微RNA調(diào)控間充質(zhì)干細胞軟骨分化的機制研究進展

楊坤　解磊　朱偉民　黃江鴻　段莉　王大平

·綜述·

微RNA調(diào)控間充質(zhì)干細胞軟骨分化的機制研究進展

楊坤解磊朱偉民黃江鴻段莉王大平

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是軟骨組織工程的一種理想種子細胞，體外條件下誘導MSCs軟骨分化，將直接影響組織工程修復軟骨的成敗。微RNA（microRNA，miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼、長度為22個核苷酸左右的單鏈RNA，在細胞增殖、分化、凋亡以及疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控與軟骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及信號通路靶基因的表達，以此調(diào)控MSCs軟骨分化。本文就miRNA調(diào)控MSCs軟骨分化的機制研究進展作一綜述。

微RNA；間充質(zhì)干細胞；軟骨分化；調(diào)控機制

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSCs）是一類來源于中胚層的成體干細胞，其來源十分廣泛，可以從骨髓、臍血、脂肪等組織中分離得到。MSCs具有自我增殖、更新的能力，并且可以被誘導向多種組織細胞分化，包括成骨細胞、成軟骨細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞及脂肪細胞［1］。MSCs不僅易于體外大量擴增，還是良好的外來基因?qū)胨拗?，在軟骨損傷疾病治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。MSCs軟骨分化主要經(jīng)歷間充質(zhì)細胞（前體軟骨細胞）、壓縮間充質(zhì)細胞、軟骨細胞、增殖型軟骨細胞、前體肥大化軟骨細胞及肥大化軟骨細胞這6個階段［2］，涉及多種轉(zhuǎn)錄因子、細胞生長因子和相關(guān)信號通路共同相互調(diào)控完成。

微RNA（microRNA，miRNA）是由內(nèi)源基因編碼的短鏈非編碼RNA［3］，以多種形式存在于基因組的基因間隔區(qū)［4］，通過與靶mRNA的非轉(zhuǎn)錄區(qū)特異性結(jié)合促進靶mRNA的降解和（或）抑制蛋白翻譯，從而抑制靶基因的表達［5］，以此影響細胞的增殖、分裂、分化、代謝以及凋亡等生物過程。有研究報道，多種miRNA通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及生長因子轉(zhuǎn)錄后水平來調(diào)控軟骨分化過程［6］。

一、軟骨分化相關(guān)調(diào)控因子

Sox（Sry?related high mobility groupbox）是一類與Y染色體上性別決定基因Sry同源、具有特征性HMG?box序列的基因家族。由于Sox編碼的產(chǎn)物可以與DNA上的特異性序列結(jié)合，因此Sox家族被認為在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Sox9作為一種轉(zhuǎn)錄因子，被認為是軟骨細胞表型的“主調(diào)控因子”，在軟骨分化中發(fā)揮重要作用［7］。Sox9在壓縮間充質(zhì)細胞及軟骨細胞中表達水平較高，調(diào)控Ⅱ型膠原、Ⅺ型膠原及蛋白聚糖的表達，對軟骨形成發(fā)揮重要作用［8］，其同源家族中的轉(zhuǎn)錄因子Sox5和Sox6能提高Sox9的活性，對軟骨形成也是必需的［9］。

轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor?β，TGF?β）是一類擁有眾多生物活性的多肽類生長因子，人體內(nèi)存在4種亞型。TGF?β具有多重生物學效應(yīng)，是調(diào)節(jié)MSCs增殖并向軟骨細胞方向分化的最主要因子之一［10］。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一類在骨和軟骨形成及穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用的生長因子，至今發(fā)現(xiàn)的BMP有17種，絕大部分屬于TGF?β超家族成員。段曉輝等［11］研究發(fā)現(xiàn)成骨細胞及破骨細胞可通過分泌BMP來誘導骨與軟骨的形成。BMP與Ⅰ、Ⅱ型BMP受體結(jié)合而激活Smad及促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路［12］。BMP?2和BMP?4是誘導軟骨細胞分化的重要生長因子。

纖維母細胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）是一種具有促進細胞有絲分裂、增殖與分化等多種生物活性的多聚肽。FGF通過結(jié)合細胞表面酪氨酸激酶受體和（或）纖維母細胞生長因子受體，激活包括MAPK及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）在內(nèi)的多種信號通路，從而對軟骨細胞分化進行調(diào)控［13］。

