèi)高壓及腦疝)；潛在的可逆轉(zhuǎn)性；高血氨/腦氨、谷氨酰胺增加；肝臟、腦組織的病理變化具有特征性；對實驗人員具有最小的毒性。B和C型HE大鼠模型期望達到的標(biāo)準(zhǔn)為：門體分流或慢性肝病伴門體分流；腦病的癥狀從輕微型HE到昏迷；腦病昏迷階段AlzheimerⅡ型星形細胞增生；血氨、腦氨和谷氨酰胺濃度升高；存在誘發(fā)因素；對治療手段有可觀察的臨床反應(yīng)[4]。根據(jù)研究目的合理選擇并進一步完善合適且穩(wěn)定的HE動物模型對于進一步闡明HE的發(fā)病機制和尋求新的治療方法十分重要。

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(本文編輯：張苗)

(收稿日期：2015-08-31)

通信作者：石虹，Email: shi.hong@zs-hospital.sh.cn

基金項目：國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項目J1210041 (批準(zhǔn)號：NSFC grant J1210041)