不同病因慢性肝病患者肝組織中IL-10的表達及意義

吳鴻雁，黃　睿，熊亞莉，陳　錦，孫珍花，王貴陽，吳　超

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·論著·

不同病因慢性肝病患者肝組織中IL-10的表達及意義

吳鴻雁1，黃睿2，熊亞莉2，陳錦1，孫珍花2，王貴陽2，吳超2

210008江蘇南京，南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院,1. 病理科,2. 感染科

[摘要]目的探討不同病因的慢性肝病(CLD)患者肝組織中白細胞介素-10(IL-10)的表達及其與肝組織炎癥和纖維化的關(guān)系。方法收集93例CLD患者及23例正常對照肝組織石蠟標本，免疫組織化學方法檢測肝組織中IL-10的表達。結(jié)果不同病因的CLD患者肝組織中肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達均較正常對照明顯增高(P<0.01)。隨著肝臟炎癥分級(G)的增高，CLD患者肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達逐漸增強，差異有統(tǒng)計學意義。隨著肝臟纖維化程度分期(S)的增高，CLD患者肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達亦逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論IL-10可能參與CLD患者肝臟的炎癥和纖維化的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]慢性肝??；白細胞介素-10；炎癥；肝纖維化

慢性肝病(chronic liver diseases, CLD)包括病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病等，?？蛇M展為肝纖維化、肝硬化、肝癌，甚至死亡，嚴重影響健康。研究證實，免疫系統(tǒng)在介導CLD的肝損傷及纖維化中發(fā)揮重要的作用[1]。白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)是T淋巴細胞、活化的巨噬細胞、輔助性T 淋巴細胞2(Th2)等分泌的重要抗炎細胞因子。但其是否參與CLD患者肝組織炎癥和纖維化的發(fā)生尚不完全清楚。本研究擬檢測不同病因CLD患者肝組織中IL-10的表達，探討各種CLD患者肝組織的IL-10表達與其肝組織炎癥和纖維化的關(guān)系。

1對象與方法

1.1病例選擇研究對象為2008年5月-2013年12月在南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院接受肝穿刺活檢或者肝臟手術(shù)的CLD患者肝組織石蠟標本。共入組93例CLD患者，其中男49例，女44例，中位年齡48(21～70)歲。其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)65例，原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)7例，自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)14例，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)7例，同時納入23例肝移植的供肝標本作為正常對照(healthy control, HC)。

1.2納入標準患者年齡大于18歲，性別不限。所有患者均在我院明確診斷為CLD，其中CHB診斷符合中華醫(yī)學會肝病學分會和中華醫(yī)學會感染病學分會制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》的診斷標準[2]。ALD及AIH、PBC的診斷標準分別符合中華醫(yī)學會肝病學分學的《酒精性肝病診療指南》[3]和中華醫(yī)學會風濕病學分會的《自身免疫性肝病診斷和治療指南》[4]。

1.3CLD患者肝組織炎癥分級和纖維化分期CLD患者肝組織石蠟標本進行切片，常規(guī)HE染色，根據(jù)CLD患者肝組織HE染色結(jié)果，由南京鼓樓醫(yī)院病理科有經(jīng)驗的醫(yī)師參照Scheuer提出的標準對CLD患者肝組織進行炎癥分級和纖維化分期[5]。

1.4IL-10表達的檢測采用Envision 免疫組化法檢測CLD患者肝組織中IL-10的表達部位及水平。將肝組織蠟塊切片，常規(guī)脫蠟至水，滴加3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，將切片置于EDTA(pH9.0)中行高壓熱修復，自然冷卻，PBS沖洗2次，滴加抗IL-10抗體(美國Abcam公司)，4 ℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗2次，滴加二抗(美國Invitrogen公司)后室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精復染、脫水、透明、封固。

1.5結(jié)果判讀標準由南京鼓樓醫(yī)院病理科有經(jīng)驗的醫(yī)師盲法對CLD患者肝組織中肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達分別進行評分，采用染色強度乘以陽性細胞數(shù)量的方法綜合評分法，陽性數(shù)量評分：< 5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；著色強度評分：無著色為0分，淺黃著色為1分，黃色為2分，棕黃著色為3分。兩者相乘即為該樣本的IL-10得分[6]。

2結(jié)果

2.1不同病因CLD患者肝組織IL-10表達對不同病因所致CLD患者肝組織內(nèi)IL-10的表達進行免疫組織化學檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對照肝組織中僅有少量的IL-10的表達，而CLD患者肝組織中肝小葉及匯管區(qū)均有大量的IL-10的表達(圖1)。統(tǒng)計分析表明，CLD患者肝組織中肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達均較正常對照明顯增高(P<0.001，圖2)。對不同病因的CLD患者肝組織中IL-10的表達進行比較，發(fā)現(xiàn)CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10表達均較正常對照肝組織明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而不同病因的CLD患者IL-10表達無明顯的統(tǒng)計學差異(P>0.05，圖3)。