二、負向調(diào)控MSCs成軟骨分化的miRNA

轉(zhuǎn)錄因子Slug被認為是MSCs成軟骨分化的一種負向調(diào)控因子［14］。Lolli等［15］對人臍帶血來源MSCs分別進行了an?tagomiR?221轉(zhuǎn)染和siRNA沉默Slug的實驗，發(fā)現(xiàn)低水平的Slug和miR?221可以增加Ⅱ型膠原、轉(zhuǎn)錄因子Sox9及TRPS1的表達，進一步研究結(jié)果表明miR?221受到Slug的調(diào)節(jié)，這一研究提示可以通過下調(diào)MSCs軟骨分化負向調(diào)控的miR?NA，在轉(zhuǎn)錄后水平來促進干細胞成軟骨分化。Kim等［16］對雞的肢體MSCs成軟骨分化研究同樣表明miR?221負向調(diào)控MSCs成軟骨分化。然而，以上研究均并未發(fā)現(xiàn)miR?221的直接靶基因，也未能明確miR?221調(diào)控軟骨分化的具體機制。

Guérit等［17］的研究顯示在MSCs軟骨分化早期，miR?29a下調(diào)靶基因Foxo3A（一種轉(zhuǎn)錄因子）的表達，抑制MSCs軟骨分化。Djouad等［18］卻發(fā)現(xiàn)上調(diào)Foxo3A在軟骨分化中起到抑制軟骨分化作用。Yan等［19］研究鼠MSCs軟骨細胞分化時，發(fā)現(xiàn)miR?29a和miR?29b通過下調(diào)靶基因Col2a1表達，抑制MSCs軟骨分化。Foxo3A和Col2a1均為miR?29a的靶基因，一種miRNA可擁有多個靶基因，表明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復雜性。

Lee等［20］研究證實miR?495在Sox9的3′?UTR存在一個結(jié)合位點，miR?495直接通過下調(diào)Sox9的表達來抑制人MSCs的軟骨分化。Yang等［21］在研究鼠胚胎MSCs（C3H10T1/2細胞系）軟骨分化過程中發(fā)現(xiàn)miR?145下調(diào)靶基因Sox9表達，最終導致軟骨細胞標志基因Col2a1、Acan（蛋白聚糖）、Col9a2、Col11a1的mRNA水平降低。在人骨髓MSCs（hM?SCs）成軟骨分化和人的軟骨肉瘤細胞中miR?449a通過下調(diào)靶基因Lef1（Wnt信號通路重要組成部分）表達，使得Ⅱ型膠原和Sox9表達下調(diào)以及蛋白多糖的生成減少［22］。miR?199a抑制軟骨形成早期標志物表達，如軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP）、Ⅱ型膠原及Sox9［23］。Sox9作為miR?495和miR?145的靶基因，在MSCs成軟骨分化Wnt/β?catenin和TGF?β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路中起到重要作用。利用基因工程技術(shù)向MSCs轉(zhuǎn)染Sox9基因，通過上調(diào)Sox9表達來提高MSCs成軟骨分化潛能，這種在基因組水平調(diào)控干細胞軟骨分化的技術(shù)已經(jīng)成為目前及未來研究的熱點。Song等［24］利用TGF?β3對雞的肢體MSCs進行誘導軟骨分化，發(fā)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎上調(diào)表達的miR?181b出現(xiàn)表達下調(diào)。進一步的研究表明miR?181b是軟骨發(fā)育的負調(diào)控因子，抑制miR?181b的表達或許可以用于治療軟骨相關(guān)疾病。Hou等［25］對脂肪來源的干細胞誘導成軟骨分化，揭示miR?193b通過靶定TGF?β2和TGFBR3（TGF?β re?ceptor 3）來負向調(diào)控TGF?β信號通路，最終抑制干細胞早期的軟骨分化。

