MIN6細(xì)胞系的細(xì)胞學(xué)特性及其應(yīng)用

馮俊杰 戴陽(yáng)麗 王秀敏

·綜述·

MIN6細(xì)胞系的細(xì)胞學(xué)特性及其應(yīng)用

馮俊杰 戴陽(yáng)麗 王秀敏

MIN6細(xì)胞系是從表達(dá)類人猿病毒40大T抗原(受胰島毒啟動(dòng)子控制)的轉(zhuǎn)基因非肥胖糖尿病小鼠胰島瘤中建立的，其內(nèi)分泌功能與胰腺組織非常接近，是研究胰島細(xì)胞功能的理想模型。MIN6細(xì)胞系可用于胰腺分泌的研究，β細(xì)胞的適宜刺激信號(hào)的探索；1型糖尿病發(fā)病機(jī)制的研究；氧化應(yīng)激、自噬、游離脂肪酸對(duì)2型糖尿病發(fā)病的影響；在胰腺移植后發(fā)生排斥的機(jī)制研究。

MIN6；糖尿??；細(xì)胞學(xué)特性；自噬

由于人原代胰島細(xì)胞獲取困難，且不能連續(xù)傳代，所以多選用體外培養(yǎng)胰島β細(xì)胞的細(xì)胞株作為替代，常用的有大鼠胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞株(RINm5F)及倉(cāng)鼠胰島β細(xì)胞(HIT-T15)。其在胰島素基因的研究中廣泛應(yīng)用，缺點(diǎn)是胰島素分泌遠(yuǎn)低于正常胰島細(xì)胞，且葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)也與β細(xì)胞有所不同，故不能完全替代正常β細(xì)胞。小鼠胰島素瘤細(xì)胞(MIN6細(xì)胞系)是從小鼠胰島β細(xì)胞瘤或胰島細(xì)胞瘤中分離得到的永久細(xì)胞系，它保留了胰島細(xì)胞的GSIS，對(duì)腦型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)不敏感，而特異地對(duì)肝型GLUT敏感，可以反映胰島β細(xì)胞的功能變化，是研究胰島細(xì)胞功能的理想模型。以下就MIN6細(xì)胞系的細(xì)胞學(xué)特性及其在研究中的作用作一綜述。

1 MIN細(xì)胞系的制備和功能

MIN6細(xì)胞系是從胰島素啟動(dòng)子控制下的表達(dá)類人猿病毒40大T抗原的轉(zhuǎn)基因非肥胖糖尿病小鼠胰島瘤中建立的[1]。將這些小鼠喂養(yǎng)至13周處死，切除腫瘤后獲得腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)單獨(dú)洗滌，加入DMEM培養(yǎng)基后在培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。2周后，得到緊密排列、密集生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆，用胰蛋白酶常規(guī)消化后進(jìn)行細(xì)胞傳代。最終得到兩個(gè)細(xì)胞系：從IT6模型小鼠的腫瘤細(xì)胞中得到單一細(xì)胞克隆即是MIN6細(xì)胞系，而從IT7模型中獲得的是MIN7細(xì)胞系。MIN6細(xì)胞系經(jīng)孵育12 h后，取上清液，離心去除細(xì)胞碎片，儲(chǔ)存于-20℃。MIN6細(xì)胞系的GSIS與胰島細(xì)胞基本相似，是一種被廣泛使用的β細(xì)胞系。Nakashima等[2]發(fā)現(xiàn)，MIN6細(xì)胞還可分泌胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和ghrelin，提示其是體外代替胰島組織培養(yǎng)的較好的細(xì)胞系。

2 MIN6細(xì)胞系的細(xì)胞學(xué)特性

MIN6和MIN7細(xì)胞系都是由類人猿病毒40大T抗原啟動(dòng)子所激發(fā)而得到的，兩者都呈均勻形態(tài)、集落生長(zhǎng)，有一定的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，包含較高水平的胰島素mRNA和類人猿病毒40T抗原mRNA。免疫組化分析也提示它們是由同一種胰島β細(xì)胞分化演變而來(lái)。但兩者的GSIS不同，MIN6細(xì)胞系分泌胰島素的量隨血糖升高而顯著升高，這與體外培養(yǎng)的正常胰島細(xì)胞基本相似。它們都能產(chǎn)生較高水平的肝型GLUT mRNA，MIN6細(xì)胞系只能產(chǎn)生少量的腦型GLUT mRNA。故MIN6細(xì)胞系在功能上更接近于胰島β細(xì)胞。

