血芝液體深層發(fā)酵合成三萜類化合物的條件優(yōu)化

楊麗梅， 蘇 平， 涂俊銘

(食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北黃石 435002)

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血芝液體深層發(fā)酵合成三萜類化合物的條件優(yōu)化

楊麗梅， 蘇 平， 涂俊銘*

(食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北黃石 435002)

摘要[目的]探究血芝液體深層發(fā)酵合成三萜類化合物的最佳發(fā)酵條件。[方法]先以單因素試驗(yàn)分析碳源、氮源、轉(zhuǎn)速、pH、接種量對(duì)血芝液體深層發(fā)酵合成三萜類化合物的影響，選取其中3個(gè)主要影響因素，采取響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化血芝液體深層發(fā)酵合成三萜類化合物的最佳工藝條件。[結(jié)果]單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，血芝發(fā)酵合成胞內(nèi)三萜類化合物的最適條件為pH=6，轉(zhuǎn)速為130 r/min，最適碳源為蔗糖，最適氮源為尿素。響應(yīng)面法優(yōu)化的發(fā)酵條件為3%接種量、30 g/L蔗糖、1.9 g/L尿素，血芝三萜類化合物含量達(dá)16.51 mg/g。[結(jié)論]該研究為血芝活性成分的研究提供實(shí)際參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞血芝；深層發(fā)酵；三萜類化合物；響應(yīng)面法；優(yōu)化

皺蓋假芝(Amaurodermarude(Berk.)Torrend)是一種大型靈芝科假芝屬真菌，在培養(yǎng)過程中可以產(chǎn)生血樣分泌物，故又稱為血芝[1]。血芝在臺(tái)灣被視為名貴藥材，在防癌方面有奇效[2]。血芝三萜類化合物為血芝的主要活性成分，具有特別明顯的生理活性，已有研究表明，其在抗腫瘤、抗衰老、保肝、降血糖血脂、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜等方面有明顯的效果[3-4]。我國血芝資源有限、自然生長周期長等問題嚴(yán)重限制了血芝的開發(fā)利用。采取液體深層發(fā)酵技術(shù)收集血芝菌絲體是一種解決和獲取血芝資源的有效途徑[5]。目前，響應(yīng)面法(RSM)已被廣泛用于生物過程的優(yōu)化[6-8]，但在血芝液體深層發(fā)酵條件研究方面的報(bào)道較少[9-11]。該研究先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，篩選出對(duì)血芝三萜類化合物合成影響最大的液體深層發(fā)酵因素，再設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化合成血芝三萜類化合物的發(fā)酵條件。

1材料和方法

1.1材料與試劑血芝(皺蓋假芝)，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種研究中心提供。無水乙醇、高氯酸、冰乙酸、香蘭素、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、麥芽糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl等為分析純；可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨等為生化試劑；尿素、豆餅市售。

1.2儀器與設(shè)備PCE-3000烘箱，上海索普儀器有限公司；G154DWS全自動(dòng)高壓滅菌鍋，美國Zealway；雙面紫外超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Specord plus 200紫外可見分光光度計(jì)，德國耶拿；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠；AB204-N型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UNINAPO 100 EHC真空濃縮干燥器，德國 UNIEQUIP；TDL-60B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1總?cè)坪繙y定。采用香草醛-高氯酸顯色法[12-13]。

1.3.2熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。準(zhǔn)確吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，水浴蒸干，加5%香草醛-冰醋酸0.3 mL、高氯酸1.0 mL，于60 ℃水浴加熱15 min，以熊果酸的含量(μg)為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，建立回歸方程Y= 0.002 1x- 0.001 5(R2=0.996 3)，表明標(biāo)準(zhǔn)品在0～400 μg范圍內(nèi)吸光值與熊果酸含量呈良好線性關(guān)系。

圖1　三萜類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the triterpenoids

1.3.3血芝胞內(nèi)三萜類化合物提取及測定。稱取0.10 g烘至恒重的血芝菌絲體，加入8 mL無水乙醇，80 ℃水浴3 h，放置室溫，4 000 r/min離心10 min，收集濾液再定容至8 mL，測定提取液中三萜類化合物含量。取0.2 mL待測樣，沸水浴揮去溶劑，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL及1.0 mL高氯酸試劑， 60 ℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫，測定OD529 nm吸光值。

