不同培養(yǎng)條件對淡紫擬青霉菌體絲化的影響

谷 軍，張曉彥，孟立強(qiáng)，沙長青

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010； 2.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱 150001)

不同培養(yǎng)條件對淡紫擬青霉菌體絲化的影響

谷 軍1，張曉彥1，孟立強(qiáng)1，沙長青2

(1.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱 150010； 2.黑龍江省科學(xué)院，哈爾濱 150001)

為提高生防用淡紫擬青霉菌株發(fā)酵產(chǎn)品中的孢子產(chǎn)量，降低產(chǎn)品中影響孢子形成的菌體絲化現(xiàn)象。采用控制發(fā)酵微生物的生理活動、調(diào)整生物的生活環(huán)境等方法來改變微生物的生長狀態(tài)，控制發(fā)酵菌體的絲化率。通過調(diào)整發(fā)酵溫度、控制培養(yǎng)原料成分和調(diào)整通氣量等方法，效果明顯，淡紫擬青霉的絲化比降到0.7以下。說明當(dāng)采用淀粉代替容易利用的葡萄糖為碳源時，濃度為2%。同時控制階段不同發(fā)酵的培養(yǎng)溫度，前期(2 d)為28 ℃，后期為26 ℃，發(fā)酵時間6 d，淡紫擬青霉發(fā)酵液的絲化率為0.59，孢子數(shù)為1.6×109cfu/mL。

淡紫擬青霉；液體發(fā)酵；分生孢子；菌體絲化

淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)是線蟲卵的寄生真菌，被認(rèn)為是最具有應(yīng)用前景的線蟲生防真菌[1-4]，根結(jié)線蟲(Meloidogyne.spp)是農(nóng)作物害蟲，分布廣，會對許多經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重危害?；瘜W(xué)殺蟲劑會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問題，因此根結(jié)線蟲病害的生物防治受到廣泛重視。為促進(jìn)淡紫擬青霉生防菌劑的推廣應(yīng)用，產(chǎn)出高活性的、生防效果好且方便使用的淡紫擬青霉生物菌劑尤為重要。

淡紫擬青霉在培養(yǎng)狀態(tài)下，通常以孢子狀態(tài)和菌絲體狀態(tài)存在，多數(shù)會混合存在。以淡紫擬青霉為菌種制備生防制劑，希望發(fā)酵產(chǎn)品中的淡紫擬青霉以孢子狀態(tài)存在，因為呈孢子狀態(tài)的菌劑保質(zhì)期長，繁殖能力強(qiáng)，生防效果好，國家也是以菌劑中的孢子數(shù)作為衡量產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。本文通過不同培養(yǎng)工藝條件和不同培養(yǎng)原料需求的選擇，減少了培養(yǎng)產(chǎn)品中的絲化現(xiàn)象，提高了淡紫擬青霉菌劑的孢子數(shù)，為淡紫擬青霉生防菌劑的擴(kuò)大生產(chǎn)提供有益的幫助[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)，本實驗室分離鑒定保藏。

1.1.2 試劑

磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸鎂、鹽酸等試劑均為分析純(AR)，蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母浸出物、幾丁質(zhì)，瓊脂為生化試劑(BR)。

1.1.3 儀器

HWS 24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；SKY-1102C恒溫震蕩培養(yǎng)箱(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司)；SP-756PC可見紫外分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；YSQ-LS-100S11型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司)；DRP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面試管培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%，KNO30.10%，K2HPO40.10%， NaCl 0.05%，MgSO40.05%， FeSO40.001%，pH自然，瓊脂2%。種子培養(yǎng)基: 液體種子培養(yǎng)基：蔗糖2%，蛋白胨1% ，K2HPO40.01%，NaCl 0.2%，MgSO40.01%，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基：培養(yǎng)基1：高氏培養(yǎng)基。培養(yǎng)基2：察氏培養(yǎng)基。培養(yǎng)基3：察氏培養(yǎng)基+豆餅粉0.5%。培養(yǎng)基4：可溶淀粉1%，豆餅粉0.5%。培養(yǎng)基5：蔗糖1%，豆餅粉0.5%。培養(yǎng)基6：葡萄糖1%，豆餅粉0.5%。培養(yǎng)基7：蔗糖1%，酵母膏0.5%。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

孢子數(shù)的檢測：采用血球計數(shù)器方法，準(zhǔn)確稱取淡紫擬青霉發(fā)酵液，加入到三角瓶，加入無菌水稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，利用血球計數(shù)器計數(shù)分生孢子量，重復(fù)3次，取平均值。絲化比的計算：將發(fā)酵好的淡紫擬青霉發(fā)酵液進(jìn)行離心處理，轉(zhuǎn)速為4 000 rpm，時間20 min，收集菌體進(jìn)行干燥處理，并測定出1 000 mL發(fā)酵液所得到的菌體干重，為淡紫擬青霉發(fā)酵液對于菌體的收率。我們定義絲化比為：

