武當山區(qū)栽培重樓根莖與須根中九種重樓皂苷含量比較

吳建平，葉方，陳黎，胡培，朱敏，孫良學(xué)，雷攀

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰 442000；3.湖北濟世藥業(yè)有限責任公司，湖北 十堰 442000)

·論 著·

武當山區(qū)栽培重樓根莖與須根中九種重樓皂苷含量比較

吳建平1，2，葉方1，2，陳黎1，2，胡培2，朱敏2，孫良學(xué)3，雷攀1，2

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖北 十堰 442000；3.湖北濟世藥業(yè)有限責任公司，湖北 十堰 442000)

目的 比較武當山區(qū)栽培重樓根莖與須根中九種重樓皂苷含量，考察皂苷類次生代謝產(chǎn)物在重樓不同生長部位的分布情況，為重樓藥材綜合開發(fā)利用、節(jié)約資源提供參考。方法采集武當山區(qū)種植基地里重樓藥材樣本，采用高效液相色譜法測定各個樣本中九種重樓皂苷的含量。結(jié)果七葉一枝花(華重樓)和云南重樓(滇重樓)中皂苷成分在根莖與須根中均有分布。多葉重樓、長藥隔重樓、狹葉重樓、寬葉重樓等須根中含有部分皂苷成分，但根莖中皂苷含量非常低。結(jié)論重樓須根與重樓根莖有一定的化學(xué)等同性，建議重樓須根作為中成藥原料使用。

重樓；重樓皂苷；根莖；須根；高效液相色譜法

重樓是常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，稱“蚤休”，列為下品[1]。我國境內(nèi)重樓分布有7種8變種[2]，武當山區(qū)分布有2種6變種[3]，當?shù)亟y(tǒng)稱“七葉一枝花”或“海螺七”，除《中國藥典》[4]2015版收載的云南重樓(滇重樓)[Paris polyphylla Smith var.yunnanensis (Franch.)Hand.-Mazz.]或七葉一枝花(華重樓)[Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara.]外，藥農(nóng)在采集過程中將其他品種均作為藥用重樓采挖。根據(jù)藥典規(guī)定，重樓藥材炮制時要去除須根，而隨著中藥材資源日趨減少，除積極開展人工種植外，開發(fā)法定品種的替代品種或者替代藥用部位也是重要手段。課題組與當?shù)刂兴幏N植企業(yè)合作在當?shù)亻_展重樓的人工種植，采集重樓樣本，測定重樓皂苷類成分，研究不同部位是否具有化學(xué)成分等同性，探討重樓須根作為藥用的可能性，為重樓藥材的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 戴安UltiMateTM3000型HPLC儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、Chromeleon軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國戴安公司)；JJ200型精密電子天平(美國雙杰兄弟集團有限公司常熟雙杰測試儀器廠)；FA-2004型電子分析天平(上海精科天平)；AUW-120D型電子分析天平(日本島津)。科盟牌超聲清洗機(廣州市科潔盟實驗儀器有限公司，240 W，40 kHz)；頂帥DS-T100A型高速多功能粉碎機(上海市頂帥工貿(mào)有限公司，29 000 r/min，1 000 W)；H.H.S11-2型電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠，500 W)。

1.2 試藥 重樓皂苷Ⅰ(批號：111590-201103，含量92.1%)、重樓皂苷Ⅱ(批號：111591-201103，含量93.4%)、薯蕷皂苷(重樓皂苷Ⅲ，批號：111707-201402，含量96.2%)、重樓皂苷Ⅵ(批號：111592-201203，含量95.1%)、重樓皂苷Ⅶ(批號：111593-201303，含量92.5%)等對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；纖細薯蕷皂苷(批號：141125，含量98%)、重樓皂苷D(批號：141105，含量98%)、重樓皂苷V(批號：150716，含量98%)、重樓皂苷H(批號：150714，含量98%)均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。重樓藥材樣品采自十堰市茅箭區(qū)馬家河龍王寨重樓種植基地(見表1)。樣品打粉，過三號篩備用；甲醇、乙腈為色譜純，水為自制超純水，其他試劑為分析純。

表1 樣品基源及采集日期

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis?T3(3μm，150 mm×4.6 mm)，預(yù)柱(10 mm×4.6 mm)；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，梯度洗脫(見表2)。流速0.8 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。