1.3.4血芝液體深層發(fā)酵合成三萜類化合物的單因素試驗(yàn)。

1.3.4.1碳源對(duì)合成血芝三萜類化合物的影響。200 g/L馬鈴薯煮汁、2 g/L蛋白胨、20 g/L不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉)、3 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4·7H2O，接種量2%，在26 ℃，130 r/min培養(yǎng)4 d，測生物量和三萜類化合物含量。

1.3.4.2氮源對(duì)合成血芝三萜類化合物的影響。200 g/L馬鈴薯煮汁、20 g/L蔗糖、2 g/L不同氮源(蛋白胨、黃豆粉、酵母粉、氯化銨、尿素)、3 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4·7H2O，接種量2%，在26 ℃，130 r/min培養(yǎng)4 d，測生物量和三萜類化合物含量。

1.3.4.3轉(zhuǎn)速和初始pH對(duì)合成血芝三萜類化合物的影響。200 g/L馬鈴薯煮汁、2 g/L尿素、20 g/L蔗糖、3 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4·7H2O，接種量2%，26 ℃，不同轉(zhuǎn)速(120、130、140、150、160 r/min)培養(yǎng)4 d，測生物量和三萜類化合物含量。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH(2、4、6、8、自然pH)，在26 ℃，130 r/min培養(yǎng)4 d，測生物量和三萜類化合物含量。

1.3.4.4接種量對(duì)合成血芝三萜類化合物的影響。200 g/L馬鈴薯煮汁、2 g/L尿素、20 g/L蔗糖、3 g/L KH2PO4、1 g/L MgSO4·7H2O，調(diào)節(jié)pH為6，不同的接種量(1%、2%、3%、5%、10%)，在26 ℃，130 r/min培養(yǎng)4 d，測生物量和三萜類化合物含量。

1.3.5響應(yīng)面試驗(yàn)。綜合單因素影響三萜類化合物含量的試驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量、碳源、氮源3個(gè)主要影響因素，以胞內(nèi)三萜類化合物含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在3因素3水平(表1)上對(duì)血芝液體深層發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1　響應(yīng)面分析因素與水平

2結(jié)果與分析

2.1血芝液體深層發(fā)酵合成三萜類化合物的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1碳源對(duì)合成血芝三萜類化合物的影響。從圖2可知，蔗糖為碳源時(shí)，血芝的胞內(nèi)三萜類化合物含量最高(13.78 mg/g)，果糖和麥芽糖次之，而大分子物質(zhì)淀粉的三萜含量最低(10.05 mg/g)。蔗糖也是比較常見的原料，價(jià)格比較便宜，所以該試驗(yàn)中選取蔗糖為合成血芝三萜類化合物的合適碳源。

圖2　不同碳源對(duì)血芝生物量和三萜類化合物的影響Fig.2　Effects of carbon sources on the biomass and triterpenoid of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

2.1.2氮源對(duì)合成血芝三萜類化合物的影響。圖3表明，在血芝液態(tài)發(fā)酵過程中，無機(jī)氮源相對(duì)于有機(jī)氮源更有利于血芝菌絲體的生長，這可能與菌絲體能直接吸收利用氨基酸、尿素、銨鹽等小分子化合物有關(guān)，且尿素作為氮源時(shí)，血芝菌絲體胞內(nèi)三萜類化合物含量最高，因此選擇尿素作為合成血芝三萜類化合物的最適氮源。

圖3　不同氮源對(duì)血芝生物量和三萜類化合物的影響Fig.3　Effect of nitrogen sources on the biomass and triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