2.2CLD患者肝組織中IL-10表達與肝組織炎癥和纖維化的關(guān)系為分析IL-10表達與CLD患者肝組織炎癥和纖維化程度的關(guān)系，對不同炎癥分級(G)和纖維化分期(S)的CLD患者肝組織內(nèi)IL-10表達進行了分析。如圖4所示，不論肝小葉或是匯管區(qū)，隨著G分級的增高，CLD患者肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達逐漸增高，差異有統(tǒng)計學意義。G4期的患者IL-10評分略低于G3期，考慮與G4期患者樣本較少有關(guān)。隨著S分期的增高，CLD患者肝組織肝組織內(nèi)肝小葉及匯管區(qū)IL-10的表達亦呈逐漸增高的趨勢(圖5)。

3討論

IL-10是最早由Mosmann等發(fā)現(xiàn)的由T淋巴細胞、活化的巨噬細胞、Th2等細胞產(chǎn)生的重要免疫抑制因子[7]。IL-10有廣泛的免疫抑制活性，可抑制T細胞增殖、抑制抗原提呈，抑制巨噬細胞活化等[7]，能夠限制過度的免疫反應對組織器官造成的損害[8]。

在肝臟中許多細胞都能分泌IL-10，包括肝細胞、Kupffer細胞、竇內(nèi)皮細胞、肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)以及淋巴細胞等[9-10]。既往的動物實驗及臨床數(shù)據(jù)表明，IL-10可能參與肝損傷和纖維化的發(fā)生。Poovorawan等[11]研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性的CHB患者血清中IL-10的水平與其肝組織炎癥壞死程度及纖維化程度呈明顯的正相關(guān)。Lian等[12]研究也發(fā)現(xiàn)CHB患者血清IL-10水平較正常對照明顯增高，且與患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amiotransferase, ALT)水平呈明顯的正相關(guān)，提示IL-10參與CHB患者肝損傷。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭患者血清IL-10明顯增高，且與血清ALT正相關(guān)。對于IL-10在CLD患者肝組織中的表達情況及其與肝組織炎癥程度和纖維化程度的關(guān)系報道較少。本研究對不同病因的CLD患者肝組織中IL-10表達檢測，發(fā)現(xiàn)不同病因的CLD患者肝組織中IL-10表達較正常對照明顯增高。CLD患者肝組織中IL-10表達與肝組織炎癥及纖維化程度均呈明顯的正相關(guān)，提示IL-10參與CLD患者的肝組織炎癥和纖維化。

CLD患者肝組織中IL-10增高的原因尚不完全清楚。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導的肝損傷和肝纖維化小鼠肝組織中IL-10的表達明顯增高，提示IL-10參與肝損傷及肝纖維化的發(fā)生[14]。然而IL-10缺陷的小鼠CCl4誘導的肝損傷及纖維化的程度卻較野生型明顯嚴重[15-16]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)給予外源性IL-10能夠明顯減輕CCl4誘導的大鼠肝組織炎癥程度和肝纖維化程度[17]，同時能減輕肝星狀細胞的活化，促進活化的肝星狀細胞凋亡[18]。因此，推測CLD患者肝組織中IL-10的增高，可能是機體為了限制過強的免疫導致的肝組織炎癥和纖維化的發(fā)生。

總之，本研究提示IL-10參與CLD患者的肝臟炎癥和纖維化，但其肝組織中IL-10具體來源及調(diào)控機制尚不完全明確[19-20]。因此，進一步明確IL-10在CLD肝組織中的來源及其具體的調(diào)控機制，將有利于明確CLD的發(fā)病機制，從而尋找有效的治療CLD的新方法。

【參考文獻】

[1]Hernandez-Gea V, Friedman SL. Pathogenesis of liver fibrosis[J]. Annu Rev Pathol, 2011, 6: 425-456.

[2]中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版) [J]. 中國病毒病雜志, 2011, 19(1): 9-23.

[3]中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組. 酒精性肝病診療指南(2010年修訂版) [J]. 中華肝臟病雜志, 2010, 18(3): 167-170.

[4]中華醫(yī)學會風濕病學分會. 自身免疫性肝病診斷和治療指南[J]. 中華風濕病學雜志, 2011, 15(8): 556-558.

[5]Scheuer PJ. Classification of chronic viral hepatitis: a need for reassessment[J]. J Hepatol, 1991, 13(3): 372-374.

[6]Weng HL, Liu Y, Chen JL, et al. The etiology of liver damage imparts cytokines transforming growth factor beta1 or interleukin-13 as driving forces in fibrogenesis[J]. Hepatology, 2009, 50(1): 230-243.

[7]Mosser DM, Zhang X. Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine[J]. Immunol Rev, 2008, 226(1): 205-218.

