病理性胎兒生長受限的產(chǎn)前診斷研究進(jìn)展

馬瑩 綜述 吳青青 審校

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100026)

病理性胎兒生長受限的產(chǎn)前診斷研究進(jìn)展

馬瑩 綜述 吳青青 審校

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100026)

胎兒生長受限為產(chǎn)科高危妊娠，病因復(fù)雜，表現(xiàn)為胎兒生長發(fā)育緩慢，可伴有或不伴有胎兒畸形及胎兒窘迫，其實質(zhì)是胎兒未達(dá)到其應(yīng)發(fā)育的全部潛能，發(fā)生胎兒生長受限的一部分病因與遺傳物質(zhì)異常相關(guān)，由于遺傳物質(zhì)異常導(dǎo)致的胎兒生長受限，往往發(fā)生孕周時間較早，生后還會面臨體格和智能方面的發(fā)育異?；蜻t緩，并且尚無有效的治療方法，所以評估胎兒是否為病理性生長受限是產(chǎn)前診斷的重點。通過利用細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù)，從染色體核型分析、FISH、各種PCR相關(guān)技術(shù)到染色體微陣列分析技術(shù)，分析胎兒染色體和基因，來預(yù)防嚴(yán)重病理性生長受限患兒的出生。近年來產(chǎn)前診斷技術(shù)不斷成熟，研究逐漸深入。本文就各種遺傳學(xué)技術(shù)方法在此方面的進(jìn)展作為綜述。

胎兒生長受限；產(chǎn)前診斷；核型分析；微陣列分析；單核苷酸多態(tài)性

胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)即因各類原因所致胎兒體質(zhì)量低于同孕齡平均體質(zhì)量第10百分位數(shù)或低于同孕齡平均體質(zhì)量的2個標(biāo)準(zhǔn)差，或孕37周后出生體質(zhì)量小于2 500 g。國內(nèi)外報道FGR的發(fā)生率占所有妊娠的3%～10%，F(xiàn)GR胎兒的死亡率較高，可出現(xiàn)新生兒呼吸窘迫綜合征(NRDS)、低體溫、腦室出血及血糖水平低下等并發(fā)癥，還可能面臨出生后的生長發(fā)育和智力問題，出現(xiàn)較多的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，臨床研究還發(fā)現(xiàn)FGR與部分成人疾病相關(guān)[1-2]。胎兒體重的差異受遺傳因素、母源性疾病和胎盤、臍帶等因素影響，自胚胎期起遺傳因素即開始發(fā)生作用，并在生后的整個生長發(fā)育期繼續(xù)發(fā)揮重要作用。FGR實質(zhì)是胎兒的生長沒有達(dá)到所遺傳的全部潛能，體現(xiàn)在胎兒出生體質(zhì)量低，或伴有胎兒畸形，一部分FGR胎兒與遺傳異常相關(guān)，遺傳異?？砂ㄓ腥旧w的數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變，基因突變，染色體細(xì)微結(jié)構(gòu)的異常即拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNVs)，目前國內(nèi)外欠缺有效治療染色體疾病的方法，因此辨別遺傳異常相關(guān)的病理性FGR，是FGR產(chǎn)前診斷的重點，利用何技術(shù)怎樣尋找其發(fā)病原因，篩查病理性FGR，多年來臨床研究者做了相當(dāng)多的工作，取得了較大的成就，現(xiàn)綜述如下：

