熒光定量PCR在結(jié)核菌快速檢測中的應用分析

杜安玲

(安陽市結(jié)核病防治所　河南 安陽　455000)

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熒光定量PCR在結(jié)核菌快速檢測中的應用分析

杜安玲

(安陽市結(jié)核病防治所河南 安陽455000)

目的探討熒光定量PCR在結(jié)核菌快速檢測中的應用效果。方法選取安陽市結(jié)核病防治所2014年6月至2014年12月就診的100例呼吸系統(tǒng)疾病患者(臨床陽性痰分離株100份)，應用熒光定量PCR技術(shù)檢測。結(jié)果熒光定量PCR檢測準確率為97%，菌種鑒定特異性實驗符合率為100%。結(jié)論結(jié)核菌快速培養(yǎng)法如熒光定量PCR技術(shù)經(jīng)濟、簡單，結(jié)果可靠，特異度和敏感性均居較高水平，鑒別診斷能力較強，實驗室可據(jù)自體條件對不同的檢測方法進行選擇。

結(jié)核菌；熒光定量PCR；快速檢測

近年來，受多種因素影響，結(jié)核病發(fā)病率有上升表現(xiàn)，我國屬結(jié)核病高負擔國家，對公眾生命安全構(gòu)成了嚴重影響。結(jié)核病快速檢測可為診治提供依據(jù)，是加強防控效果的關鍵[1]。本次選取相關病例，依據(jù)需要，應用熒光定量PCR檢測，現(xiàn)將相關內(nèi)容總結(jié)如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取安陽市結(jié)核病防治所2014年6月至2014年12月就診的100例呼吸系統(tǒng)疾病患者(痰液標本陽性)，年齡20～60歲，平均(45.2±5.8)歲，男62例，女38例。

1.2檢測方法應用熒光定量PCR試劑盒(美國原裝進口)和熒光定量PCR儀；取受試對象清晨痰液，以等體積的NaOH(4%)加入，在室溫下液化30 min，若溶液仍黏稠，取出部分痰液，再取4倍體積NaOH(4%)加入；在生物安全柜內(nèi)將液化標本取出1 ml左右，12 000 r/min離心5 min，棄上清，重復操作，加入核酸提取液50 μl，混勻，使沉淀物懸浮，100 ℃置樣管10 min，后放置4 ℃環(huán)境下冷卻，離心2 min，吸取上清，將反應模板保存在4 ℃環(huán)境中。依據(jù)PCR反應體系配置，設置測試循環(huán)，94 ℃、2 min，94℃、15 s，72 ℃、40 s，55 ℃、15 s，共40個循環(huán)，在實驗前調(diào)整增益值，完成擴增程序。

1.3觀察指標統(tǒng)計PCR檢測結(jié)果，并計算其準確率和特異性實驗符合率。

2　結(jié)果

熒光定量PCR檢測準確率為97%，菌種鑒定特異性實驗符合率為100%。

3　討論

傳統(tǒng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)方法時間較長，為2～3個月，增加了防控、治療藥物選擇、結(jié)核病診斷的難度。在世界范圍內(nèi)，快速診斷結(jié)核病的方法均已成為關注的焦點，快速診斷技術(shù)近年的研發(fā)和應用也為耐藥結(jié)核和不典型結(jié)核診治提供了較大幫助，本文就快速檢測結(jié)核菌及耐藥菌技術(shù)加以探討。