1.2.2 種子培養(yǎng)方法

液體菌種的制備：在試管斜面保存菌種中挑起1接種環(huán)淡紫擬青霉孢子接種到液體種子培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基的裝量為500 mL三角瓶裝100 mL培養(yǎng)基，然后在恒溫培養(yǎng)振蕩器 (SKY-1102C)中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，恒溫振蕩器溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)時間為4 d。檢測分生孢子數(shù)達(dá)到2×108cfu/mL即可，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液作為發(fā)酵的液體種子。固體菌種的制備：取培養(yǎng)好的斜面試管菌種，加入20 mL無菌水，將斜面試管中淡紫擬青霉分生孢子盡量洗脫下來，作為淡紫擬青霉固體發(fā)酵的種子準(zhǔn)備。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)

按照淡紫擬青霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基配比，配制培養(yǎng)基，將配好的培養(yǎng)基裝入到500 mL的三角瓶中，裝量為100 mL，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫，接入液體種子1 mL或固體菌種，接種分生孢子的數(shù)量大約為2×108cfu/瓶，然后在恒溫培養(yǎng)振蕩器 (SKY-1102C)中進(jìn)行培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min、培養(yǎng)控制溫度24 ℃～28 ℃，培養(yǎng)時間為4～10 d。

1.2.4 不同種子類型對淡紫擬青霉液體發(fā)酵絲化比的影響

分別采用液體種子和固體種子進(jìn)行淡紫擬青霉液體發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基采用4號培養(yǎng)基，發(fā)酵方法為1.2.3中介紹，在不同發(fā)酵時間取樣進(jìn)行發(fā)酵液中孢子數(shù)和菌絲絲化比的測定。

1.2.5 不同的培養(yǎng)基對發(fā)酵過程中絲化比和孢子數(shù)的影響

采用不同發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行淡紫擬青霉液體發(fā)酵實驗，培養(yǎng)基分別采用1、2、3、4、5、6、7號培養(yǎng)基，發(fā)酵方法為1.2.3中介紹，種子采用液體種子，發(fā)酵時間為5 d，發(fā)酵結(jié)束后檢測淡紫擬青霉發(fā)酵液的孢子數(shù)和菌絲絲化比。

1.2.6 不同培養(yǎng)基濃度對絲化率和孢子數(shù)的影響

以4號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別調(diào)整培養(yǎng)基的固形物的濃度，檢驗對發(fā)酵液的孢子數(shù)和菌絲絲化比的情況。培養(yǎng)基濃度分別為4號培養(yǎng)基的0.5、1、1.5、2、2.5、3、4倍。發(fā)酵方法為1.2.3中介紹，發(fā)酵種子為液體種子，發(fā)酵時間為5 d，分別測定不同濃度培養(yǎng)基情況下發(fā)酵液孢子數(shù)和菌絲的絲化比。

1.2.7 培養(yǎng)基中無機(jī)鹽對絲化率和孢子數(shù)的影響

驗證培養(yǎng)基中常用無機(jī)鹽對發(fā)酵液孢子數(shù)和絲化比的影響，以4號培養(yǎng)基為對照，在培養(yǎng)基中加入無機(jī)鹽K2HPO40.10%、MgSO40.05%、NaCl 0.05%。不同的發(fā)酵時間進(jìn)行取樣，分別測定發(fā)酵液的孢子數(shù)和菌絲的絲化比。

1.2.8 不同的發(fā)酵溫度條件對絲化率和孢子數(shù)的影響

培養(yǎng)基配比為淀粉2%，豆餅粉1%，K2HPO40.10%、 MgSO40.05%、NaCl 0.05%。發(fā)酵溫度分別控制在20 ℃、23 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，發(fā)酵種子采用液體發(fā)酵種子，發(fā)酵方法同1.2.3，發(fā)酵時間控制在5 d，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液孢子數(shù)、菌絲的絲化比。

1.2.9 不同的發(fā)酵時間對絲化率和孢子數(shù)的影響

培養(yǎng)基配比為淀粉2%，豆餅粉1%，K2HPO40.10%、MgSO40.05%、NaCl 0.05%作為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵方法為1.2.3中介紹，發(fā)酵溫度控制在26 ℃，種子采用液體種子，分別在發(fā)酵的2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d進(jìn)行取樣，測定發(fā)酵液的孢子數(shù)和菌體的絲化比。

1.2.10 不同的原料初始pH條件對絲化率和孢子數(shù)的影響

培養(yǎng)基配比為淀粉2%，豆餅粉1%，K2HPO40.10%、MgSO40.05%、NaCl 0.05%作為發(fā)酵培養(yǎng)基，同時調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基的原始pH值分別為3、4、5、6、6.5、7、8，發(fā)酵方法為1.2.3，發(fā)酵溫度控制在26 ℃，種子采用液體種子，發(fā)酵時間控制為5 d進(jìn)行取樣，測定發(fā)酵液的孢子數(shù)和菌體的絲化比。