表2 流動相梯度洗脫程序表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷D、重樓皂苷V、重樓皂苷Ⅲ、纖細薯蕷皂苷(X)對照品適量，分別配成4.992 mg/mL、4.900 mg/mL、5.200 mg/mL、5.172 mg/mL、4.812 mg/mL、4.780 mg/mL、5.172 mg/mL、5.072 mg/mL、4.852 mg/mL對照品貯備液。取9種對照品貯備液各1 mL稀釋至10 mL容量瓶中，以甲醇定容至刻度，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取上述重樓藥材粗粉0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定重量，水浴加熱回流30 min，放冷后再稱定，用乙醇補足減失的重量，搖勻，以0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 精密移取混合對照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL分別置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。分別取10 μL進樣，在上述色譜條件下進行分析。以對照品進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得到九種皂苷的回歸方程。結(jié)果重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H、纖細薯蕷皂苷的回歸方程分別為：yⅠ=6.688 3x+0.474 9(r2= 0.999 4)，yⅡ=6.103 9x-0.155 2(r2=0.999 7)，yⅢ=6.626 2x+ 0.027(r2=0.999 7)，yD=7.258 7x+0.086 9(r2=0.999 8)，yV= 8.423 4x+0.522 6(r2=0.999 6)，yⅥ=7.886 1x+0.062 8 (r2=1.000 0)，yⅦ=5.959 5x+0.009 9(r2=0.999 8)，yH= 6.751 2x+0.131(r2=0.999 8)，yX=7.150 7x+0.349 3(r2= 0.999 6)。表明重樓皂苷Ⅰ在0.099 8～4.992 0 μg、重樓皂苷Ⅱ在0.098 0～4.900 0 μg、重樓皂苷Ⅲ在0.104 0～5.200 0 μg、重樓皂苷D在0.103 4～5.172 0 μg、重樓皂苷V在0.096 2～4.812 0 μg、重樓皂苷Ⅵ在0.095 6～4.780 0 μg、重樓皂苷Ⅶ在0.103 4～5.172 0 μg、重樓皂苷H在0.101 4～5.072 0 μg、纖細薯蕷皂苷在0.097 0～4.85 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗 取混合對照品溶液10 μL自動進樣，重復(fù)6次，測定峰面積，結(jié)果重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H、纖細薯蕷皂苷的RSD分別為0.83%、1.05%、1.27%、1.79%、1.25%、1.09%、1.08%、1.83%、1.65%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液分別于0、2 h、5 h、10 h、15 h、24 h進樣，每次10 μL，測定峰面積，計算重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H、纖細薯蕷皂苷的RSD分別為1.41%、1.63%、1.71%、1.83%、1.90%、1.52%、1.79%、1.29%、1.85%，n=6，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一樣品5份，按“2.2.2”項下方法平行操作，按“2.1”色譜條件下測定含量。結(jié)果重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H和纖細薯蕷皂苷的含量分別為0.390 3、0.154 8、0.722 0、0.741 4、0.075 7、0.916 5、0.316 0、0.107 1、0.373 9%，RSD分別為1.41%、1.33%、1.72%、1.84%、1.08%、1.52%、0.79%、1.59%、1.43%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收試驗 精密稱取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、V、Ⅵ、Ⅶ、H及纖細薯蕷皂苷適量，然后分別配成0.199 7 mg/mL、0.196 0 mg/mL、0.208 0 mg/mL、0.206 9 mg/mL、0.192 5 mg/mL、0.191 2 mg/mL以及0.206 9 mg/mL、0.202 9 mg/mL、0.1941mg/mL的對照品溶液。精密稱取已知含量的14號重樓樣品6份，每份0.25 g，精密加入重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、D、Ⅵ、Ⅶ對照品溶液5 mL、2 mL、8 mL、4 mL、8 mL進行加樣回收試驗；精密稱取已知含量的11號樣品6份，每份0.25 g，精密加入重樓皂苷Ⅲ、V、H、纖細薯蕷皂苷5 mL、3 mL、1 mL、5 mL進行加樣回收率試驗，測定含量并計算回收率，見表3。

表3 重樓皂苷加樣回收率實驗(n=6)

2.8 樣品含量測定 取“2.2.2”項下供試品溶液在“2.1”項色譜條件下測定并計算樣品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、D、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H和纖細薯蕷皂苷的含量，對照品和樣品色譜圖見圖1，各樣品中皂苷含量見表4。

