原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面TNF—α的表達(dá)

楊美霞　宋芳　趙紫薇

[摘要] 目的 研究TNF-α在原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜及絨毛組織中的表達(dá)水平及意義。 方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)和圖像分析，分別對(duì)30例原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者（病例組）和30例正常妊娠者（對(duì)照組） 蛻膜和絨毛組織中TNF-α的表達(dá)進(jìn)行定位和半定量分析。 結(jié)果 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在蛻膜組織中，TNF-α蛋白表達(dá)于蛻膜細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，絨毛組織中，TNF-α蛋白表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。蛋白含量測(cè)定結(jié)果顯示，病例組TNF-α蛋白表達(dá)高于對(duì)照組。 結(jié)論 病例組蛻膜和絨毛組織中TNF-α蛋白表達(dá)的升高與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有關(guān)，TNF-α可能參與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病理過程。

[關(guān)鍵詞] 原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；TNF-α；蛻膜；絨毛

[中圖分類號(hào)] R714.21 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）24-78-03

[Abstract] Objective To study the expression of TNF-α in decidua and villi of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion （URSA）. Methods With immunohistochemical method and image analysis technology， the local and quantitative expression of TNF-α were detected and analyzed between the patients of URSA （case group） and the patients of normal induced abortion（control group）. Results Immunohistochemistry staining showed TNF-α protein located in cytoplasm of decidua cells in decidua， Immunohistochemistry staining showed TNF-α protein located in cytotrophoblast and synctiotrophoblast cells in villi. The expression of TNF-α protein in case group was distinctively higher than control group. Conclusion The increased expression of TNF-α in decidua and villi is related to URSA， TNF-α may take part in the pathologic process of URSA.

[Key words] Unexplained recurrent spontaneous abortion； TNF-α； Decidua； Villi

原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)指排除所有已知引起流產(chǎn)原因、連續(xù)3次或3次以上的反復(fù)流產(chǎn)。臨床上復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因較復(fù)雜，除了內(nèi)生殖器官解剖異常、染色體異常、感染性疾病及環(huán)境因素外，仍有超過50%的患者病因不明 [1]。大量研究表明輔助T細(xì)胞Th1/Th2的平衡與妊娠結(jié)局有密切的關(guān)系[2-4]。TNF-α是一類主要由Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，目前有關(guān)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中TNF-α變化的研究較多，但是關(guān)于原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面TNF-α蛋白表達(dá)的報(bào)道較少，因此本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面TNF-α的蛋白表達(dá)進(jìn)行定位和半定量分析，以探討原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生的免疫機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取30例2011年3月～2012年4月在包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者作為病例組，入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡25～41歲，平均（32.0±1.2）歲。孕周6～12周。自然流產(chǎn)次數(shù)均≥2次。經(jīng)檢查排除內(nèi)分泌、染色體、自身免疫、以及生殖道感染和生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)等方面疾病后納入本次研究。選取30例同期就診于包頭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診，要求人工流產(chǎn)終止妊娠的正常早孕婦女作為研究對(duì)照組，入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡在24～39歲，平均（30.4±0.2）歲。孕周6～10周。既往月經(jīng)周期規(guī)律，無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，本次妊娠孕囊符合停經(jīng)時(shí)間，無陰道流血，胚胎發(fā)育正常。對(duì)照組和病例組于行人工流產(chǎn)時(shí)或自然流產(chǎn)發(fā)生24h內(nèi)收集蛻膜及絨毛組織，生理鹽水沖洗組織后用4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊，將蠟塊切為4～8μm厚的組織切片。

1.2 主要試劑

TNF-α多克隆抗體（兔抗人）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自北京中杉金橋，即用型SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)顯色

蛻膜和絨毛組織切片先行脫蠟和水化；滴加0.3% H2O2室溫孵育10min；將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液，微波修復(fù)3min，使抗原的位點(diǎn)暴露出來；滴加正常山羊血清封閉液室溫20min；滴加一抗（1∶50的兔抗人TNF-α抗體工作液） 4℃過夜，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照；加二抗后37℃孵育40min；加SABC后37℃孵育40min；于室溫DAB-H2O2顯色，顯微鏡下觀察，以控制反應(yīng)時(shí)間；蘇木素輕度復(fù)染細(xì)胞核；脫水，透明，封片后鏡下觀察。