1.2.11 不同的通氣量對絲化率和孢子數(shù)的影響

配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配比為淀粉2%，豆餅粉1%，K2HPO40.10%、MgSO40.05%、NaCl 0.05%，將配好的培養(yǎng)基裝入到500 mL的三角瓶中，裝量分別為50 mL、75 mL、100 mL、125 mL、150 mL、175 mL、200 mL，121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫，接入液體種子1 mL，接種分生孢子的數(shù)量大約為1×108cfu/瓶，然后在恒溫培養(yǎng)振蕩器 (SKY-1102C)中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，恒溫振蕩器溫度26 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min ，培養(yǎng)時間為6 d。測定發(fā)酵液中孢子數(shù)和菌體的絲化比。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種子類型對淡紫擬青霉液體發(fā)酵的影響

以4號培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別接種液體種子和固體種子，發(fā)酵4 d、5 d、6 d、7 d取樣測定淡紫擬青霉的發(fā)酵情況，結(jié)果如圖1。

圖1 不同種子類型對發(fā)酵的影響Fig.1 The influence of different seeds on fermentation

從圖中可以看出液體種子前期發(fā)酵較快，7 d時孢子數(shù)達(dá)到最高峰，4～6 d時孢子數(shù)增長最快，6～7 d增長緩慢，固體種子前期發(fā)酵同液體種子發(fā)酵相比較慢，7 d時孢子數(shù)達(dá)到最高峰，5～6 d時孢子數(shù)增長最快，6～7 d增長緩慢。絲化比方面，二者都體現(xiàn)出前期較高，發(fā)酵后期逐漸降低，而采用固體種子進(jìn)行淡紫擬青霉發(fā)酵更為明顯。

2.2 不同的營養(yǎng)成分對淡紫擬青霉液體發(fā)酵的影響

2.2.1 不同的培養(yǎng)基對發(fā)酵的影響

分別選取1、2、3、4、5、6、7號培養(yǎng)基進(jìn)行淡紫擬青霉液體發(fā)酵實驗，5 d后測定發(fā)酵中的淡紫擬青霉的發(fā)酵液中分生孢子數(shù)和菌體絲化比，結(jié)果如表1。

表1 不同的培養(yǎng)基對發(fā)酵的影響

可以看出，4號培養(yǎng)基發(fā)酵液中的孢子數(shù)最高，2號培養(yǎng)基中雖然絲化比最低，但它的孢子數(shù)并不高，4、5、6號培養(yǎng)基的發(fā)酵生長狀態(tài)較好，雖然絲化比較高，但產(chǎn)生的孢子數(shù)也較高。同1、2、3、7號培養(yǎng)基相比，更適于淡紫擬青霉的發(fā)酵生產(chǎn)，但分生孢子所占的比例不是很高，需要進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.2 不同培養(yǎng)基濃度對發(fā)酵的影響

以4號為基礎(chǔ)配制濃度的培養(yǎng)基，分別為原培養(yǎng)基的0.5、1、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0倍數(shù)。配成不同固形物濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)淡紫擬青霉，5 d后測定淡紫擬青霉的發(fā)酵液中分生孢子數(shù)和菌體絲化比，結(jié)果如表2。

表2 不同固形物濃度的培養(yǎng)基對發(fā)酵的影響

從發(fā)酵結(jié)果得出，隨發(fā)酵液培養(yǎng)基濃度的增加，淡紫擬青霉的分生孢子數(shù)和菌體的收率都在增加，而菌體收率增加要快于孢子數(shù)的增加，說明菌絲增加要優(yōu)于孢子數(shù)的增加，但總孢子數(shù)也增加了，因而在生產(chǎn)中提高培養(yǎng)基的濃度還是有利于生產(chǎn)的。

2.2.3 培養(yǎng)基中無機(jī)鹽對液體發(fā)酵的影響

以4號培養(yǎng)基為對照，同時對比的培養(yǎng)基中加入無機(jī)鹽，比較無機(jī)鹽對淡紫擬青霉發(fā)酵的影響，發(fā)酵6 d后，分別測定發(fā)酵液的孢子數(shù)和菌絲的絲化比，結(jié)果如表3。

表3 無機(jī)鹽對淡紫擬青霉發(fā)酵的影響

從發(fā)酵結(jié)果得出，添加無機(jī)鹽能非常明顯地提高了發(fā)酵液中分生孢子數(shù)，對菌絲體的收率影響不十分明顯。

2.3 溫度對淡紫擬青霉液體發(fā)酵的影響

2.3.1 不同的發(fā)酵溫度條件對淡紫擬青霉液體發(fā)酵的影響

分別在不同的發(fā)酵溫度下進(jìn)行淡紫擬青霉發(fā)酵試驗，實驗結(jié)果如表4。

表4 不同的發(fā)酵溫度條件對發(fā)酵的影響

從發(fā)酵結(jié)果得出，淡紫擬青霉對溫度要求還是很寬泛的，20 ℃～34 ℃都能很好地生長，最適生長溫度為26 ℃，接近最適溫度附近的菌體收率和孢子數(shù)都較高，絲化比較低，發(fā)酵溫度高，終點時發(fā)酵液的pH偏高。