1 染色體核型分析及FISH

染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異?？梢餏GR和兒童生長發(fā)育滯后。染色體核型分析技術(shù)是利用染料處理標(biāo)本后染色體顯帶的特點，肉眼在顯微鏡下觀察染色體形態(tài)和數(shù)目結(jié)構(gòu)，分辨率低，可檢測到大片段約5 Mb以上的遺傳物質(zhì)改變。1992年報道研究了60名身材矮小女性(n= 60)的染色體核型分析，結(jié)果為45，X(n=22)，46，XX/46, Xi(Xq)(n=4)，46,XX/46,XXq-(n=3)……46,XX(n=11)，而且相關(guān)性研究顯示患者臨床表型的嚴(yán)重程度與X染色體數(shù)目相關(guān)，證實了部分女性的身體發(fā)育與X染色體異常相關(guān)[3]。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)是分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合，使用熒光素標(biāo)記探針，與分裂中期的染色體或分裂間期的染色質(zhì)進(jìn)行雜交，在熒光顯微鏡下檢查并定位、定性得出結(jié)果。相較染色體核型分析，F(xiàn)ISH具有獨特的優(yōu)勢，耗時短，檢測靈敏度高，而且可用于外周血細(xì)胞、臍血、未經(jīng)培養(yǎng)的間期細(xì)胞染色檢查，在制備特定的探針后甚至可以篩查染色體微缺失綜合征，可進(jìn)行產(chǎn)前診斷及胚胎植入前診斷[4]，但FISH技術(shù)不能檢測全染色體范圍的異常，局限性較大。

2011年姚妍怡等[5]報道對于74例FGR，染色體核型分析出染色體異常為9.4%(8/74)，8例異常染色體核型包括數(shù)目異常6例及結(jié)構(gòu)異常2例，平衡易位1例，倒位1例，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)均稱型FGR組染色體異常核型檢出率高于非均稱型FGR組，合并胎兒畸形的均稱型FGR染色體異常率高達(dá)36.3%(4/11)，未合并胎兒畸形的均稱型FGR染色體異常率僅為5.0% (1/20)，說明染色體異常是均稱型FGR的病因之一，合并胎兒畸形的均稱型FGR染色體異常率高于不合并胎兒畸形的均稱型FGR。鐘進(jìn)等[6]采用染色體核型分析技術(shù)對20例FGR進(jìn)行核型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常1例，該例患者孕38周時超聲提示胎兒雙頂徑相當(dāng)于孕31周，股骨長相當(dāng)于孕35周，臍血染色體核型顯示45,XN,rob(14:15)(q10:q10)，診斷胎兒為病理性FGR。2014年國外報道回顧調(diào)查2008-2012年孕14～27周超聲提示腹圍小于第五百分位的單胎FGR 239例，37例(15%)胎兒有異常的染色體核型或明確的異常綜合征，67例(28%)胎兒有至少一個相關(guān)的結(jié)構(gòu)異常而沒有染色體非整倍體異常和綜合征[7]，說明染色體異常是發(fā)生FGR的病因之一，超聲測量發(fā)現(xiàn)胎兒小于相應(yīng)孕周后應(yīng)詳細(xì)篩查是否同時存在胎兒解剖結(jié)構(gòu)異常，產(chǎn)科醫(yī)生需要對FGR胎兒加以重視和考慮進(jìn)行產(chǎn)前診斷。但是染色體核型分析技術(shù)有諸多限制，如細(xì)胞培養(yǎng)的耗時長、有失敗率以及分辨率較低等。