1.4 圖像分析

選取對(duì)照組（30例）和病例組（30例）中每例蛻膜組織切片2張、絨毛組織切片2張，在蛻膜組織的蛻膜細(xì)胞、絨毛組織的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞、細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞分別隨機(jī)選取2個(gè)單位面積，應(yīng)用捷達(dá)801圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析測(cè)量平均光密度。endprint

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究以對(duì)照組和病例組平均光密度作為計(jì)量資料，采用SPSS17.0軟件的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，計(jì)算平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)量數(shù)據(jù)用（）的形式表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF蛋白在絨毛和蛻膜中的組織學(xué)定位

在子宮蛻膜組織中， TNF-α蛋白主要定位于蛻膜細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒，兩組陽性反應(yīng)強(qiáng)弱不等（圖1A、B），兩組的腺上皮細(xì)胞內(nèi)均未見表達(dá)。在絨毛組織中，病例組和對(duì)照組均可在合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見到棕黃色陽性反應(yīng)顆粒（圖1C、D）。

2.2 TNF蛋白在絨毛和蛻膜中的半定量結(jié)果

病例組的蛻膜組織和絨毛組織中TNF-α蛋白含量均高于對(duì)照組，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

3 討論

隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的快速發(fā)展，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因的免疫學(xué)說日益受到重視。Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡與妊娠結(jié)局有很大關(guān)系。正常情況下，妊娠表現(xiàn)為一種特殊的Th2現(xiàn)象，Th1處于一種抑制狀態(tài)，當(dāng)發(fā)生向Th1型細(xì)胞因子過度表達(dá)時(shí)，將導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生[5-6]。

TNF-α是一類主要由Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，適量的TNF-α在妊娠早期可調(diào)節(jié)細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的正常增殖、分化、凋亡，助于蛻膜細(xì)胞外基質(zhì)降解及胎盤植入，利于能量代謝和胚胎發(fā)育，促進(jìn)孕激素和絨毛促性腺激素的生成，對(duì)正常妊娠的維持和分娩的發(fā)動(dòng)發(fā)揮重要作用[7-9]。黃江寧、鈄曉珍等[10-11]檢測(cè)到復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中TNF-α水平較健康早孕婦女明顯升高，國(guó)內(nèi)關(guān)于TNF-α蛋白在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜和絨毛組織中的定位及半定量表達(dá)情況的研究報(bào)道還較少，因此本研究采用免疫組織化學(xué)方法從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜和絨毛組織中TNF-α的表達(dá)情況。

高艷霞等[12]研究顯示TNF-α主要表達(dá)于絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)，在蛻膜細(xì)胞內(nèi)無表達(dá)，而本研究檢測(cè)到絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞內(nèi)均有TNF-α表達(dá)。結(jié)果顯示在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的蛻膜和絨毛組織中TNF-α蛋白表達(dá)相對(duì)含量明顯高于正常早孕婦女，這與Smith等[13]的研究結(jié)果一致，提示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者母胎界面TNF-α的高表達(dá)與流產(chǎn)相關(guān)。高濃度的TNF-α 可能與細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中的TNF-α受體結(jié)合從而限制細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致早期胚胎的營(yíng)養(yǎng)供給和吸收，不利于胚胎著床和妊娠維持。孫燕[14]等研究表明TNF-α能通過激活肥大細(xì)胞而損壞母體子宮蛻膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，致使胚胎停育。Clark等[15]研究表明在母胎界面TNF-α表達(dá)增加時(shí)對(duì)促凝血酶原激酶Fg12的表達(dá)有上調(diào)作用，使胎盤滋養(yǎng)血管纖維素沉積、血栓形成乃至胎盤梗死 [16]，說就證明高表達(dá)的TNF-α是通過多種途徑導(dǎo)致流產(chǎn)發(fā)生的。

綜上所述，TNF-α蛋白在母胎界面的高表達(dá)與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有密切關(guān)系，為該病發(fā)病免疫學(xué)說提供了證據(jù)。由于引發(fā)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的免疫機(jī)制極其復(fù)雜，因此TNF-α在復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中的作用機(jī)制還需進(jìn)一步多方面深入研究。

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（收稿日期：2015-10-15）endprint