三、正向調(diào)控MSCs成軟骨分化的miRNA

Lin等［26］在研究鼠的MSCs軟骨分化中發(fā)現(xiàn)miR?335?5p和它的宿主基因Mest共表達，miR?335?5p過表達促進MSCs軟骨細胞分化。miR?335?5p靶向Daam1和ROCK1，后兩者均為Sox9的負調(diào)節(jié)因子。Sox9下調(diào)miR?29a和miR?29b的表達，后兩者為Mest負調(diào)節(jié)因子。因此從miR?335?5p→Sox9→Mest/miR?335?5p形成了一個正反饋，循環(huán)促進軟骨分化。然而，研究人員并未對此循環(huán)通路的作用及調(diào)控機制進行更加深入的研究，并且研究對象局限于鼠的MSCs。Karlsen等［27］的體外BMSCs軟骨分化實驗表明miR?140通過上調(diào)Sox9和Acan表達水平，促進hMSCs軟骨分化。RALA（v?ral白血病致病因子）被確認是miR?140的一個靶基因，軟骨分化過程中被抑制的RALA導致Sox9表達上調(diào)。研究人員發(fā)現(xiàn)RALA抑制Sox9蛋白翻譯，而不影響Sox9的mRNA轉(zhuǎn)錄，RALA與Sox9作用關(guān)系仍不清楚。Barter等［28］通過研究hMSCs成軟骨分化證明miR?140?5p是調(diào)控軟骨生成主要的miRNA，且miR ?140?5p調(diào)控與骨骼系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)的Wnt信號通路。Ham等［29］研究得出H?89（PKA抑制劑）和miR?23b通過下調(diào)PKA信號通路來誘導MSCs向軟骨細胞分化，并認為在MSCs軟骨分化過程中H?89誘導miR?23b表達。Ham等［30］從上述研究結(jié)果得到啟發(fā)后，對轉(zhuǎn)染H?89和（或）miR?23b關(guān)節(jié)液來源的MSCs進行誘導軟骨分化，顯示轉(zhuǎn)染組軟骨分化增加，通過上調(diào)miR?23b表達來抑制PKA信號通路可以提高自體軟骨治療的潛能。老化的MSCs分化潛能降低，Li等［31］發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)的miR?10a通過靶向Kruppel樣因子4（Kruppel?like factor 4，KLF4）增加老化的MSCs成脂肪、成骨及成軟骨分化能力。

四、其他差異性表達的miRNA

Han等［32］對骨髓來源MSCs體外誘導軟骨分化過程中的miRNA表達差異進行分析，篩選出4種（miR?130b、miR?152、miR?28、miR?26b）差異性表達的miRNA，但未對差異性表達的miRNA逐一進行功能、靶基因及干細胞成軟骨分化調(diào)控的研究。Zhang等［33］對脂肪來源的MSCs體外誘導軟骨分化前后的miRNA表達譜進行對比，顯示12種miRNA在誘導分化前后存在明顯差異性表達，其中包括8種上調(diào)表達的miRNA：miR?193b、miR?199a?3p、miR?455?3p、miR?210、miR?381、miR?92a、miR?320c及miR?136，及4種下調(diào)表達的miRNA：miR?490?5p、miR?4287、miR?BART8和miR?US25?1。隨后研究人員對差異性表達的miRNA進行了靶基因預測，這些靶基因可能參與干細胞成軟骨分化、增殖、凋亡，以及介導細胞內(nèi)相關(guān)信號通路。Yang等［34］對脂肪來源的干細胞進行相似的研究，發(fā)現(xiàn)干細胞成軟骨分化中12種上調(diào)表達的miRNA：miR?196a、miR?143、miR?383、miR?193b、let?7i、miR?26a、miR?539、miR?199a?3p、miR?337?5p、miR?146a?5p、miR?646及miR?381，8種下調(diào)表達的miRNA：miR?490?5p、miR?1307、miR?125b、miR?96?3p、miR?302?3p、miR?23a?3p、miR?590及miR?510，其中部分差異性表達的miRNA與Zhang的研究是相吻合的。隨后研究者對差異表達顯著的miR?196a和miR?490?5p進行研究，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR?490?5p的表達可以提高Col2a1、Col10a1及蛋白聚糖表達，骨形態(tài)蛋白受體2（bone morphogenetic protein receptor type 2，BMPR2）為miR?490?5p直接靶基因。Buechli等［35］揭示了miR?140在正常馬的軟骨及馬臍血來源MSCs軟骨分化14 d后的高表達。miR?140是一個軟骨發(fā)育和穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)因子，CXCL12（趨化因子配體-12）和ADAMTS?5（蛋白聚糖酶-2）是miR?140靶基因。Laine等［36］在對骨髓來源的MSCs誘導分化成軟骨中區(qū)別性地表達的miRNA分析后，發(fā)現(xiàn)miR?96在成軟骨中表達不增加，而miR?199a在成軟骨中被上調(diào)。Yang等［37］對鼠的MSCs軟骨分化四個不同階段實施miRNA微陣列，發(fā)現(xiàn)2個miRNA簇，miR?143/145和miR?132/212，在MSCs軟骨分化中持續(xù)下調(diào)。