2.3.2 分段控制不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響

將整個發(fā)酵過程分成3段，每段控制不同發(fā)酵溫度，研究溫度對淡紫擬青霉液體發(fā)酵的影響，結(jié)果如表5。

表5 分段控制發(fā)酵溫度對發(fā)酵結(jié)果的影響

從表中可以看出第3批次的發(fā)酵效果最好，其次依次為2、5批次，可以看出前期采取高溫，后期采取低溫的控制方式最好，也就是說高溫有利于菌絲的生長，低溫更有利于孢子的形成。

2.4 不同的發(fā)酵時間對淡紫擬青霉液體發(fā)酵的影響

在淡紫擬青霉的液體發(fā)酵過程中，選取不同的發(fā)酵時間進(jìn)行菌絲體收率和孢子數(shù)的測定，發(fā)酵溫度控制在26 ℃，發(fā)酵的時間分別設(shè)為2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、8 d，實驗結(jié)果如表6。

表6 不同的發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果的影響

從表中看出，隨著發(fā)酵時間的延長發(fā)酵液終點的pH呈下降趨勢，菌體收率從第2 d快速增加，到第3 d后幾乎達(dá)到頂點不再增加，發(fā)酵液的孢子數(shù)在第4 d有一個快速的提高，隨著發(fā)酵的延長孢子數(shù)逐漸提高，絲化比呈逐漸下降趨勢，得出隨發(fā)酵時間的延長，菌絲逐漸轉(zhuǎn)化為分生孢子。

2.5 不同的原料初始pH條件對淡紫擬青霉液體發(fā)酵的影響

調(diào)節(jié)初始培養(yǎng)基的pH值分別為pH3、pH4、pH5、pH6、pH6.5、pH7、pH8，進(jìn)行液體發(fā)酵，發(fā)酵時間為5 d，測定發(fā)酵試驗結(jié)果如表7。

表7 不同原料初始pH值對發(fā)酵結(jié)果的影響

從表7中的結(jié)果得出，淡紫擬青霉菌種對pH的要求還是比較寬泛，pH偏低更有利于發(fā)酵的進(jìn)行，pH6.5發(fā)酵液中的孢子數(shù)最多，絲化比最低，因此最適pH為6.5，pH5～8淡紫擬青霉菌都可以很好地生長。

2.6 不同的通氣量對淡紫擬青霉液體發(fā)酵的影響

用500 mL三角瓶裝入不同量的發(fā)酵液，調(diào)整發(fā)酵過程中的通氣量，相同轉(zhuǎn)速情況下裝量越少通氣效果越好，三角瓶中裝入的培養(yǎng)基分別為25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、150 mL、175 mL、200 mL。發(fā)酵5 d時間，結(jié)果如表8。

表8 通氣量對淡紫擬青霉發(fā)酵的影響

表8得出，裝量越少，通氣越好的發(fā)酵液中孢子數(shù)越多，發(fā)酵效果越好。通氣量的大小對菌體的收率、發(fā)酵終點的pH影響不是很明顯，隨通氣量加大菌體的收率逐漸提高，終點pH值也逐漸降低，但不明顯。

3 討論

淡紫擬青霉生防制劑產(chǎn)品中分生孢子的數(shù)量是衡量產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要指標(biāo)[6-7]。而液體發(fā)酵產(chǎn)品中既有菌絲體，也有分生孢子，降低產(chǎn)品菌絲體含量并提高分生孢子的含量是我們的目的。采用液體種子接種進(jìn)行發(fā)酵，可以縮短產(chǎn)品的發(fā)酵周期，對產(chǎn)品中孢子數(shù)量提高作用不明顯。而提高發(fā)酵液原料中固形物的濃度并在發(fā)酵液中添加無機(jī)鹽可以非常顯著地提高產(chǎn)品中孢子的數(shù)量，濃度提高1倍，孢子數(shù)提高30%左右，添加無機(jī)鹽與對照相比，提高20%左右。通過實驗可以看出，培養(yǎng)溫度高有利于發(fā)酵液中菌絲的生長，溫度低有利于孢子的形成，因而采用分段控制發(fā)酵溫度的方法，可以顯著提高發(fā)酵液中分生孢子的數(shù)量。通過提高培養(yǎng)基的濃度，添加無機(jī)鹽，分段控制溫度，前期28 ℃，后期26 ℃等方法結(jié)合在一起，發(fā)酵液中分生孢子數(shù)同前期的對照比提高了3倍，達(dá)到1.6×109cfu/mL。同時還得出該菌對氧的需求非常大，提高通氣量可以極大地提高產(chǎn)品中的分生孢子數(shù)。

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相關(guān)鏈接(一)

外國科學(xué)家關(guān)于“淡紫擬青霉”研究方面的論文推介

呂 曄

淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)已報道的有近50種。淡紫擬青霉對根結(jié)線蟲的寄生作用是秘魯國際馬鈴薯研究中心的P.Jatala首先發(fā)現(xiàn)，并在1979年首次報道。此后，有60多個國家的科學(xué)工作者對此菌進(jìn)行了研究，證明了淡紫擬青霉對多種植物線蟲都具有防治效能，并且有易培養(yǎng)、寄主廣、功效高等優(yōu)點，對人畜安全無毒，不污染環(huán)境，有利于生態(tài)平衡。