2.1.3轉(zhuǎn)速和初始pH對(duì)合成血芝三萜類化合物的影響。從圖4a可看出，隨著轉(zhuǎn)速升高，生物量增大；轉(zhuǎn)速太高，反而抑制血芝菌絲體的生長，影響菌球的形成。另一方面，三萜類化合物含量隨著轉(zhuǎn)速增加而降低，可能是因?yàn)檠ト祁惢衔餅榇渭?jí)代謝產(chǎn)物，而轉(zhuǎn)速過高抑制了菌絲體的生長，進(jìn)而影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的生成。血芝代謝三萜類化合物總量取決于生物量和胞內(nèi)三萜類化合物含量2個(gè)因素，因此確定最適轉(zhuǎn)速為130 r/min。

由圖4b可知，初始pH過低或過高均不利于血芝生物量和三萜類化合物含量的增長，在初始pH為6時(shí)，生物量達(dá)最大(9.35 g/L);在pH為2時(shí)，三萜類化合物含量最大，可能因?yàn)檠ト祁惢衔餅樗嵝晕镔|(zhì)，強(qiáng)酸性環(huán)境有利于三萜類物質(zhì)的積累，具體機(jī)理有待進(jìn)一步探究與確認(rèn)。初步確定合成血芝三萜類化合物的最適初始pH為6。

圖4　轉(zhuǎn)速(a)和初始pH(b)對(duì)生物量和三萜類化合物的影響Fig.4 Effects of rotation speed (a) and initial pH (b) on the triterpenoids

2.1.4接種量對(duì)合成血芝三萜類化合物的影響。由圖5可見，血芝菌絲體的生物量和接種量呈正相關(guān)。但在接種量>3%時(shí)，血芝菌絲球小，不利于三萜類化合物的生成，胞內(nèi)三萜類化合物含量逐漸降低，因此確定最適接種量為3%。

圖5　接種量對(duì)生物量和三萜類化合物的影響Fig.5　Effects of inoculation amount on the biomass and triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)分析以x1=A-2、x2=(B-20)/10、x3=C-2為自變量，以三萜類化合物含量y為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。利用Design-expert 8.0.5軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，對(duì)各因素進(jìn)行回歸擬合后，得到血芝胞內(nèi)三萜類化合物含量對(duì)接種量、碳源和氮源的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=11.94+2.02x1+1.06x2-0.059x3+0.92x1x2-0.38x1x3+0.24x2x3+0.47x12-0.039x22-0.73x32。經(jīng)分析，該二次多項(xiàng)模型具有高度顯著性(P=0.005 7<0.01)；失擬項(xiàng)P=0.000 7，表示有0.07%的概率使得模型偏差由噪音產(chǎn)生，因此模型失擬項(xiàng)不顯著；模型的擬合度R2為0.912 7，說明模型擬合程度好。該結(jié)果表明可以用此模型對(duì)血芝液態(tài)發(fā)酵合成三萜類化合物的條件進(jìn)行分析和預(yù)測。

由利用Design-expert 8.0.5軟件做出的以三萜類化合物含量為響應(yīng)值的響應(yīng)面和等高線(圖6~8)可知，血芝胞內(nèi)三萜類化合物代謝的優(yōu)化條件為接種量3%、蔗糖30 g/L、尿素1.9 g/L，在此條件下，三萜類化合物含量的預(yù)測值為16.40 mg/g。

為了驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)的可靠性，采用優(yōu)化的血芝液體深層發(fā)酵條件(3%接種量、30 g/L蔗糖、1.9 g/L尿素)，在26 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)4 d的血芝胞內(nèi)三萜類化合物含量為16.51 mg/g，實(shí)際測量值與理論預(yù)測值(16.40 mg/g)接近，無顯著性差異。該試驗(yàn)結(jié)果表明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化的血芝三萜類化合物發(fā)酵條件可行。

表2　響應(yīng)面方案及試驗(yàn)結(jié)果

圖6　接種量和碳源對(duì)三萜類化合物影響的響應(yīng)曲面(a)和等高線(b)Fig.6　Response surface (a) and contour line (b) of the effects of inoculation amount and carbon source on the triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

圖7　接種量和氮源對(duì)三萜類化合物影響的響應(yīng)曲面(a)和等高線(b)Fig.7　Response surface and contour line of the effects of inoculation amount and nitrogen source on the triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