2 微陣列-比較基因組雜交

染色體微缺失綜合征指亞顯微結(jié)構(gòu)的小片段染色體缺失所造成的臨床癥候群，缺失區(qū)域有時可以包含一個或多個基因，一種新的產(chǎn)前診斷和先天性疾病診斷技術(shù)，稱為微陣列-比較基因組雜交(array comparative genomic hybridization，aCGH)，此技術(shù)為采用不同熒光標(biāo)記的待測DNA和參照DNA雜交，雜交后的基因芯片被掃描，通過比較兩種熒光強度的比率，在全基因組范圍內(nèi)檢測是否存在片段缺失或擴(kuò)增，稱為拷貝數(shù)變異(CNVs)。CNVs是指通過與參考基因組序列相比較存在的染色體結(jié)構(gòu)差異，包含微缺失或微重復(fù)，發(fā)生在基因組區(qū)域的CNVs可引起表型異?；蜻z傳疾病或增加疾病易感性[8]。但是研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類即使是不同的人群中基因組中出現(xiàn)CNVs是很常見的。分析CNVs包括三種情況，一為致病性，二為多態(tài)性即良性，三為未知性即臨床意義尚不明確。通過檢查CNVs染色體區(qū)域所包含的基因、查找權(quán)威CNVs數(shù)據(jù)庫和分析胎兒父母的染色體可以幫助分析其意義。當(dāng)胎兒的CNVs與表型正常胎兒父母的染色體CNVs相一致，或通過檢索數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)同樣的CNVs存在于正常人群時，這些CNVs很可能是良性，其與胎兒的生長發(fā)育異常及胎兒畸形無關(guān)。對于存在未知性或新突變的CNVs，需要對此類胎兒進(jìn)行全面的超聲結(jié)構(gòu)篩查以及出生后追蹤生長發(fā)育情況，這些步驟是臨床診斷或產(chǎn)前診斷基因組病的重要環(huán)節(jié)。由于aCGH具有明顯優(yōu)勢，2013年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會發(fā)布了關(guān)于染色體微陣列分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷中應(yīng)用的581號指南，提示當(dāng)超聲發(fā)現(xiàn)胎兒有一個或多個解剖結(jié)構(gòu)異常時，臨床醫(yī)生考慮可對胎兒母親行介入性產(chǎn)前診斷，建議使用染色體微陣列分析技術(shù)，可取代傳統(tǒng)的染色體核型分析，而對超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)正常的孕婦進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷時，可使用染色體核型分析或染色體微陣列分析[9]。2011年國內(nèi)已經(jīng)有報道利用aCGH技術(shù)分析15 767例合并各種發(fā)育遲緩、智力障礙和畸形等的異常兒童，其中73%的患兒為智力低下和/或發(fā)育遲緩及自閉癥，與8 329名健康成人對照比較，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重癥狀的患兒出現(xiàn)大片段的CNVs的發(fā)病率增加，明顯多于對照組，而且CNVs片段越大病癥越嚴(yán)重[10]。

3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相關(guān)技術(shù)

熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative fluorescent polymerase chain reaction，QF-PCR)技術(shù)利用熒光引物對染色體上特異的短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem report，STR)位點進(jìn)行擴(kuò)增，通過檢測熒光來判斷染色體數(shù)目，具有操作簡單、耗時短、高效和成本低廉的優(yōu)點。紀(jì)妍等[11]使用染色體核型分析及QF-PCR兩種方法對羊水或臍血進(jìn)行染色體分析，納入研究1 035例，結(jié)果兩種方法均能檢測出18例染色體非整倍體數(shù)目異常，符合率為100%，其認(rèn)為可將QF-PCR作為產(chǎn)前診斷染色體核型分析的補充檢查方法。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)于2002年首先被報道，是近年來發(fā)展的對待檢DNA序列可以進(jìn)行定性和半定量分析的技術(shù)，包括雜交、連接和PCR擴(kuò)增。該技術(shù)結(jié)合了DNA探針雜交和PCR技術(shù)，在一次反應(yīng)中可以檢測45個核苷酸序列拷貝數(shù)的改變，但是不能用于單個細(xì)胞的檢測，不適合檢測未知的點突變類型和不能檢測染色體平衡易位。2014年來自哥倫比亞地區(qū)的研究顯示利用MLPA技術(shù)研究了患先天性矮小癥患者的DNA，發(fā)現(xiàn)8.1%的患者存在有X染色體或Y染色體短臂上控制生長的基因即身材矮小同源盒基因(short stature homeobox，SHOX)的異常，包括基因內(nèi)和非編碼區(qū)的插入或缺失變異，而且報道一例患者攜帶有此基因非編碼區(qū)的微重復(fù)和內(nèi)含子6 bp的缺失[12]。