發(fā)表于國際知名刊物上的關(guān)于“淡紫擬青霉在控害效能、生物防控和環(huán)境保護(hù)等方面的研究”文章，大致如下:

國際上對淡紫擬青霉的研究，早期可追溯到Mark Timm于1987年在《Nature Biotechnology》上發(fā)表的《印度必奧康制藥公司對線蟲病的生物防控》(《‘Biocon’ControlsNematodesBiologically》)，其中提到了淡紫擬青霉對線蟲的寄生作用。此外還有：Ana Flávia Canovas Martinez 和Luiz Alberto Beraldo Moraes等于2014年在《The Journal of Antibiotics》上發(fā)表的《由淡紫擬青霉CG-189研制的五種新型白灰制菌素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜表征》(《Liquidchromatography-tandemmassspectrometrycharacterizationoffivenewleucinostatinsproducedbyPaecilomyceslilacinusCG-189》)。Ferreira, GF和 Freitas, TM等于2016年在《BRAZILIAN JOURNAL OF BIOLOGY》上發(fā)表的《抗寄生物藥劑：對食線蟲真菌的體外實驗》(《Antiparasiticdrugs:invitrotestsagainstnematophagousfungi》)。Sharma, S和 Malaviya, P于2016年在《ECOLOGICAL ENGINEERING》上發(fā)表的《利用耐鉻的新型真菌團(tuán)對制革廠污水進(jìn)行生物降解》(《Bioremediationoftannerywastewaterbychromiumresistantnovelfungalconsortium》)。Mareeswaran, J和Nepolean, P等于2016年在《INDIAN JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES》上發(fā)表的《高效內(nèi)質(zhì)治病菌對印度南部茶葉種植園中茶枝枯病菌(Macrophoma theicola)的生物學(xué)效價》[《Bioefficacyofefficientendomopathogenicfungusagainstbranchcankerpathogen(Macrophomatheicola)inteaplantationsofsouthernIndia》]。Al-Hazmi, AS和Dawabah, AAM等于2017年在《SAUDI JOURNAL OF BIOLOGICAL SCIENCES》上發(fā)表的《不同方法管控根結(jié)線蟲對綠豆影響的效果比較》(《ComparativeefficacyofdifferentapproachestomanagingMeloidogyneincognitaongreenbean》)。

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生物防治劑——淡紫擬青霉菌劑

姜 洋

植物線蟲病在我國局部發(fā)生、危害嚴(yán)重，幾乎每種作物上都有1～2種線蟲病，有的發(fā)生面積不斷擴(kuò)大，會對樹木及農(nóng)作物等許多經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重?fù)p失，已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上亟待解決的問題之一。但國內(nèi)用于防治根結(jié)線蟲病的生物防治產(chǎn)品非常少，大多數(shù)對根結(jié)線蟲病有作用的生防制劑都還處于研發(fā)階段。

淡紫擬青霉是土壤和植物中普遍存在的腐生菌，對根結(jié)線蟲和孢囊線蟲的卵有很強(qiáng)的寄生能力，可以使根結(jié)線蟲和孢囊線蟲自然衰退。淡紫擬青霉36-1菌株對植物病原菌具有拮抗效能，在玉米小斑病、小麥赤霉病、黃瓜炭疽病菌、棉花枯萎病和水稻惡苗病上試驗，淡紫擬青霉菌株活菌體液對其菌絲生長抑制率分別為80.22%、80.50%、77.71%、75.30%和61.36%，處理柑橘果面，青、綠霉擴(kuò)展抑制率為65.97%。批量處理柑橘，好果率為78.44%，比對照高54.44%。

以淡紫擬青霉為基礎(chǔ)生產(chǎn)的淡紫擬青霉菌劑是純微生物活孢子制劑，具有高效、光譜、長效、安全、無污染、無殘留等特點，可明顯刺激作物生長，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的生物防治劑，可用于玉米、高粱、馬鈴薯、甘蔗、煙草、西瓜棉花等十幾種經(jīng)濟(jì)作物；辣椒、茄子、黃瓜等多種蔬菜；菊花、黃麻、茶苗、杉木苗等大量花卉和藥材以及火龍果、獼猴桃、桃、香蕉等多種果樹線蟲病的預(yù)防和治療。試驗證明，在植物根系周圍施用淡紫擬青霉菌劑不僅能明顯抑制線蟲侵染，還能促進(jìn)植物根系及植株營養(yǎng)器官的生長，如播前拌種，定植時穴施，對種子的萌發(fā)與幼苗生長具有促進(jìn)作用，可實現(xiàn)苗全、苗綠、苗壯，一般可使作物增產(chǎn)15%以上。淡紫擬青霉菌劑與進(jìn)口的化學(xué)殺蟲劑相比，殺線蟲效果相當(dāng)或接近，而其生產(chǎn)成本較低，且有后效，并具有不污染農(nóng)產(chǎn)品、不污染環(huán)境的優(yōu)點。因此，研究可用于工業(yè)生產(chǎn)的淡紫擬青霉菌劑對生物農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)品乃至其他發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展都有一定作用和意義。