MIN6細(xì)胞系保留了β細(xì)胞特性，可以在血糖和其他促分泌因素刺激下分泌胰島素。但是MIN6細(xì)胞在多次傳代后會(huì)發(fā)生基因改變，從而失去分泌胰島素的能力，這些基因的改變包括下調(diào)某些基因如磷脂酶D1和膽囊收縮素。多次傳代的細(xì)胞對(duì)某些蛋白也會(huì)出現(xiàn)低表達(dá)，包括參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和活性氧簇生成的抗氧化酶。GLUT是葡萄糖通過(guò)細(xì)胞膜的重要受體，其中GLUT9和GLUT2也參與了GSIS[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，傳代次數(shù)不多的MIN6細(xì)胞系GLUT2的表達(dá)幾乎沒(méi)有差異，與多次傳代的MIN6細(xì)胞系相比較，在基因和蛋白水平的表達(dá)均有改變，但是不影響代謝結(jié)果[4]。近年來(lái)Yamato等[5]發(fā)現(xiàn)，MIN6亞群C4更好的保留了GSIS能力，更適用于體外胰島β細(xì)胞系研究。

MIN6細(xì)胞系不僅可以分泌胰高血糖素樣肽-1，其信號(hào)可以通過(guò)一種自分泌方式被放大，從而維持其胰島素分泌的功能[6]。這是MIN6細(xì)胞系生存和分泌胰島素的基礎(chǔ)。

3 MIN6細(xì)胞系的臨床應(yīng)用

3.1 測(cè)定胰腺分泌的激素 胰腺組織有5種內(nèi)分泌細(xì)胞：分泌胰高血糖素的α細(xì)胞，分泌胰島素的β細(xì)胞，分泌生長(zhǎng)抑素的δ細(xì)胞，分泌胰多肽的γ細(xì)胞，分泌ghrelin的ε細(xì)胞。它們共同維持血糖的穩(wěn)定。MIN6細(xì)胞系可分泌以上5種激素[2]。Nakashima等[2]發(fā)現(xiàn)MIN6細(xì)胞系可以表達(dá)Pdx1，NeuroD，Nkx6.1，Nkx2.2，Pax6，Ngn3，Pax4，Bran4和CckBr等基因，而這些基因同樣也在胰島中表達(dá)。

3.2 在氨基酸研究中的應(yīng)用 某些氨基酸，如L-谷氨酸和L-精氨酸，是胰島β細(xì)胞的適宜刺激信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，在接受L-谷氨酸和L-精氨酸刺激后，MIN6細(xì)胞內(nèi)三磷酸肌醇和Ca2+濃度均顯著上升，這有助于了解Tas1R家族的表達(dá)情況[7]。所以，可以利用MIN6細(xì)胞系表達(dá)氨基酸受體作相關(guān)研究。

AMP活化蛋白激酶(AMPK)是反映細(xì)胞狀態(tài)的傳感器，其活化影響了胰島β細(xì)胞的GSIS。哺乳動(dòng)物的AMPK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其功能是滅活葡萄糖。MIN6細(xì)胞系中，蛋白激酶A使AMPKα1 Ser173、Ser485和Ser497位點(diǎn)磷酸化，通過(guò)上游激酶活化而阻礙了Thr172磷酸化[8]。蛋白激酶B則使AMPKαS485位點(diǎn)活化，并抑制肝激酶B1(LKB1)的Thr172磷酸化，從而減少AMPK的活化。但使用INS-1β細(xì)胞系在研究過(guò)程中得到不同結(jié)果，蛋白激酶B引起AMPKαSer485位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，阻止了LKB1Thr172的磷酸化，由于AMPK-LKB1間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而降低了AMPK的活性。出現(xiàn)這種矛盾的結(jié)果可能與使用不同的細(xì)胞系有關(guān)[9]。王威等[10]發(fā)現(xiàn)，MIN6細(xì)胞系對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力優(yōu)于INS-1細(xì)胞系。

3.3 在糖尿病發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用

3.3.1 1型糖尿病 1型糖尿病是一種具有嚴(yán)重炎性反應(yīng)的慢性自身免疫性疾病，由于胰島β細(xì)胞大量破壞引起胰島素分泌不足，導(dǎo)致機(jī)體糖代謝紊亂[11]。通過(guò)對(duì)MIN6細(xì)胞系的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-146、miR-21、miR-34a在白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等誘導(dǎo)的β細(xì)胞功能衰竭中有重要作用，而miR-34、miR-146a能保護(hù)MIN6細(xì)胞免受細(xì)胞因子誘發(fā)的死亡，提示微小RNA異常可能引起自身免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致1型糖尿病[12]。曹朝暉等[13]的研究認(rèn)為，caspase-3激活與MIN6細(xì)胞凋亡有關(guān)，炎性反應(yīng)因子可能通過(guò)激活凋亡相關(guān)蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，這其中可能涉及細(xì)胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。以MIN6細(xì)胞系為例，對(duì)1型糖尿病的發(fā)生有一定的意義。