圖8　氮源和碳源對(duì)三萜類化合物影響的響應(yīng)曲面(a)和等高線(b)Fig.8　Response surface and contour of the effects of carbon and nitrogen sources on the triterpenoid production of Amauroderma rude(Berk.)Torrend

3結(jié)論與討論

該研究先以單因素試驗(yàn)分析碳源、氮源、轉(zhuǎn)速、pH、接種量對(duì)血芝液體深層發(fā)酵合成三萜類化合物的影響，選取其中3個(gè)主要影響因素，采取響應(yīng)面分析法進(jìn)一步優(yōu)化血芝液體深層發(fā)酵合成三萜類化合物的最佳工藝條件。經(jīng)試驗(yàn)綜合確定了以土豆汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，血芝液體深層發(fā)酵的最適碳源為蔗糖，最適氮源為尿素，最適接種量、pH和轉(zhuǎn)速分別為3%、6及130 r/min。用響應(yīng)面分析進(jìn)一步優(yōu)化得到發(fā)酵的最優(yōu)組合為接種量3%、蔗糖30 g/L、尿素1.9 g/L，在此條件下培養(yǎng)的血芝菌絲體生長良好，胞內(nèi)三萜類化合物含量為16.51 mg/g，比理論值(16.40 mg/g)大，不排除其他發(fā)酵因素影響。

對(duì)比其他研究發(fā)現(xiàn)，血芝的菌絲體發(fā)酵條件與靈芝科大多數(shù)菌種發(fā)酵條件有很高的相似性，可以相互借鑒[14-15]。而在三萜類化合物發(fā)酵條件上存在差異，如碳源和接種量有明顯的不同，南韓靈芝的最適氮源和碳源為豆粕和淀粉，接種量20%[15]，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后的結(jié)果對(duì)比單因素試驗(yàn)的結(jié)果有很明顯的優(yōu)化，且最大胞內(nèi)三萜類化合物含量達(dá)鄭林用等[11]研究得出結(jié)論的1.44倍?？梢?，響應(yīng)面分析方法在對(duì)血芝三萜類化合物的發(fā)酵研究上是有效的，預(yù)計(jì)在血芝其他活性成分的研究上也將有一定的實(shí)際參考價(jià)值。

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Optimization of Triterpenoids Production by Liquid Submerged Fermentation ofAmaurodermarude(Berk.)Torrend

YANG Li-mei,SU Ping,TU Jun-ming*(Hubei Key Laboratory of Edible Wild Plants Conservation & Utilization,Huangshi,Hubei 435002)

Abstract[Objective] To study the best production conditions of triterpenoids by liquid submerged fermentation ofAmaurodermarude(Berk.) Torrend. [Methods] Firstly, single factor experiment was carried to analyze the effects of carbon source, nitrogen source, rotational speed, pH and inoculation amount on the triterpenoids production by liquid submerged fermentation ofAmaurodermarude(Berk.) Torrend. Then, three major factors were selected. Finally, the Response Surface Methodology (RSM) was applied to further optimize the best production conditions of triterpenoids by liquid submerged fermentation ofAmaurodermarude(Berk.) Torrend. [Results] Single factor experiment indicated that the best production conditions were as follows: pH = 6; the rotational speed was 130 r/min; the optimum carbon source was sucrose; the optimum nitrogen was urea.The fermentation conditions optimized by RSM were 3% inoculation amount, 30 g/L sucrose, 1.9 g/L urea; in these conditions, the triterpenoids production ofAmaurodermarude(Berk.)Torrend reached 16.51 mg/g. [Conclusion] The study provides the practical reference basis for the study of the active ingredients ofAmaurodermarude(Berk.)Torrend.

Key WordsAmaurodermarude(Berk.) Torrend; Submerged fermentation; Triterpenoids; Response Surface Methodology (RSM); Optimization

收稿日期2015-12-21

作者簡介楊麗梅(1990-)，女，湖北黃石人，碩士研究生，研究方向：微生物學(xué)。*通訊作者，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事微生物工程研究。

基金項(xiàng)目食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(EWPL201511)。

中圖分類號(hào)S 567.3+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)02-158-04