淡紫擬青霉使用方法

1.拌種按種子量的1%進(jìn)行拌種后，堆捂2～3 h、陰干即可播種。

2.處理苗床將淡紫擬青霉菌劑與適量基質(zhì)混勻后撒入苗床，播種覆土。1 kg菌劑處理30～40 m2苗床。

3.處理育苗基質(zhì)將1 kg菌劑均勻拌入2～3 m3基質(zhì)中，裝入育苗容器中。

4.穴施施在種子或種苗根系附近，每667 m2用量0.5～1 kg。

相關(guān)鏈接(三)

何為生物防治？

姜 洋

據(jù)古書《南方草木狀》記載：在南方，經(jīng)常可以看到有人手提著一種口袋上街叫賣，這種口袋是用席子做成的，口袋中放有許多樹枝樹葉，枝葉上掛著蟲繭，蟲繭看上去就像薄絮，里面裹著一種蟲蟻，這種蟲蟻顏色為赤黃色，比普通的螞蟻要大一些，賣的時候連同薄絮一起賣掉。你也許要問，有誰會去買這玩意呢？買它干什么呢？原來，南方盛產(chǎn)柑橘，柑橘樹上有一種害蟲，專門為害果實，買這種蟲蟻就是為了防治這種柑橘害蟲，如果沒有這種蟲蟻，橘子會被害蟲吃得無一完好。這種利用蟲蟻防治柑橘害蟲的記載，就是已知最早的生物防治。

生物防治本是一個非?，F(xiàn)代化的名詞，它是指利用某些能寄生于害蟲的昆蟲、真茵、細(xì)菌、病毒、原生動物、線蟲及捕食性昆蟲和螨類、益鳥、魚類、兩棲動物等來抑制或消滅害蟲，利用抗生素來防治病原菌，即以蟲治蟲、以菌治蟲、以菌治菌、以菌治病。它的最大優(yōu)點是不污染環(huán)境，是農(nóng)藥等非生物防治病蟲害方法所不能比的。在中國歷史上，除了用蟻防治柑橘害蟲以外，還有很多利用益鳥和青蛙防治害蟲的例子。

1 生物防治與化學(xué)防治的區(qū)別

在農(nóng)作物病蟲害防治上，一般采取的方法主要有化學(xué)防治和生物防治兩種。

化學(xué)防治方法在一定條件下，可短期內(nèi)快速消滅害蟲。但是，常規(guī)化學(xué)防治的農(nóng)藥毒性較大，危害綠色食品的生產(chǎn)。長期以來，化學(xué)肥料的施用和施肥結(jié)構(gòu)的不合理，造成了農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境污染和破壞?；瘜W(xué)農(nóng)藥的使用，在殺死害蟲、除掉雜草的同時，也帶來了令人擔(dān)憂的問題，如化學(xué)農(nóng)藥嚴(yán)重污染水體、大氣和土壤，并通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人群健康。由于化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，一些害蟲已經(jīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的抗藥性，許多害蟲的天敵又大量被殺滅，致使一些害蟲十分猖獗。

利用生物防治病蟲害，就能有效地避免上述缺點，因而具有廣闊的發(fā)展前途。生物防治對環(huán)境污染小，能有效地保護(hù)天敵，發(fā)揮持續(xù)控制作用。微生物肥料就是現(xiàn)代生物技術(shù)在農(nóng)業(yè)應(yīng)用上最成功的例子。通過選育和改造有益的根際和葉面微生物，研制微生物肥料成為實現(xiàn)綠色農(nóng)業(yè)的主要手段之一。但是生物防治手段殺蟲效果較慢，其效果易受環(huán)境因素的影響，作用不如化學(xué)防治速效，且人工繁殖培養(yǎng)有益生物的技術(shù)難度較高，能用于大量釋放的天敵昆蟲種類不多，對害蟲的捕食和寄生有選擇性。

2 生物防治的分類

①以蟲治蟲技術(shù)：利用自然界有益昆蟲和人工釋放的昆蟲來控制害蟲的危害。有寄生性天敵，如寄生蜂、寄生蠅、線蟲、原生動物、微孢子蟲。捕食性天敵，瓢蟲、草蛉、獵春、蜘蛛等。最成功的是人工釋放赤眼蜂防治玉米螟技術(shù)廣泛應(yīng)用。

②以菌治蟲技術(shù)：利用自然界微生物來消滅害蟲，有細(xì)菌、真菌等。如蘇云金桿菌、白僵菌、綠僵菌、顆粒體病毒、核型多角體病毒，白僵菌和蘇云金桿菌應(yīng)用較廣。

③以菌治菌技術(shù)：利用微生物在代謝中產(chǎn)生的抗生素來消滅病菌，有赤霉素、春雷霉素、阿維菌素、多抗霉素等，生物抗生素農(nóng)藥已廣泛應(yīng)用。