3.3.2 2型糖尿病 代謝綜合征是2型糖尿病的高危因素之一，Ding等[14]通過(guò)對(duì)MIN6細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可以通過(guò)核因子-κB-誘導(dǎo)型一氧化氮合酶-一氧化氮途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子MafA的表達(dá)，而該途徑是高尿酸作用于胰島β細(xì)胞的關(guān)鍵，由此降低高尿酸相關(guān)性代謝綜合征的發(fā)生幾率，進(jìn)而降低高尿酸相關(guān)性糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。硫化殼寡糖可以對(duì)抗過(guò)氧化氫對(duì)MIN6細(xì)胞系的損害，其機(jī)制可能是增強(qiáng)了抗氧化酶的活性，并抑制胞內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生[15]。生理?xiàng)l件下，自噬主要受外源性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的調(diào)節(jié)，當(dāng)機(jī)體處于饑餓狀態(tài)時(shí)，自噬活性增加。同時(shí)，自噬也是機(jī)體消除錯(cuò)誤折疊的大分子、衰老及失能的細(xì)胞器的一種途徑。自噬與2型糖尿病有潛在的關(guān)系，作為機(jī)體防御機(jī)制可清除失能細(xì)胞器導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16]。胰島素能抑制自噬，通過(guò)激活mTOR依賴性信號(hào)通路，與靶細(xì)胞表面胰島素受體結(jié)合誘導(dǎo)自身磷酸化，最終使ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合體失去活性，從而抑制自噬[17-18]。而2型糖尿病患者由于胰島素抵抗，相關(guān)作用減弱，最終導(dǎo)致細(xì)胞自噬增強(qiáng)。杜世春等[19]發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終末產(chǎn)物可以抑制MIN6細(xì)胞活力，并使細(xì)胞內(nèi)活性氧簇的生成增加，誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞氧化應(yīng)激，從而影響胰島素分泌。

RIP140是代謝性核受體輔助因子家族中的一員，主要作為抑制因子調(diào)控肝臟、肌肉及脂肪中的糖、脂代謝。2型糖尿病患者外周血單核細(xì)胞中RIP140的表達(dá)較正常明顯升高。敲除小鼠RIP140基因能改善高脂飲食條件下的胰島素抵抗、增加胰島素刺激時(shí)的糖攝取，同時(shí)還可以抑制年齡和飲食誘導(dǎo)的糖耐量異常的發(fā)生。下調(diào)RIP140表達(dá)能夠通過(guò)上調(diào)能量消耗相關(guān)基因來(lái)改善細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。薛君力等[20]通過(guò)利用H2O2建立了MIN6細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷模型，并利用RNA干擾下調(diào)MIN6細(xì)胞中的RIP140表達(dá)，觀察到以RIP140為靶點(diǎn)可以調(diào)控β細(xì)胞損傷。

3.3.2.1 β細(xì)胞胰島素分泌 β細(xì)胞分泌胰島素是一個(gè)雙相的過(guò)程。第一時(shí)相發(fā)生較快，在血糖變化后10 min之內(nèi)，分泌高峰在1～2 min。第二時(shí)相出現(xiàn)較晚，但持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，峰值在25～30 min。2型糖尿病患者最初第一時(shí)相受損，但保留了第二時(shí)相的功能。故是否存在第一時(shí)相的損害是預(yù)測(cè)1型和2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的因素之一。通過(guò)對(duì)MIN6細(xì)胞的觀察，多次傳代的MIN6細(xì)胞形態(tài)不均勻，失去了第一時(shí)相功能，GSIS完全受損，胞內(nèi)ATP明顯減少，葡萄糖吸收、氧化和脂質(zhì)氧化也減少，糖酵解基因和脂質(zhì)處理基因包括Srebp1c表達(dá)降低，導(dǎo)致Sirt3和Nampt基因表達(dá)降低，乳酸含量減少，一些脂類合成基因也出現(xiàn)了低表達(dá)，包括重要的轉(zhuǎn)錄因子Srebp1c。這也使得GLUT1明顯下降，GLUT2也有下降的趨勢(shì)。已知ATP/ADP比值上調(diào)是β細(xì)胞釋放胰島素所必須的，其可能會(huì)通過(guò)提高吸收葡萄糖并氧化來(lái)提高ATP[4]。