4 單核苷酸多態(tài)性芯片

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指由于單個核苷酸改變而導(dǎo)致基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，作為不同個體在某一特定位置上的核苷酸差異，它占全部己知多態(tài)性的90%以上并且可以遺傳。SNP既有可能在基因以外的非編碼序列上，也可能在基因序列內(nèi)，是以有些SNP會影響基因的功能，一部分遺傳性疾病和腫瘤都與基因序列中的核苷酸突變密切相關(guān)。與aCGH類似，以單核苷酸多態(tài)性芯片(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)為平臺的染色體微陣列技術(shù)(chromosome microarray analysis，CMA)可對染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行診斷定位，并能準(zhǔn)確地測定其大小。SNP-array的原理是將大量SNP位點序列采用特殊方法固定在硅芯片上，獲得高密度的SNP微陣列，然后與樣品雜交，通過激光掃描及軟件分析獲得結(jié)果[13]。有報道使用Affymetrix SNP 6芯片發(fā)現(xiàn)了8例(19.5%)原始侏儒癥或類似表現(xiàn)的兒童存在范圍為672～9.158 Mb的CNVs，5例檢測到的CNVs的致病性仍不清楚，但是作者建議SNP芯片技術(shù)可作為此類患者的遺傳學(xué)診斷方法[14]。

白小藝等[15]2015年對比312例血清學(xué)唐氏篩查高風(fēng)險孕婦羊水的染色體核型分析與SNP-array兩種產(chǎn)前診斷技術(shù)結(jié)果，兩種方法均識別出2例21三體，開展對CNVs的分析有利于進(jìn)一步研究人類基因組及SNP的多態(tài)性情況。付春云等[16]利用SNP-array檢測56例生長障礙患兒的外周血，發(fā)現(xiàn)性染色體上存在致病性CNVs者6例，常染色體上存在致病性CNVs者6例，異常片段＜2.5 MB的即染色體核型分析無法檢出的致病性微缺失或微重復(fù)者4例，認(rèn)為SNP-array技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)的染色體核型分析，可作為遺傳學(xué)診斷的有效方法。常亮等[17]對照分析SNP array與染色體核型分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合分析檢出率(12.1%)高于單純SNP array檢出率(11.3%)，遠(yuǎn)高于單純?nèi)旧w核型分析檢出率(6.4%)。2014年通過比較多代同堂的高海拔居民(安第斯人)與歐洲移民發(fā)生的FGR，檢測了與嬰兒出生體重相關(guān)的63個單核苷酸多態(tài)性，利用SNP技術(shù)確定了與出生體重相關(guān)的參與氧傳感和血管控制的兩基因PRKAA1和EDNRA[18]。

由于SNP-array的優(yōu)勢，國外已經(jīng)利用SNP-array技術(shù)研究基因識別等領(lǐng)域，但是SNP-array技術(shù)也有自身的局限性，就是不能檢測是否存在染色體平衡易位，而染色體核型分析可以檢出染色體平衡易位。2012年有報道對一例妊娠合并FGR、胎足畸形、腦室擴(kuò)張及羊水過多的病例進(jìn)行了產(chǎn)前診斷，發(fā)現(xiàn)此病例為一個獨特的、涉及2、5和7號染色體復(fù)雜的從頭重排和2號染色體長臂的多個微缺失，產(chǎn)前診斷為首例2q32微缺失綜合征，作者為了全面分析該病例的染色體使用了多個診斷技術(shù)，包括染色體核型分析、FISH、aCGH和SNP-array[19]。因此分析復(fù)雜的染色體異常時醫(yī)學(xué)研究者需要依靠多個遺傳學(xué)技術(shù)才能明確其核型及病理類型。

綜上所述，需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷明確是否為病理性FGR時，目前國內(nèi)的主要手段是采集羊水或臍帶血進(jìn)行染色體核型分析和/或FISH檢查，只能檢測出一些大片段的遺傳物質(zhì)異常，會漏診細(xì)微結(jié)構(gòu)異常和致病性CNVs的胎兒?？焖?、準(zhǔn)確如aCGH和SNP-array技術(shù)在我國的產(chǎn)科研究中還處于起步和探索階段，臨床研究人員應(yīng)重視利用先進(jìn)技術(shù)提高產(chǎn)前診斷的水平，避免病理性FGR患兒的出生，提高現(xiàn)有的遺傳病檢出率。

[1]Kady S,Gardosi J.Perinatal mortality and fetal growth restriction[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynecol,2004,18(3):397-410.