MSCs軟骨分化是一個較為復雜的生物過程，這其中涉及眾多轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子及信號通路相互作用共同完成。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控軟骨分化過程中相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及信號通路分子，以此調(diào)控干細胞軟骨分化。但往往一個miRNA有多個潛在靶基因，而一個潛在靶基因又受到多個miRNA調(diào)控，這表明miRNA在干細胞軟骨分化過程中存在著復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對miRNA在MSCs軟骨分化過程的調(diào)控機制的研究，不僅有助于闡明干細胞分化分子機制，而且可以通過操縱相關(guān)miRNA來提高MSCs成軟骨分化潛能，最終為軟骨修復帶來新的希望。

［1］Vater C，Kasten P，Stiehler M.Culture media for the differentiation of mesenchymal stromal cells［J］.Actabiomater，2011，7（2）：463?477.

［2］Cancedda R，Descalzi Cancedda F，Castagnola P.Chondrocyte dif?ferentiation［J］.Int Rev Cytol，1995，159：265?358.

［3］Graves P，Zeng Y.Biogenesis of mammalian microRNAs：a global view［J］.Genomics Proteomicsbioinformatics，2012，10（5）：239?245.

［4］李海明，施南峰.miRNA——一種新的調(diào)控基因表達的小分子RNA［J］.中國癌癥雜志，2006，16（8）：675?678.

［5］Valinezhad Oranga，Safaralizadeh R，Kazemzadeh?Bavili M. Mechanisms of miRNA?mediated gene regulation from common downregulation to mRNA?specific upregulation［J］.Int J Genom?ics，2014：970607.

［6］Wu C，Tianb，Qu X，etal.MicroRNAs playa role in chondrogene?sisand osteoarthritis（review）［J］.Int J Mol Med，2014，34（1）：13?23.

［7］Bi W，Deng JM，Zhang Z，etal.Sox9 is required for cartilage forma?tion［J］.Nat Genet，1999，22（1）：85?89.

［8］Akiyama H.Control of chondrogenesisby the transcription factor Sox9［J］.Mod Rheumatol，2008，18（3）：213?219.

［9］Ikeda T，Kawaguchi H，Kamekura S，etal.Distinct roles of Sox5，Sox6，and Sox9 in different stages of chondrogenic differentia?tion［J］.Jbone Miner Metab，2005，23（5）：337?340.

［10］楊玥，薛同圓，田京.軟骨形成過程中的轉(zhuǎn)化生長因子［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（46）：8714?8717.

［11］段曉輝，屈曉旋，常晉瑞.骨骼的內(nèi)分泌功能［J］.生理科學進展，2010，41（4）：248?255.

［12］Pogue R，Lyons K.BMP signaling in the cartilage growth plate［J］. Curr Top Devbiol，2006，76：1?48.

［13］Itoh N，Ornitz DM.Fibroblast growth factors：from molecular evolu?tion to roles in development，metabolismand disease［J］.Jbio?chem，2011，149（2）：121?130.

［14］Lisignoli G，Manferdini C，Lambertini E，etal.Chondrogenic po?tential of slug?depleted human mesenchymal stem cells［J］.Tissue Eng Parta，2014，20（19?20）：2795?2805.

［15］Lollia，Lambertini E，Penolazzi L，etal.Pro?chondrogenic effect of miR?221and slug depletion in human MSCs［J］.Stem Cell Rev，2014，10（6）：841?855.

［16］Kim D，Song J，Jin EJ.MicroRNA?221 regulates chondrogenic dif?ferentiation through promoting proteosomal degradation of slugby targeting Mdm2［J］.Jbiol Chem，2010，285（345）：26900?26907.

［17］Guérit D，Brondello JM，Chuchana P，etal.FOXO3A regulationby miRNA?29a controls chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cellsand cartilage formation［J］.Stem Cells Dev，2014，23 （11）：1195?1205.

［18］Djouad F，Bony C，Canovas F，etal.Transcriptomicanalysis identi?fies Foxo3Aasa novel transcription factor regulating mesenchymal stem cell chrondrogenic differentiation［J］.Cloning Stem Cells，2009，11（3）：407?416.

［19］Yan C，Wang Y，Shen XY，etal.MicroRNA regulationassociated chondrogenesis of mouse MSCs grown on polyhydroxyalkano?ates［J］.Biomaterials，2011，32（27）：6435?6444.

［20］Lee S，Yoon DS，Paik S，etal.MicroRNA?495 inhibits chondrogen?ic differentiation in human mesenchymal stem cellsby targeting Sox9［J］.Stem Cells Dev，2014，23（15）：1798?1808.