3.3.2.2 游離脂肪酸(FFA)的毒性作用 FFA對(duì)β細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用。高水平FFA可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子耗盡，而β細(xì)胞需要鈣離子的儲(chǔ)備。故β細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激非常敏感，鈣離子缺乏會(huì)誘導(dǎo)其凋亡。棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡與尿酸相關(guān)性代謝綜合征內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。脂肪酸可以激活G蛋白耦聯(lián)受體40(GPR40)，提高胞內(nèi)游離鈣離子，并可以促進(jìn)GSIS。持續(xù)高水平的FFA使β細(xì)胞受到破壞，并可能通過(guò)GPR40導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子功能紊亂。GPR40基因敲除小鼠在高脂飲食條件下對(duì)肝脂肪變性、高甘油三酯血癥和其他一些糖尿病相關(guān)性疾病有抵抗，GPR40過(guò)度表達(dá)可以導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)糖尿病表型。實(shí)驗(yàn)證明飽和脂肪酸如棕櫚酸可導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡，而GPR40拮抗劑DC260126在48 h內(nèi)可以呈劑量依賴方式保護(hù)MIN6細(xì)胞避免被誘導(dǎo)凋亡。提示GPR40參與了棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡[21]。人類白血病相關(guān)基因16可以調(diào)節(jié)MIN6細(xì)胞系的胰島素分泌和GSIS，其過(guò)表達(dá)還可以加強(qiáng)MIN6細(xì)胞系對(duì)脂毒性的抗凋亡作用，而ghrelin則可以通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途徑對(duì)MIN6細(xì)胞系起到相同的作用[22-23]。

3.4 胰腺移植后排斥 雷帕霉素(西羅莫司)是一種胰腺移植術(shù)后常用的免疫抑制劑，但是長(zhǎng)期使用這種藥物的患者胰島細(xì)胞功能和活力會(huì)受損。對(duì)胰腺移植失敗的患者進(jìn)行尸檢，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)移植的胰腺發(fā)生了自身免疫或同種免疫性損害，提示移植失敗是由非免疫性因素所導(dǎo)致的，如藥物毒性。對(duì)MIN6細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雷帕霉素的藥理作用是通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)完成的，mTOR存在兩個(gè)配體，mTORC1和mTORC2。mTORC1對(duì)雷帕霉素高度敏感，而mTORC2則不敏感。研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素對(duì)MIN6細(xì)胞系的功能及壽命均有有害影響。鏈唑霉素可以誘導(dǎo)β細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，蛋白激酶B通過(guò)介導(dǎo)胰島素的抗凋亡因子如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1和胰高血糖素樣肽-1，保護(hù)了β細(xì)胞。蛋白激酶Bα基因敲除的小鼠出現(xiàn)β細(xì)胞數(shù)量下降，而蛋白激酶Bβ基因敲除小鼠出現(xiàn)β細(xì)胞質(zhì)量下降，兩者都可導(dǎo)致凋亡增加[24]。提示雷帕霉素引起的損害是由mTOR2抑制介導(dǎo)的。

綜上所述，MIN6細(xì)胞系是從小鼠胰腺腫瘤細(xì)胞得到的一個(gè)細(xì)胞系，其來(lái)源于胰島β細(xì)胞，與胰腺組織功能上較為相近，是研究胰腺功能的較好的一種細(xì)胞系，在糖尿病研究等領(lǐng)域有著較為廣泛的應(yīng)用。

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CytologicalcharacteristicsandapplicationofMIN6cellline

FengJunjie,DaiYangli,WangXiumin.

DepartmentofEndocrinology,TheChildren′sHospitalofZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,CHina

Correspondingauthor:WangXiumin,Email:wangxiumin1019@126.com

MIN6 cell line is established from insulinomas obtained by targeted expression of the simian virus 40 T antigen in transgenic non-obese diabetic mice. The endocrine function of MIN6 cells is similar to pancreatic tissue, which makes it an ideal model in researching the function of islet cells . The MIN6 cell line is used in pancreatic secretion in recent years, and also in finding stimulus signal to β cells. MIN6 cell line is used to study the pathogenesis of type 1 diabetes as well as the effects of oxidative stress, autophagy and free fatty acids on the pathogenesis of type 2 diabetes. At the same time, it can be used to discuss the mechanism in reject reaction after pancreas transplantation.

MIN6；Diabetes mellitus；Cytological characteristics; Autophagy

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30971125，81370930)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.014

310003 杭州，浙江大學(xué)附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科(馮俊杰，戴陽(yáng)麗，王秀敏)；314001 浙江省嘉興市第一醫(yī)院兒科(馮俊杰)；200127 上海兒童醫(yī)學(xué)中心(王秀敏)

王秀敏，Email：wangxiumin1019@126.com

FundProgramThe National Natural Science Foundation of China(30971125, 81370930)

2015-05-27)