[2]Jacobsson B,Ahlin K,Francis A,et al.Cerebral palsy and restricted growth status at birth:population based case-control study[J]. BJOG,2008,115(10):1250-1255.

[3]Temtamy SA,Ghali I,Salam MA,et al.Karyotype/phenotype correlation in females with short stature[J].Clin Genet,1992,41(3): 147-151.

[4]黃艷儀,孫筱放,黎青,等.應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)診斷羊水細(xì)胞染色體異常[J].中華婦產(chǎn)科雜志,1999,34(3):153-156.

[5]姚妍怡,宋婕萍,郭淮,等.74例胎兒生長受限臍血染色體核型分析[J].中國婦幼保健,2011,26(6):884-885.

[6]鐘進(jìn),郭曉玲,史淑瓊.732例孕中晚期胎兒臍血染色體核型分析[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2013,21(7):38-39.

[7]Vanlieferinghen S,Bernard JP,Salomon LJ,et al.Second trimester growth restriction and underlying fetal anomalies[J].Gynecol Obstet Fertil,2014,42(9):567-571.

[8]Lee C,Scherer SW.The clinical context of copy number variation in the human genome[J].Expert Rev Mol Med,2010,12:e8.

[9]ACOG.Committee Opinion No.581:The use of chromosomal microarray analysis in prenatal diagnosis[J].Obstet Gynecol,2013,122 (6):1374-1377.

[10]Cooper GM,Coe BP,Girirajan S,et al.A copy number variation morbidity map of developmental delay[J].Nat Genet,2011,43(9): 838-846.

[11]紀(jì)妍,朱津,盧燕.QF-PCR快速產(chǎn)前診斷常見非整倍體病的價值[J].海南醫(yī)學(xué),2016,27(1):56-59.

[12]Sandoval GT,Jaimes GC,Barrios MC,et al.SHOX gene and conserved noncoding element deletions/duplications in Colombian patients with idiopathic short stature[J].Mol Genet Genomic Med, 2014,2(2):95-102.

[13]Peiffer DA,Le JM,Steemers FJ,et al.High-resolution genomic profiling of chromosomal aberrations using infinium whole-genome genotyping[J].Genome Res,2006,16(9):1136-1148.

[14]Spengler S,Begemann M,Ortiz Brüchle N,et al.Molecular karyotyping as a relevant diagnostic tool in children growth retardation with Silver-Russell features[J].J Pediatr,2012,161(5):933-942.

[15]白小藝,章鈞,田琪,等.單核苷酸多態(tài)性芯片與染色體核型分析在唐氏篩查高風(fēng)險孕婦產(chǎn)前診斷中的比較研究[J].中國病理生理雜志,2015,31(4):707-712.

[16]付春云，陳少科,陳榮譽,等.56例生長障礙患兒單核苷酸多態(tài)性基因芯片檢測結(jié)果分析[J].臨床兒科雜志,2014,32(12):1119-1121.

[17]常亮,趙楠,魏媛,等.單核苷酸多態(tài)性微陣列與染色體核型分析的產(chǎn)前診斷意義比較[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2014,46(5):676-680.

[18]Bigham AW,Julian CG,Wilson MJ,et al.Maternal PRKAA1 and EDNRA genotypes are associated with birth weight,and PRKAA1 with uterine artery diameter and metabolic homeostasis at high altitude[J].Physiol Genomics,2014,46(18):687-697.

[19]Thorson HL,Surti U,Sathanoori M,et al.Prenatal diagnosis of 2q32 deletion syndrome characterized by multiple segmental deletions and complex chromosomal rearrangement involving chromosomes 2,5 and 7[J].Fetal-Diagn Ther,2012,31(3):196-200.

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1003—6350(2016）22—3729—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.22.039

2016-01-16)

吳青青。E-mail：wuqq2013@163.com