結(jié)核桿菌培養(yǎng)方法： ①液體培養(yǎng)法：在液體培養(yǎng)基中，結(jié)核桿菌生長速度較快，設備、方法均較簡單，故在中低收入國家，WHO推薦應用此方法完成相關檢驗。如分枝桿菌快速手工培養(yǎng)，不管對一或二線藥物，行藥敏測試均有效、精確、簡單。檢測異煙肼和利福平敏感性的準確率在90%以下，結(jié)果7～14 d即獲得[2]。應用MGIT960自動培養(yǎng)系統(tǒng)，其工作原理與分枝桿菌快速手工培養(yǎng)相同，但熒光信號讀取和培養(yǎng)由儀器按事先設計程序自動控制。對此系統(tǒng)測定結(jié)果薈萃分析，預測值和精確性均居較高水平，用二線藥敏試驗，結(jié)果與放射測量法一致[3]。此方法檢測氧氟沙星特異性和敏感性均達100%，效果較理想，但設備需資金，儀器最大工作負荷對樣品量有所限制，在小規(guī)模實驗室中適合應用。具體技術(shù)：a.The BacT/Alert 3D系統(tǒng)，應用改良肉湯培養(yǎng)基(7H9 Middlebrook)，取比色傳感器裝在試管底部，能感受細菌代謝產(chǎn)生的CO2，由綠向黃色轉(zhuǎn)換，儀器對顏色變化自動持續(xù)監(jiān)測。此系統(tǒng)在結(jié)核菌快速培養(yǎng)中有較好的藥敏檢測特異度和靈敏度。b.The Versa TREK系統(tǒng)，應用肉湯培養(yǎng)基(富含7H9 Middlebrook)，細菌代謝在一定程度上使培養(yǎng)容器內(nèi)壓力出現(xiàn)變化，可監(jiān)測壓力變化和細菌生長情況，在同一裝置內(nèi)完成培養(yǎng)和檢測。c.顯微鏡對肉湯-藥敏觀察測試，結(jié)核桿菌生長過程中有特征性的繩帶形成，在24孔板中用液體培養(yǎng)基(含或不含抗生素)對細菌培養(yǎng)，應用倒置顯微鏡對結(jié)核菌特征性Cord相關形成情況用40倍鏡頭觀察。對MODS測試異煙肼和利福平的敏感性薈萃分析，涂陽痰標本特異性為96%，結(jié)果在平均21 d時即100%得出，操作較為簡單。d.比色氧化還原指標劑法，在培養(yǎng)基(含或不含抗結(jié)核藥)中放置氧化還原指示劑，培養(yǎng)基顏色在細菌生長時有改變，對兩管培養(yǎng)的顏色對比，可對結(jié)核菌是否耐藥進行判斷。對耐藥性監(jiān)測進行薈萃分析表明，特異性和敏感性均居較高水平。臨床有多種氧化還原指示劑，可依據(jù)不同藥物對相對敏感的指示器進行選擇。e.載玻片培養(yǎng)技術(shù)，在載玻片培養(yǎng)基礎上加強改進的一種新型快速培養(yǎng)技術(shù)，在滅菌載玻片一端將10個樣品涂片縱切成兩半，放入培養(yǎng)瓶(7 ml液體培養(yǎng)基)，取不含抗結(jié)核藥的3瓶作對照，其他瓶做藥敏試驗(含抗結(jié)核藥)，在冰箱中過夜，將培養(yǎng)瓶在次日由培養(yǎng)箱中移入，培養(yǎng)10 d。載玻片取出后干燥，染色，顯微鏡下觀察抗酸菌落。當對照組菌落最少有1個，藥敏組仍有菌落時，即產(chǎn)生耐藥。此法對利福平的精確度為96%，對異煙肼的精確度為90%。此方法原理較為簡單，但操作復雜。②固定培養(yǎng)措施：a.TK培養(yǎng)基結(jié)核菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)，結(jié)核桿菌代謝活動可促使培養(yǎng)基色澤發(fā)生改變，可在形成細菌菌落前依據(jù)培養(yǎng)基顏色對分枝桿菌是否生長加以鑒定。方法經(jīng)濟、簡單，出結(jié)果時間較常規(guī)培養(yǎng)縮短10 d。該技術(shù)可排除常見細菌污染，對非結(jié)核與結(jié)核分枝桿菌進行鑒別，完善質(zhì)量控制，規(guī)范應用條件，為一種有前途、實用的措施。b.噬菌體法，采用噬菌體生物擴增法快速檢測結(jié)核菌，對基本原理進行分析，在含結(jié)核分枝桿菌待測樣品中引入特異性裂解分枝桿菌噬菌體，噬菌體能感染活分枝桿菌，多余的未進入菌體的噬菌體加入消毒劑中滅活，已入菌體內(nèi)的噬菌體未受相關影響[4]。在受感染分枝桿菌內(nèi)，噬菌體大量繁殖并裂解菌體，有大量子代噬菌體釋放，可感染隨后加入的相關指示細胞并對其裂解，觀察瓊脂平板培養(yǎng)基，有透明噬菌斑出現(xiàn)。依據(jù)噬菌斑數(shù)量對標本中有無活結(jié)核分枝桿菌進行判斷[4]。

本研究應用DNA探針對臨床標本直接鑒定，可對鳥結(jié)核分枝桿菌、復合結(jié)核桿菌進行辨別，結(jié)果示，熒定量PCR檢測準確率為97%，菌種鑒定特異性實驗符合率為100%。

綜上，結(jié)核菌快速培養(yǎng)法經(jīng)濟、簡單，結(jié)果可靠，但獲取結(jié)果時間仍需10～20 d。核酸擴增1～2 d或幾小時均可得到結(jié)果，有較高的特異度和敏感性，鑒別診斷能力較強，實驗室可仍據(jù)自體條件對不同的檢測方法進行選擇。

[1]周華.耐藥結(jié)核菌檢測技術(shù)的國內(nèi)研究進展[J].貴州醫(yī)藥,2012,36(3):279-280.

[2]張西雁,張春智,陳剛,等.依賴利福平結(jié)核菌肺結(jié)核一例分析[J].中華傳染病雜志,2008,26(2):110-111.

[3]張娟,孫炳奇,孫嬌,等.兩種基因診斷技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測效果比較[J].實用醫(yī)學雜志,2014,30(9):1482-1485.

[4]趙麗,趙緒永,陳紅英,等.PPV SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[J].西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版),2012,40(5):19-23.

R 446.5doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2016.09.094

2015-12-27)