④性信息素治蟲技術(shù)：用同類昆蟲的雌性激素來誘殺害蟲的雄蟲。有玉米螟性誘劑、小菜蛾性誘劑等。

⑤轉(zhuǎn)基因抗蟲抗病技術(shù)：國際、國內(nèi)最流行的生物科學(xué)技術(shù)，已成功地培養(yǎng)出抗蟲水稻、棉花、玉米、馬鈴薯等作物新品種，但本身還面臨許多問題，有對人類的安全性、抗基因的漂移、次要害蟲上升為主要害蟲等方面的問題沒有解決。

⑥以菌治草：利用病原微生物防治雜草的技術(shù)。美國利用炭疽菌防治水田雜草，效果很好。

⑦植物性殺蟲、殺菌技術(shù)：這是新興的技術(shù)。第一，光活化素類是利用一些植物次生物質(zhì)在光照下對害蟲、病菌的毒效作用，這種物質(zhì)叫光活化素，用它們制成光活化農(nóng)藥，這是一類新型的無公害農(nóng)藥。第二，印楝素是一類高度氧化的檸檬酸，從印楝種子中分離出活性物質(zhì)，具有殺蟲成分，這是目前世界公認(rèn)的理想的殺蟲植物，對400余種昆蟲具有拒食絕育等作用，我國已研制出0.3%印楝素乳油殺蟲劑。第三，精油就是植物組織中的水蒸汽蒸餾成分，具有植物的特征氣味，較高的折光率等特性，對昆蟲具有引誘、殺卵、影響昆蟲生長發(fā)育等作用，這也是一種新型的無公害生物農(nóng)藥。

⑧生化農(nóng)藥是以昆蟲生長調(diào)節(jié)劑產(chǎn)品為主，隨著國外新品種的引進(jìn)和推廣，國內(nèi)有關(guān)科研單位和企業(yè)也相繼研究開發(fā)了一些新品種的生化農(nóng)藥，如：滅霜素、菌毒殺星、氟幼靈、殺鈴脲，等等。

相關(guān)鏈接(四)

淡紫擬青霉在我國的研究進(jìn)展概述

郝冰玉

在我國，1985年，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)的胡以仁先生在“觀察真菌和制作封片的實驗技術(shù)”報道中使用了淡紫擬青霉作為菌種材料。1989年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所陳品三先生與彭德良先生使用 Jatala 提供的菌種開展了防治根結(jié)線蟲的應(yīng)用試驗并進(jìn)行了報道。

近年來，國內(nèi)研究者對該菌作了大量的生防研究，亦證實該菌對根結(jié)線蟲有較高的寄生率，能有效控制土壤中根結(jié)線蟲的數(shù)量，明顯減少危害。吳家琴等通過盆栽和大田試驗證明，淡紫擬青霉對紅麻根結(jié)線蟲病有明顯控制作用，施用淡紫擬青霉制劑后，可顯著減輕紅麻根結(jié)線蟲病害，增產(chǎn)達(dá)11.9%。李芳等利用淡紫擬青霉防治煙草根結(jié)線蟲病試驗，結(jié)果表明：該菌能有效抑制煙草根結(jié)線蟲的發(fā)生并促進(jìn)植物生長，病情指數(shù)下降43.6%，植株鮮重增加96.3%。劉杏忠等研制的淡紫擬青霉菌劑在我國東北、黃淮等地區(qū)進(jìn)行了大面積防治大豆胞囊線蟲試驗，防效一般在60%以上，增產(chǎn)效果明顯。楊樹軍等測定了淡紫擬青霉 DZ1 菌株對云南煙草根結(jié)線蟲卵囊和分散卵孵化的影響，DZ1 對分散卵的相對抑制率達(dá)57.2%,對卵囊孵化相對抑制率達(dá)60.4%。

2016年,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所謝丙炎研究員領(lǐng)銜的蔬菜病害防控創(chuàng)新團(tuán)隊與中國科學(xué)院微生物研究所合作,在淡紫擬青霉生物防治作用機(jī)制的研究方面取得了重要突破,相關(guān)結(jié)果在2016年7月14日發(fā)表于國際知名病原菌刊物《PloS Pathogens》上。

目前，我國相關(guān)研究論文已發(fā)表數(shù)百篇，內(nèi)容涵蓋生物學(xué)、分類學(xué)、生理、生態(tài)、分子生物學(xué)、代謝產(chǎn)物研究、生防應(yīng)用與致病機(jī)理研究等方面。

通過國家知識產(chǎn)權(quán)局(SIPO)中國專利公布公告系統(tǒng)進(jìn)行專利搜索，采用“高級查詢”，“文本”欄中“名稱=淡紫擬青霉”，對 SIPO 提供的“發(fā)明公布”、“發(fā)明授權(quán)”、“實用新型”和“外觀設(shè)計”4個類別單獨檢索，獲得相關(guān)專利及專利申請共計 71件，其中 70件為發(fā)明專利，1件為實用新型專利。在 70 件發(fā)明專利中，獲得授權(quán)的發(fā)明專利有38件，占總量的 54.3%。授權(quán)專利中，31件專利權(quán)有效，其中 1件發(fā)生了許可轉(zhuǎn)讓，另有 7件已失去專利權(quán)，有效專利占授權(quán)專利總量的81.6%。尚未獲得授權(quán)的發(fā)明專利中，16 件處于審查階段，其中 6件公開，10件處于實審。而另16件申請已無效，其中 13件自行撤回，3件被駁回。中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所相關(guān)授權(quán)專利數(shù)量最多，為 7 件，未見后續(xù)申報。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)持有授權(quán)專利2件，另有1件處于實質(zhì)審查階段，其余4個專利權(quán)人也未檢索到后續(xù)申報。