表4 野生轉(zhuǎn)家種重樓藥材中九種皂苷成分含量（%）

圖1 重樓皂苷的HPLC圖

3 討 論

3.1 不同品種重樓根莖和須根中皂苷含量分布有差異 對武當山區(qū)種植基地栽培的幾個重樓品種根莖和須根中皂苷含量的分析表明，七葉一枝花(華重樓)和云南重樓(滇重樓)中皂苷成分在根莖與須根中均有分布。滇重樓的根莖和須根中皂苷種類比較相近，主要是重樓皂苷Ⅶ、H等偏諾皂苷類成分含量較高，薯蕷皂苷類成分如重樓皂苷V等也有少量分布；華重樓的根莖和須根中成分分布不同，根莖中主要分布的是薯蕷皂苷類成分，包括重樓皂苷Ⅰ、Ⅲ、V、纖細薯蕷皂苷類成分；須根中主要是重樓皂苷Ⅶ、H等偏諾皂苷類成分；其他品種包括多葉重樓、長藥隔重樓、狹葉重樓、寬葉重樓等根莖中皂苷含量非常低，而須根中含有一定的皂苷成分，主要是重樓皂苷Ⅶ、H等偏諾皂苷類等。重樓皂苷是重樓中的主要活性成分[5]，中國藥典規(guī)定重樓的炮制方法時要求除去須根，但分析結(jié)果顯示須根中含有較高量的皂苷成分，所以建議在使用時保留須根，特別是用作工業(yè)原料時侯。

3.2 不同采收季節(jié)重樓中皂苷含量會發(fā)生變化 從分析結(jié)果看，華重樓和滇重樓秋季采收的樣本根莖中皂苷含量高于春季采收的樣本，但各個不同品種重樓須根中皂苷含量春季采收時高于秋季。前期研究認為，重樓皂苷有可能在須根中合成后轉(zhuǎn)移至根莖中貯存[6]，課題組在2015年4月至9月連續(xù)采集寬葉重樓根莖和須根進行分析，但結(jié)果寬葉重樓根莖中皂苷含量非常低，無法進行二者之間的相關(guān)性分析，課題組將于后期工作中采集華重樓和滇重樓樣本進行考察。

3.3 多種成分分析更能反映中藥的整體性特征 中醫(yī)藥的優(yōu)勢是具有整體性及多成份、多靶點的特征[7]，《中國藥典》[4]規(guī)定采用重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量作為重樓藥材質(zhì)量控制指標，為了更好地分析重樓中有效成分分布規(guī)律，測定9種皂苷類成分比較種植基地不同品種、不同部位分布情況，可以更好地幫助企業(yè)推廣規(guī)范化種植，既有良好的經(jīng)濟效益，也有明顯的社會效益。

[1]黃奭輯(清).神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京:中醫(yī)古籍出版社,1982:298.

[2]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,1978:86-96.

[3]葉方,胡培,楊光義,等.湖北武當山地區(qū)重樓資源調(diào)查[J].中藥材, 2015,38(8):1616-1618.

[4]國家藥典委員會.中國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015: 260.

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Comparative study on nine polyphyllins content in rhizome and fibril of Paris polyphylla in Wudang Mountain.

WU Jian-ping1,2,YE Fang1,2,CHEN Li1,2,HU Pei2,ZHU Min2,SUN Liang-xue3,LEI Pan1,2.1.Department of Pharmacy, Taihe Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA;2.School of Pharmacy,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA;3.Hubei Jishi Pharmaceutical Co.,Ltd,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the distribution of nine polyphyllins in different parts of Paris polyphyllaby comparing the contents of relative constituents in Paris polyphylla rhizome and fibril in Wudang Mountain,and to provide reference for comprehensive exploitation and saving Paris polyphylla resources.MethodsParis polyphylla samples were collected from planting base in Wudang mountain area.The high performance liquid chromatography(HPLC) method was used to determine the contents of nine polyphyllins.ResultsPolyphyllins were distributed in both of rhizome and fibril in Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara and Paris polyphylla Smith var.yunnanensis (Franch.)Hara-Mazz.There were some polyphyllins distributed in the fibril of Paris polyphylla,Paris polyphylla Sm.var. thibetica,Paris polyphylla Sm.var.stenophylla,Paris polyphylla var.latifolia,and the polyphyllins content was higher than that in the rhizome.ConclusionParis polyphylla have a certain chemical equivalence between rhizome and fibril, and the fibril of Paris polyphylla was suggested to be used as raw materials of proprietary Chinese medicine.

Paris polyphylla;Polyphyllins;Rhizome;Fibril;High performance liquid chromatography(HPLC)

R280.5

A

1003—6350（2016）22—3613—05

2016-07-02)

湖北省2011計劃(編號：4)；2014年湖北省中青年創(chuàng)新團隊項目(編號：T201414)；湖北省藥用植物綜合利用工程技術(shù)研究中心項目(編號：GC2015204)

陳黎。E-mail：chenli0201@sina.com