［21］Yangb，Guo H，Zhang Y，etal.MicroRNA?145 regulates chondro?genic differentiation of mesenchymal stem cellsby targeting Sox9［J］.PLoS One，2011，6（7）：e21679.

［22］Paik S，Jung HS，Lee S，etal.miR?449a regulates the chondrogene?sis of human mesenchymal stem cells through direct targeting of lymphoid enhancer?binding factor?1［J］.Stem Cells Dev，2012，21 （18）：3298?3308.

［23］Lin EA，Kong L，Bai XH，etal.miR?199a，abone morphogenic pro?tein 2?responsive microRNA，regulates chondrogenesis via direct targeting to Smad1［J］.Jbiol Chem，2009，284（17）：11326?11335.

［24］Song J，Lee M，Kim D，etal.MicroRNA?181b regulatesarticular chondrocytes differentiationand cartilage integrity［J］.Biochembiophys Res Commun，2013，431（2）：210?214.

［25］Hou C，Yang Z，Kang Y，etal.MiR?193b regulates early chondro?genesisby inhibiting the TGF?beta2 signaling pathway［J］.FEBS Lett，2015，589（9）：1040?1047.

［26］Lin X，Wu L，Zhang Z，etal.MiR?335?5p promotes chondrogene?sis in mouse mesenchymal stem cellsand is regulated through two positive feedback loops.［J］.Jbone Miner Res，2014，29（7）：1575?1585.

［27］Karlsen TA，Jakobsen RB，Mikkelsen TS，etal.microRNA?140 tar?gets RALAand regulates chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cellsby translational enhancement of SOX9andaCAN［J］.Stem Cells Dev，2014，23（3）：290?304.

［28］Barter MJ，Tselepi M，Gómez R，etal.Genome?wide microRNAand geneanalysis of mesenchymal stem cell chondrogenesis identi?fiesan essential roleand multiple targets for miR?140?5p［J］.Stem Cells，2015，33（11）：3266?3280.

［29］Ham O，SongbW，Lee SY，etal.The role of microRNA?23b in the differentiation of MSC into chondrocyteby targeting protein kinasea signaling［J］.Biomaterials，2012，33（18）：4500?4507.

［30］Ham O，Lee CY，SongbW，etal.Upregulation of miR?23b enhanc?es theautologous therapeutic potential for degenerativearthritisby targeting PRKACB in synovial fluid?derived mesenchymal stem cells from patients［J］.Mol Cells，2014，37（6）：449?456.

［31］Li J，Dong J，Zhang ZH，etal.miR?10a restores human mesenchy?mal stem cell differentiationby repressing KLF4［J］.J Cell Physi?ol，2013，228（12）：2324?2336.

［32］Han J，Yang T，Gao J，etal.Specific microRNA expression during chondrogenesis of human mesenchymal stem cells［J］.Int J Mol Med，2010，25（3）：377?384.

［33］Zhang Z，Kang Y，Zhang Z，etal.Expression of microRNAs during chondrogenesis of humanadipose?derived stem cells［J］.Osteoar?thritis Cartilage，2012，20（12）：1638?1646.

［34］Yang Z，Hao J，Hu ZM.MicroRNA expression profiles in humanadipose?derived stem cells during chondrogenic differentiation［J］. Int J Mol Med，2015，35（3）：579?586.

［35］Buechli ME，Lamarre J，Koch TG.MicroRNA?140 expression dur?ing chondrogenic differentiation of equine cordblood?derived mes?enchymal stromal cells［J］.Stem Cells Dev，2013，22（8）：1288?1296.

［36］Laine SK，Alm JJ，Virtanen SP，etal.MicroRNAs miR?96，miR?124and miR?199a regulate gene expression in humanbone marrow?derived mesenchymal stem cells［J］.J Cellbiochem，2012，113（8）：2687?2695.

［37］Yangb，Guo H，Zhang Y，etal.The microRNA expression profiles of mouse mesenchymal stem cell during chondrogenic differentia?tion［J］.BMB Rep，2011，44（1）：28?33.

10.3969/j.issn.1674?8573.2016.03.018

國家自然科學基金（81572198），廣東省自然科學基金（2015A030313772）

518000廣東深圳，安徽醫(yī)科大學深圳市第二人民醫(yī)院臨床學院（楊坤、王大平）；深圳市第二人民醫(yī)院組織工程重點實驗室（楊坤、解磊、朱偉民、黃江鴻、段莉、王大平）

王大平，E?mail：dapingwang1963@qq.com

2015?09?14）