相關(guān)鏈接(五)

淡紫擬青霉在我國的生產(chǎn)現(xiàn)狀簡介

郝冰玉

國內(nèi)有多家單位進(jìn)行過較大規(guī)模的中試與生產(chǎn)并已制成相應(yīng)的菌劑，他們分別是廈門大學(xué)的潘滄桑，其稱福建凱立和德強(qiáng)生物均采用其技術(shù)。云南大學(xué)的張克勤，其針對煙草開發(fā)，經(jīng)過中試和試驗，最終放棄淡紫擬青霉選擇了厚孢輪枝菌，形成產(chǎn)品“線蟲必可”。2016年4月6日，中國科學(xué)院微生物研究所與中農(nóng)綠康(北京)生物技術(shù)有限公司就劉杏忠研究員課題組的一項發(fā)明專利“一株淡紫擬青霉菌與應(yīng)用”共同簽署專利權(quán)轉(zhuǎn)讓合同。該專利以“一株淡紫擬青霉(Purpureocillium1ilacinum)發(fā)酵菌體”為活性成分，研發(fā)出防治蔬菜根結(jié)線蟲的新型微生物菌劑——微球制劑，該微球制劑無毒、無殘留，施用快捷、方便，在適宜的存儲條件下貨架期可達(dá)1年以上，在試驗示范區(qū)內(nèi)對蔬菜根結(jié)線蟲病平均防效達(dá)60%，具有顯著的社會、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。

我國批準(zhǔn)登記的淡紫擬青霉生產(chǎn)企業(yè)及產(chǎn)品一覽表

截至2016年7月31日，我國批準(zhǔn)登記并在有效期內(nèi)的淡紫擬青霉產(chǎn)品共有8個，其中母藥產(chǎn)品3個，制劑產(chǎn)品5個，涉及 4 個省份的5家生產(chǎn)企業(yè)，具體登記信息如下:

The effect of different culture conditions on silk dimorphism ofPaecilomyceslilacinusbody

GU Jun1, ZHANG Xiao-yan1, MENG Li-qiang1, SHA Chang-qing2

(1.Institute of Microbiology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150010, China; 2.Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin 150001, China)

To improve the spore production of bio-control fermented products of thepaecilomyceslilacinusstrain and reduce the bacteria silk phenomenon which influences the formation of spores, methods of controlling the physiological activities of the fermentation microorganism and adjusting the living environment of creatures to change the state of the growth of microorganisms and control the silken rate of fermentation bacteria. By adjusting the fermentation temperature control and controlling the composition of the culture raw material, the effect is obvious and the silken ratio ofpaecilomyceslilacinusreduces to below 0.7. It shows that when using starch as carbon source instead of the glucose, the concentration is 2%. At the same time, to control the cultivation temperature of different fermentation stage, 28 ℃ for the prophase (2 d) and 26 ℃ for the anaphase (6 d). The silken rate ofpaecilomyceslilacinusis 0.59, and the number of spore is 1.6×109cfu/mL.

Paecilomyceslilacinus; Liquid fermentation; Conidium; Silk dimorphism

生產(chǎn)企業(yè)防治對象登記證號登記名稱劑型總含量福建凱立生物制品有限公司-PD20096840淡紫擬青霉母藥200億活孢子/g福建凱立生物制品有限公司番茄線蟲PD20096841淡紫擬青霉粉劑2億活孢子/g德強(qiáng)生物股份有限公司草坪根結(jié)線蟲番茄根結(jié)線蟲PD20110951淡紫擬青霉顆粒劑5億活孢子/g德強(qiáng)生物股份有限公司-PD20110980淡紫擬青霉母藥100億孢子/g廣東省佛山市盈輝作物科學(xué)有限公司番茄根結(jié)線蟲PD20122019淡紫擬青霉顆粒劑5億活孢子/g江西天人生態(tài)股份有限公司-PD20150496淡紫擬青霉母藥200億孢子/g江西天人生態(tài)股份有限公司番茄根結(jié)線蟲PD20150497淡紫擬青霉粉劑2億孢子/g江西省新龍生物科技有限公司番茄線蟲PD20152015淡紫擬青霉粉劑2億孢子/g

2016-10-19

黑龍江省科學(xué)院科研基金項目“淡紫擬青霉生物制劑工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)”(CZ14BGJV06)

谷軍(1964-)，男，學(xué)士，研究員級高工。

張曉彥(1967-)，女，學(xué)士，高級實驗師，e-mail：zhangxiaoyan@163.com。

Q815

A

1674-8646(2016)24-0002-05