[8]Bliss SK, Alcaraz A, Appleton JA. IL-10 prevents liver necrosis during murine infection with Trichinella spiralis[J]. J Immunol, 2003, 171(6): 3142-3147.

[9]Wan S, LeClerc JL, Schmartz D, et al. Hepatic release of interleukin-10 during cardiopulmonary bypass in steroid-pretreated patients[J]. Am Heart J, 1997, 133(3): 335-339.

[10]Hammerich L, Tacke F. Interleukins in chronic liver disease: lessons learned from experimental mouse models[J]. Clin Exp Gastroenterol, 2014, 7: 297-306.

[11]Poovorawan K,Tangkijvanich P,Chirathaworn C,et al.Circulating cytokines and histological liver damage in chronic hepatitis B infection[J].Hepat Res Treat,2013,2013:757246.

[12]Lian JQ,Yang XF,Zhao RR,et al.Expression profiles of circulating cytokines,chemokines and immune cells in patients with hepatitis B virus infection[J].Hepat Mon,2014,14(6):18892.

[13]Wang K, Wu ZB, Ye YN, et al. Plasma Interleukin-10: A likely predictive marker for hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure[J]. Hepat Mon, 2014, 14(7): e19370.

[14]Takekoshi S, Kitatani K, Yamamoto Y. Roles ofoxidized diacylglycerol for carbon tetrachloride-induced liver injury and fibrosis in mouse[J]. Acta Histochem Cytochem, 2014, 47(5): 185-194.

[15]Thompson K, Maltby J, Fallowfield J, et al. Interleukin-10 expression and function in experimental murine liver inflammation and fibrosis[J]. Hepatology, 1998, 28(6): 1597-1606.

[16]Louis H, Van Laethem JL, Wu W, et al. Interleukin-10 controls neutrophilic infiltration, hepatocyte proliferation, and liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in mice[J]. Hepatology, 1998, 28(6): 1607-1615.

[17]Huang YH,Shi MN, Zheng WD, et al. Therapeutic effect of interleukin-10 on CCl4-induced hepatic fibrosis in rats[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(9): 1386-1391.

[18]Zhang LJ, Zheng WD,Shi MN, et al. Effects of interleukin-10 on activation and apoptosis of hepatic stellate cells in fibrotic rat liver[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(12): 1918-1923.

[19]劉濱菘，李強.脂肪及細胞因子與非酒精性脂肪性肝病關(guān)系的研究進展[J]. 醫(yī)學研究生學報，2013，26(11):1211-1214.

[20]周岳進. 妊娠期婦女慢性乙型肝炎患者核苷(酸)類似物抗病毒治療[J]. 東南國防醫(yī)藥，2013，15(3):279-281.

(本文編輯：齊名；英文編輯：王建東)

Expression of interleukin-10 in the liver tissues of patients with chronic liver diseases of different etiologies

WU Hong-yan1, HUANG Rui2, XIONG Ya-li2,CHENJin1,SUNZhen-hua2,WANGGui-yang2,WUChao2.

1.DepartmentofPathology, 2.DepartmentofInfectiousDiseases,NanjingDrumTowerHospital,NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing,Jiangsu210008,China

[Key words]chronic liver disease; interleukin-10; inflammation; liver fibrosis

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression of interleukin-10 (IL-10) in the liver tissues of patients with chronic liver diseases (CLD) and determine its association with liver inflammation and liver fibrosis. MethodsA total of 93 patients with different types of CLD were enrolled in our study. Twenty-three normal liver tissues were included as control. The expression of IL-10 was determined by immunohistochemistry in the formalin-fixed, paraffin-embedded liver tissues of CLD patients and healthy controls. ResultsThe expression of IL-10 was significantly increased in both hepatic lobule and portal area of liver tissues of CLD patients with different etiologies as compared with normal controls (P<0.01). CLD patients with high inflammation grades (G) had higher IL-10 expression in hepatic lobule and portal area of liver tissues compared to those with lower grades. Significantly higher IL-10 expression was found in hepatic lobule and portal area of liver tissues of CLD patients with high fibrotic stages (S) compared to those with lower stages. ConclusionIL-10 may play a pathological role in chronic liver inflammation and fibrosis in CLD.

基金項目：南京市醫(yī)學科技發(fā)展項目(YKK13065)

通訊作者：熊亞莉，E-mail: yaya-mei@sohu.com

[中圖分類號]R575

[文獻標志碼]A

doi：10.3969/j.issn.1672-271X.2016.02.004

(收稿日期：2015-07-10;修回日期：2015-10-19)

引用格式：吳鴻雁，黃睿，熊亞莉,等.不同病因慢性肝病患者肝組織中IL-10的表達及意義[J].東南國防醫(yī)藥，2016,18(2):122-124,141.